★吳雙雙 羅曉健 何明珍 張堯 熊靜（1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004；.江西本草天工科技有限責(zé)任公司 南昌 330006；3.江中藥業(yè)股份有限公司 南昌 330096）

穿心蓮內(nèi)酯（andrographolide，ADG）是爵床科草本植物穿心蓮主要有效成分，為二萜內(nèi)酯類化合物，具有解熱、消炎、止痛等功效，對(duì)細(xì)菌、病毒引起的上呼吸道感染有一定療效，被譽(yù)為“天然抗生素”［1］；同時(shí)還能抑制各種惡性腫瘤，包括乳腺、肝、頸、結(jié)腸和胃癌的細(xì)胞系，以及臨床前研究中的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［2-3］。ADG呈無色方形或長方形結(jié)晶；味極苦，在水中幾乎不溶，口服吸收差，生物利用度低［4］，限制了其臨床的應(yīng)用。近年來，ADG溶出差、生物利用度低等問題得到眾多藥學(xué)工作者的關(guān)注，如趙國巍等采用溶劑蒸發(fā)法制備了不同藥物-輔料質(zhì)量比的ADG-聚乙二醇固體分散體，能有效提高難溶性藥物ADG的溶出率［5］；任科等使用冷凍干燥法制備ADG-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物，使ADG在水中的溶解度可達(dá)到注射劑的要求［6］；Hong Du等人以肉豆蔻酸異相丙酯為油相，吐溫80為表面活性劑，醇為助表面活性劑和水制備了ADG微乳制劑，與ADG片劑相比，ADG微乳具有更好的抗炎作用和更高的生物利用度［7］。本實(shí)驗(yàn)前期，將ADG與糊精研磨、混合，采用噴霧干燥技術(shù)制備ADG細(xì)粉，發(fā)現(xiàn)糊精能夠顯著提高ADG溶出度，但還未對(duì)ADG噴干粉的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行探索研究。因此，本實(shí)驗(yàn)建立了LC-MS/MS 方法測定ADG噴干粉給藥后大鼠體內(nèi)血藥濃度，為ADG處方工藝的進(jìn)一步研究與開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Nexera X2 LC-30A超高效液相色譜儀，包含在線脫氣機(jī)、高壓二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱（Shimadzu，日本）；QTRAP 4500復(fù)合三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜，配備ESI離子源及Analyst 1.6數(shù)據(jù)處理軟件（AB SCIEX，美國）；KQ-4000B型超聲清洗機(jī)（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；HC-3018R型高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；旋渦混勻器（杭州奧盛儀器有限公司）；MiLLipore-SimpLicity超純水處理系統(tǒng)（默克密理博，德國）；AL104分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；CM2000研磨機(jī)（上海依肯機(jī)械設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥 ADG原料（江西青峰醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，批號(hào)：20160806）；ADG對(duì)照品（批號(hào)110797-201609，中國食品藥品檢定研究院）；己烯雌酚（批號(hào)100033-201308，中國食品藥品檢定研究院）；肝素鈉注射液（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司）；乙腈（美國Fisher Scientific，公司色譜純）；純凈水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；甲醇（Anaquur chemicals，色譜純），糊精（張家港浩波化學(xué)品有限公司，藥用級(jí)）等。

1.3 動(dòng)物 SD大鼠，雄性，SPF級(jí)，體重（220±20g）左右，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 ADG噴干粉的制備

2.2.1 ADG糊精噴干粉 分別稱取糊精、ADG各50g，混合均勻，投入以200mL純化水為介質(zhì)的膠體磨中，固定研磨機(jī)工藝參數(shù)：研磨頻率40Hz，研磨時(shí)間30min。將混合溶液進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥條件：進(jìn)風(fēng)溫度140℃，空氣壓縮比100%，霧化器壓力柱高40～50，流速8mL/min。噴霧干燥完成后，收集樣品噴干粉，干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 ADG原料噴干粉 稱取100g 的ADG原料藥適量，按“2.2.1”項(xiàng)固定研磨機(jī)及噴霧干燥工藝參數(shù)。噴霧干燥完成后，收集樣品噴干粉，置干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 體內(nèi)分析方法的建立2.2.1 溶液配制 對(duì)照品溶液：精密稱取對(duì)照品適量，加甲醇溶解稀釋成1mg/mL的儲(chǔ)備液（陰涼保存）；臨用前，用甲醇定量稀釋成所需對(duì)照品濃度。

內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取己烯雌酚對(duì)照品適量，加甲醇溶解稀釋成250ng/mL的己烯雌酚溶液作為內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.2 檢測方法的建立 色譜條件：分析柱Waters CORTECS C18柱（4.6mm×100mm，2.7μm）；流速0.5mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量2μL；流動(dòng)相B相乙腈，A相水；梯度洗脫，結(jié)果見表1。

質(zhì)譜條件：ESI電噴霧離子源，負(fù)離子檢測；離子源溫度600℃；離子噴霧電壓-4500V；氣簾氣氣壓30psi；霧化氣氣壓50psi；輔助氣氣壓50psi；氣簾氣、霧化氣、輔助氣均為氮?dú)?。掃描模式：多反?yīng)離子監(jiān)測（MRM）。反應(yīng)離子對(duì)：ADGm/z 395.0→331.4（去簇電壓DP：-73v；碰撞能量CE：-16ev）；己烯雌酚（內(nèi)標(biāo)）m/z 267.0→237.0（去簇電壓DP：-99v；碰撞能量CE：-39ev）。

2.3 血漿樣品處理 取大鼠血漿50μL，置1.5mL具塞尖底離心管中，加入250ng/mL己烯雌酚20μL，再加入80μL甲醇沉淀蛋白，渦旋3min，于15000r/min、5℃下高速離心10min。取上清液進(jìn)樣，進(jìn)樣量為2μL，進(jìn)行分析。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.4 方法專屬性考察 分別取50μL大鼠空白血漿、空白血漿加入一定濃度的ADG對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液、大鼠給藥后血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，將三種樣品進(jìn)行HPLC-MS分析，結(jié)果分別見圖1-3。結(jié)果表明，在選定的色譜及質(zhì)譜檢測條件下，內(nèi)標(biāo)和ADG均可實(shí)現(xiàn)完全分離，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)和代謝物不干擾內(nèi)標(biāo)和ADG的測定。

圖1 空白血漿樣品

圖2 空白血漿加ADG和內(nèi)標(biāo)

圖3 大鼠口服噴干粉后血漿樣品

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限 取大鼠空白血漿50μL，置1.5mL 具塞尖底離心管中，加入20μL內(nèi)標(biāo)溶液，再加入適量ADG對(duì)照品配制成含ADG血漿質(zhì)量濃度分別為2、5、10、25、50、100、200ng/mL的樣品。按“2.3”項(xiàng)下的方法處理后進(jìn)行HPLC-MS分析。以樣品中ADG的濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，ADG峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸計(jì)算，得ADG標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0335X+0.0123（r=0.9985）（n=3），表 明 ADG的質(zhì)量濃度在2～200ng/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

最低定量限為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度點(diǎn)，滿足信噪比S/N大于10，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）及相對(duì)誤差（RE）均在標(biāo)示值的15%以內(nèi)。結(jié)果表明本方法在2～200ng/mL范圍內(nèi)線性良好，定量下限為2ng/mL（S/N＞10）。

2.7 提取回收率 取大鼠空白血漿，按“2.5”項(xiàng)下方法，分別制備ADG低、中、高四個(gè)濃度（2、5、100、150ng/mL）的ADG樣品，渦旋離心后，取上清液，進(jìn)樣分析，每種濃度平行6樣本。另取大鼠空白血漿，不加入內(nèi)標(biāo)及待測物標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，揮干后的殘?jiān)屑尤胛醇踊|(zhì)但加內(nèi)標(biāo)的ADG標(biāo)準(zhǔn)液，使其終濃度分別為2、5、100、150ng/mL，渦旋離心后，取上清液，進(jìn)樣分析，每種濃度平行6樣本分析。以每種濃度的兩種不同處理方法分析得到的峰面積比值計(jì)算提取回收率。結(jié)果見表2，經(jīng)測定，該方法ADG低、中、高四個(gè)濃度的提取回收率分別為89.90%、88.67%、95.37%、98.67%，內(nèi)標(biāo)的提取回收率均值為94.55%，均符合相關(guān)規(guī)定，表明四種濃度樣品提取回收率良好。

2.6 基質(zhì)效應(yīng) 取空白血漿，按“2.3”方法進(jìn)行處理，揮干后的殘?jiān)尤胛醇踊|(zhì)但加內(nèi)標(biāo)的ADG標(biāo)準(zhǔn)液，使其終濃度分別為2、5、100、150ng/mL，進(jìn)樣，記錄峰面積，得峰面積比值R（A）。另取未加基質(zhì)但加內(nèi)標(biāo)的ADG標(biāo)準(zhǔn)液，使其終濃度為2、5、100、150ng/mL，進(jìn)樣，記錄峰面積，得峰面積比值R（B）。將每組得到的峰面積比值R相比（B/A），計(jì)算ADG在血漿中別的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表2。由表2可知，該方法ADG在2、5、100、150ng/mL四個(gè)濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為112.82%、103.49%、104.11%、95.97%，內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)均值為91.58，均符合相關(guān)規(guī)定，表明不同受試大鼠的血漿基質(zhì)對(duì)ADG的質(zhì)譜信號(hào)無顯著性影響。

表2 ADG血漿樣品的基質(zhì)效應(yīng)（n=6）

表3 ADG血漿樣品的提取回收率（n=6）

2.8 精密度考察 取大鼠空白血漿50μL，按“2.5”項(xiàng)下方法，分別制備ADG四個(gè)濃度（2、5、100、150ng/mL）的ADG樣品，每種濃度平行5份，重復(fù)3個(gè)分析批，每批隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線。以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的濃度，計(jì)算分析方法的日內(nèi)與日間精密度與準(zhǔn)確度。結(jié)果見表4，四個(gè)濃度下的批內(nèi)和批間RSD及RE均在QC樣品均值的15%以內(nèi)，符合方法學(xué)的相關(guān)要求。

表4 ADG血漿樣品的精密度考察（n=5）

2.9 穩(wěn)定性考察 配制5，100，150ng/mL三種濃度的ADG血漿樣品，每個(gè)濃度平行配制3份，于-40℃條件下反復(fù)凍融3次，按“2.3”項(xiàng)下處理，用當(dāng)天現(xiàn)配血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，結(jié)果見表5，測定結(jié)果表明，ADG血漿樣品于在上述條件下穩(wěn)定，符合相關(guān)規(guī)定。

表5 ADG血漿樣品凍融穩(wěn)定性考察（n=3）

2.10 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 取SD雄性大鼠10只，體重220±20g左右，隨機(jī)分成2組，大鼠給藥前禁食12h，禁食期間自由飲水。分別以16.8mg/kg的劑量對(duì)ADG原料、糊精噴干粉的0.5%CMC-Na混懸液（以大鼠給料體積約2.1mg/mL/只計(jì)算，將樣品溶于20mL的水中溶解）進(jìn)行大鼠灌胃給藥。于給藥后的 5、10、20、45、60、90、120、180、240、360、480、720、1440min從眼眶取血，置于肝素化的EP管內(nèi)，4000r/min，離心10min，移取100μL血漿轉(zhuǎn)入2mL EP管中。樣品按“2.3”項(xiàng)下處理后，渦旋離心后，取上清液2μL，進(jìn)行LC-MS/MS分析。大鼠灌胃ADG噴干粉的血藥濃度見圖2。

圖2 ADG噴干粉的平均血藥濃度-時(shí)間曲線（，n=5）

表6 ADG噴干粉主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（，n=5）

表6 ADG噴干粉主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（，n=5）

參數(shù) ADG噴干粉 ADG糊精噴干粉AUC（0-t）/ng·min·mL-1 22439.09±7299.70 69807±34901.01 t1/2 /min 226.07±57.17 579.00±415.00 Tmax /min 13±6.708 31±20.736 Cmax / ng·mL-1 79.14±5.443 244.2±122.13

采用DAS 3.0軟件進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的擬合，選擇模式為非房室模型給藥，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表6。使用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)以上藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果顯示，ADG噴干粉與ADG 糊精噴干粉的 AUC0-t、AUC（0-inf）、Cmax、Vz/F、CL/F 均發(fā)生了顯著性變化（P＜0.05），其他參數(shù)均無顯著性差異。

3 討論

基于文獻(xiàn)報(bào)道［8-10］ADG的內(nèi)標(biāo)選擇多樣，實(shí)驗(yàn)前期考察了銀杏內(nèi)酯、三七皂苷、己烯雌酚等內(nèi)標(biāo)，預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯、三七皂苷等提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)均有超出范圍，無法滿足分析要求。最終確定選用己烯雌酚為內(nèi)標(biāo)，并建立了ADG的LC-MS/MS含量測定方法，該方法穩(wěn)定、精確、重現(xiàn)性好，可準(zhǔn)確測定大鼠血漿中ADG的濃度。

由圖2顯示，ADG原料、糊精噴干粉在大鼠體內(nèi)均存在雙峰，這和文獻(xiàn)報(bào)道一致［11］，說明大鼠口服ADG噴干粉制劑可能存在肝腸循環(huán)現(xiàn)象。由于ADG藥代動(dòng)力學(xué)主要表現(xiàn)為體內(nèi)吸收快，生物利用度低等特征［12］，ADG原料噴干粉相比于ADG糊精噴干粉的藥-時(shí)曲線雙峰現(xiàn)象不明顯，血藥濃度低、達(dá)峰時(shí)間短。由表6可知，ADG糊精噴干粉比ADG原料噴干粉在大鼠體內(nèi)口服吸收（AUC0-t）（P＜0.05）提高約3倍，可能ADG糊精噴干粉經(jīng)研磨、噴霧干燥等技術(shù)避免ADG在噴霧干燥過程中發(fā)生微粉化聚集現(xiàn)象，有利于ADG細(xì)粉在水中分散，加快其在體外的溶出及體內(nèi)的吸收。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了ADG的LC-MS/MS含量測定方法，該方法靈敏度高，專屬性強(qiáng)，能準(zhǔn)確測定大鼠血漿中ADG的含量。利用膠體磨粉碎結(jié)合噴霧干燥技術(shù)提高ADG的溶出度和生物利用度的研究國內(nèi)尚未見報(bào)道。該制備工藝簡單易行，成本較低，具有潛在的開發(fā)價(jià)值。

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