袁昭弟，余顯權(quán)

(貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

我國(guó)70%人口以稻米為主食，如今，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人民生活水平的提高，老百姓的飲食觀念逐漸由過(guò)去的吃得飽向現(xiàn)在的吃得好轉(zhuǎn)變。伴隨著富貴病(高血壓、高血糖、冠心病和肥胖癥等)也不斷出現(xiàn)，人們的膳食習(xí)慣發(fā)生了翻天覆地的變化。自古以來(lái)，我國(guó)中醫(yī)就提倡藥食同用、醫(yī)藥同源，有色稻不僅含有豐富的營(yíng)養(yǎng)元素(鐵、硒、鋅、鈣等礦質(zhì)元素)，還含有豐富的生物活性物質(zhì)如VE、胡蘿卜素、黃酮、生物堿、強(qiáng)心甙、木酚素、甾醇等[1-3]。因此，常被用于食療來(lái)改善體質(zhì)和預(yù)防各種疾病的發(fā)生。

花色苷是一種分布范圍廣、安全、無(wú)毒副作用的天然色素。從現(xiàn)有的有色稻資源中發(fā)掘花色苷含量高的品種和探究出適應(yīng)于高花色苷含量的色稻生態(tài)點(diǎn)，深入了解其遺傳規(guī)律、合成基因及調(diào)節(jié)基因差異表達(dá)，為稻米色素基因克隆和色稻種質(zhì)資源創(chuàng)新提供參考。

1 花色苷的結(jié)構(gòu)

該色素是由2-苯基-苯并毗喃(phenotyrilium)的產(chǎn)物組成，它的糖苷是由具備C6-C3-C6結(jié)構(gòu)的類(lèi)黃酮花色素苷與糖配體結(jié)合的。

大部分的花色苷的3-，5-，7-碳位上有羥基代替。B環(huán)各碳位上有不同羥基或甲氧基取代，組成了形形色色的花色苷，目前已了解到的種類(lèi)有二十多種，最重要的花色素有天竺葵素(Pelargonidin)、花青素(Cyanidin)、花翠素(Delphinidin)、甲基花青素(peonidin)、3'-甲花翠素(petunidin)及二甲花翠素(Malvidin)等結(jié)構(gòu)?；ㄉ卦谧匀唤缰型ㄟ^(guò)糖苷鍵與一個(gè)或許多葡萄糖、鼠李糖、半乳糖等合成花色苷。該色素的糖苷基與羥基還可以經(jīng)過(guò)酯鍵和一個(gè)或少許分子的對(duì)位香豆酸、阿魏酸、咖啡酸等合成牢固的花色苷[4-5]。

自然界已知的花色苷有22 大類(lèi)[6-7]。食品中重要的有 6 類(lèi)[8]，即矢車(chē)菊色素(cyanindin，Cy)、天竺葵色素(pelargonidin，Pg)、飛燕草色素(delphinidin，Dp)、芍藥色素(peonidin，Pn)、牽牛色素(petunidin，Pt)和錦葵色素(malvidin，Mv)。

徐杰等[9]采用柱層析和紙色譜的方法對(duì)貴州黑糯米稻的花色苷構(gòu)成進(jìn)行了研究，結(jié)果表明其成分為矢車(chē)菊素葡萄糖苷與矢車(chē)菊色素。Ryu等[10]研究 10個(gè)色稻種類(lèi)表明其花色苷最重要的成分為矢車(chē)菊素葡萄糖苷與芍藥色素。蘇金為[11]對(duì)巖黑稻和巖紫糯的花色苷分析表明巖黑稻和巖紫糯花色苷是由矢車(chē)菊苷與矢車(chē)菊色素構(gòu)成。

張晴等[12]運(yùn)用黑米稻花色苷的吸收光譜對(duì)它的成份進(jìn)行檢測(cè)， 結(jié)果表明其成分由牽?；ㄋ靥擒战M成。Ichikawa 等[13]對(duì)紫黑米稻花色苷運(yùn)用毛細(xì)管電泳和聚已烯吡咯烷酮柱層析進(jìn)行分析， 結(jié)果表明該色素為矢車(chē)菊素葡萄糖苷。Cho等[14]研究報(bào)道， 黑米稻品種 Su-won415 的花色苷為矢車(chē)菊花色素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。Giaccherini 等[15]對(duì)黑米稻品種 Venere色素的研究，發(fā)現(xiàn)它是由矢車(chē)菊素葡萄糖苷組成。

Choi等[16]對(duì) 13 份不同色稻品種的花色苷進(jìn)行研究， 結(jié)果表明它是由矢車(chē)菊素糖苷及芍藥色素構(gòu)成。鐘麗玉等[17]對(duì)黑米稻品種全黑粳運(yùn)用紙色譜、紫外可見(jiàn)光掃描及氣相色譜等方法進(jìn)行分析，該色素由矢車(chē)菊素糖苷和芍藥色素等 5 種構(gòu)成。Terahara 等[18]運(yùn)用高效液相色譜(HPLC)方法對(duì)香紅米稻花色苷測(cè)定，該色素的成分為矢車(chē)菊色素及芍藥色素。

2 水稻花色苷含量的影響因素

2.1 遺傳因素對(duì)稻米色素含量的影響

稻谷籽粒的外形結(jié)構(gòu)主要由穎殼與穎果構(gòu)成， 而內(nèi)部結(jié)構(gòu)的穎果由果皮、種皮、胚乳及胚構(gòu)成。張名位等[19]對(duì)黑米剝皮 2 min后檢測(cè)到花色苷含量占糙米色素總量的 6.5/10～7/10。

稻谷籽粒的穎殼和穎果內(nèi)的不同結(jié)構(gòu)所含的花色苷有很大的差異，然而在不同的水稻品種間也有相似的規(guī)律。Koh等[20]對(duì)4類(lèi)不同顏色的色稻品種進(jìn)行花色苷含量檢測(cè)，結(jié)果表明花色苷在褐米稻和紅褐米稻的含量為1.63～17.62 μg/g，在紅米稻的含量為 3.56～11.10 μg/g， 在紫米稻的含量為 28.11～401.22 μg/g，但在黑米稻的含量為3665.98 μg/g。Phoka等[21]測(cè)定結(jié)果表明， 淺黃稻 KDML105 的花色苷含量為 1.25 μg/g， 淺黃稻 BW4 的花色苷含量為 8.07 μg/g，紅黑稻JHN的花色苷含量為594.96 μg/g。張名位等[22]對(duì)5種花色苷含量不同的色稻進(jìn)行分析，檢測(cè)到這些品種的色素含量依次為：龍錦 1 號(hào) >黑豐糯 >秦稻 1 號(hào) >黑粘 110>豐澳粘。張晴等[12]對(duì)黑米稻烏貢和香血糯的花色苷進(jìn)行測(cè)定，含量分別為 842 μg/g和 2844 μg/g。Ryu等[23]對(duì) 591 份不同種類(lèi)的水稻的花色苷含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明該色素含量的變異范圍是 0～4751 μg/g， 則矢車(chē)菊色素為 0～4519 μg/g， 芍藥色素為 0～427 μg/g。

2.2 環(huán)境因素對(duì)水稻色素含量的影響

稻谷的花色苷含量不僅受遺傳控制，而且還受到環(huán)境影響[24]。張名位等[22]研究不同播期對(duì)花色苷含量的影響，結(jié)果表明該色素含量與其抽穗后 30 d 的各種氣候因素有關(guān)， 隨著日均溫及日均光照時(shí)數(shù)的升高累積量下降，而隨著日均相對(duì)濕度的上升而積累量升高。賀浩華等[25]將 5 個(gè)不同黑米稻品種設(shè)置不同的播期，探究在不同的播期下，各種氣候因子對(duì)花色苷積累的影響，得出不同播期種植的品種該色素對(duì)溫度反應(yīng)最為敏感，早期和中期播種的品種所處的溫度比較高，導(dǎo)致高溫逼熟，該色素累積不完全使其含量不高；晚期播種的品種處于溫度適宜的條件下，使穎果沉積色素一致，該色素含量上升。

蔡光澤[26]對(duì)紅米稻赤糯和黑米稻朝紫進(jìn)行研究，結(jié)果表明水稻花色苷含量的高低與溫度變化一致，溫度高有利于紅米稻的色素含量提高， 穎果沉積色素上升，而黑米稻則相反；黑色稻米適宜于冷涼、晝夜溫差大的生態(tài)點(diǎn)栽種，有助于該色素的積累，而紅色稻米適宜于溫度較高、晝夜溫差較小的生態(tài)點(diǎn)栽種，有助于苷色素的沉積。

3 水稻花色苷的生物合成途徑

花色苷是由2-苯基苯并芘與黃烊鹽離子的多羥基及多甲氧基衍生物構(gòu)成的 18 種花色苷的糖苷合成物?；ㄉ帐菢?gòu)成色彩的主要物質(zhì)[27-28]。該色素的沉積大約有20 步生化反應(yīng)，總共有15個(gè)合成基因及2 類(lèi)(myb和myc型)調(diào)節(jié)基因參加[29-31]。它的主要合成過(guò)程如圖 1[32-35]?；ㄉ赵诩t米穎果中的外表面累積，使穎果表明出現(xiàn)不同的顏色。

PAL：苯丙氨酸合成酶；C4H：肉桂酸-4-羥基羧化酶；4CL：對(duì)香豆酰-CoA 連接酶；CHS：查爾酮合成酶；CHI：查爾酮異構(gòu)酶；F3H：黃烷酮-3-羥基化酶；F3′H：類(lèi)黃酮-3′-羥基化酶；F3′5′H：類(lèi)黃酮-3′， 5′-羥基化酶；DFR：二氫黃酮醇還原酶；ANS：花色苷合成酶；3GT： 類(lèi)黃酮葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶

3.1 參與色稻花色苷合成的主要基因

有15個(gè)合成基因及2 類(lèi)(myb 和myc 型)調(diào)節(jié)基因參與該色素合成的生化反應(yīng)。借助于模式植物的研究， PAL、CHS、CHI、F3H、F3′H、F3′5′H、DFR、ANS、UFGT等基因從不同植物中獲得分離。

3.1.1苯丙氨酸合成酶(PAL)基因 苯丙氨酸合成酶(phenylalanine ammonia-lyase， PAL)是參與該色素生化反應(yīng)的第一個(gè)酶，并作為催化劑使L-丙氨酸快速合成反式肉桂酸。Koukol和Conn第一次從綠色植株中發(fā)現(xiàn)了PAL酶及對(duì)它做了最初的純化[36-37]。該基因存在于水稻的第5染色體上，能在水稻的所有部位表達(dá)，其中根和莖中的表達(dá)比其他部位高[38]。有研究表明，PAL的活性能被UV-B所誘導(dǎo)[39-40]。

3.1.2查爾酮合成酶(CHS)基因 在查耳酮合成酶(Chalcone synthase，CHS)催化下，丙二酰的3個(gè)乙酸基及4-香豆酰Co在對(duì)乙酸基合成查耳酮。CHS是花色苷合成途徑中第一個(gè)被分離的基因，最早是從歐芹(Petroseliumcrispum)懸浮細(xì)胞得到[41]。該基因位于水稻第11染色體，被定位于RFLP的RG2和RG103標(biāo)記之間[42]。它在水稻的所有部位均有表達(dá)，其中莖和種子中的表達(dá)量比較高，且花后13 d的種子表迗量顯著高于花后2和7 d的表達(dá)量[43]。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)表明，在花青素的生物合成途徑中，OsCHS同型二聚體以某一特定的方向與OsDFR和OsANS相互作用，共同形成了一個(gè)大分子聚合物[44]

3.1.3查爾酮異構(gòu)酶(CHI)基因 查爾酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase， CHI)催化類(lèi)黃酮合成途徑的第二步反應(yīng)，它將查兒酮異構(gòu)化為黃烷酮(無(wú)色)。該反應(yīng)也可自發(fā)完成，黃烷酮是類(lèi)黃酮合成途徑中第一個(gè)穩(wěn)定的中間產(chǎn)物。這個(gè)基因在不同禾本科植物基因組中的拷貝數(shù)不同，在玉米基因組中有三個(gè)拷貝，但在水稻與大麥基因組中卻只有一個(gè)拷貝[45]。

3.1.4黃烷酮3-羥化酶(F3H)基因 黃烷酮3-羥化酶(F3H)基因最早是從金魚(yú)草(Antirrhinummajus)中克隆得到[46]。F3H基因催化形成的二氫黃酮醇，在細(xì)胞漿中產(chǎn)生后轉(zhuǎn)移到液泡中轉(zhuǎn)化為花色苷[47]。F3H主要參與黃酮醇和花色苷的生物合成，它的表達(dá)量在花后13 d的黑米種子中最高[38]。Kim等克隆了水稻的三個(gè)F3H序列，發(fā)現(xiàn)F3H-1具有最高的酶活，F(xiàn)3H-2在所有組織中的表達(dá)量最高但在種子中不表達(dá)[48]。

3.1.5類(lèi)黃酮3′-羥化酶(F3′H)和類(lèi)黃酮3′，5′-羥化酶(F3′5′H)基因 類(lèi)黃酮-3′-羥化酶(flavonoid 3′-hydroxylase，F(xiàn)3′H)和類(lèi)黃酮-3′，5′-羥化酶(flavonoid 3′，5′-hydroxylase，F(xiàn)3′5′H)分別屬于P450家族的CYP75B家族和CYB75A家族[49]。在花色苷合成途徑中，二氫棟精在二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)和花色素合成酶(ANS)等酶的催化下生成紫紅色花色苷(矢車(chē)菊色素，cyanidin) F3′5′H催化DHK的B-環(huán)3'和5′位置羥基化生成二氫楊梅黃酮(Dihydromyricetin，DHM)， F3′5′H基因的表達(dá)趨向于合成花翠素，使花色偏藍(lán)[50]。秦宗燕等[51]對(duì)野生稻的幾個(gè)合成基因進(jìn)行研究，結(jié)果表明在葉中表達(dá)量最多的是F3′5′H，而 F3′H的表達(dá)量最少。Huang等[52]的研究表明這兩個(gè)基因同時(shí)編碼類(lèi)黃酮代謝過(guò)程有關(guān)的酶、調(diào)控該色素的下游和合成類(lèi)黃酮的“分界線(xiàn)”。Ryu等[36]分析了10個(gè)色稻品種， 認(rèn)為在色稻籽粒中相對(duì)于F3′5′H來(lái)說(shuō)， F3′H的表達(dá)占優(yōu)勢(shì)， 使得下游途徑由二氫槲皮素(dihydroquercetin， DHQ)經(jīng)過(guò)DFR、ANS以及UFGT基因的催化而合成花色苷。

3.1.6二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)基因 育種家最初是在玉米與金魚(yú)草中發(fā)現(xiàn)并通過(guò)分離及克隆得到該基因，結(jié)果表明該色素的顯色機(jī)理是受DFR基因的調(diào)節(jié)[53]。DFR在不同品種間的表達(dá)表現(xiàn)出空間專(zhuān)一性調(diào)控[54]。將DFR轉(zhuǎn)入Rcrd水稻中，種皮顏色從褐色變成了紅色，表明Rd編碼了DFR蛋白[55]。Phoka等[56]對(duì)水稻花色苷含量運(yùn)用RT-PCR方法，得出該基因表達(dá)量的多少受溫度變化的影響，高溫使它的表達(dá)量降低，并且該基因表達(dá)量高低直接影響花色苷積累量。

3.1.7花色苷合成酶(ANS)基因 1990年Messen等采用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)從玉米中分離出了ANS基因[57]，之后在金魚(yú)草和矮牽牛中也分離出此基因[47，57]色素合成酶(ANS)是位于花色苷合成通路末端的酶，催化了無(wú)色花色素向花色素的轉(zhuǎn)化。ANS能催化無(wú)色花色素轉(zhuǎn)化成花色素，它具有一個(gè)雙層的β螺旋結(jié)構(gòu)[39]。ANS在水稻突變體中的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致花色素和其他類(lèi)黃酮物質(zhì)的積累，而原花色素含量卻下降[39]。有研究表明，ANS在黑米花13 d后的表達(dá)量最高，在白米中也有少量表達(dá)[38]。因而，稻谷的種皮和果皮的著色差異是合成該色素基因的差異性表達(dá)。

3.1.8類(lèi)黃酮-3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶(UFGT)基因

使UFGT基因上的葡萄糖基移到C3羥基上(花色素)，使游離的花色素變?yōu)槔喂痰幕ㄉ?。UFGT生物活性最初在玉米的花藥中被發(fā)現(xiàn)和克隆[58]。糖基化的花色素分子有以下作用：改變植物花色、保持分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及保證該色素勝利運(yùn)送到液泡中[59]。Phoka等[56]通過(guò)RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，水稻中的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(UFGT)基因也已經(jīng)克隆。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

目前大多通過(guò)肉眼和顯微鏡觀察稻米花色苷的著色規(guī)律，對(duì)糙米的著色深淺給予評(píng)價(jià)，應(yīng)對(duì)稻米花色苷含量進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)不同的含量進(jìn)行顏色分級(jí)，為今后稻米花色苷含量的評(píng)價(jià)給予參考。稻米的花色苷主要存在于種皮和果皮中，它是經(jīng)過(guò)一系列的生理、生化反應(yīng)和結(jié)構(gòu)基因、運(yùn)用調(diào)節(jié)基因的參與形成，今后可通過(guò)對(duì)各種基因定位和育種手段培育出谷粒中富含花色苷的稻米新品種。對(duì)稻米花色苷的合成相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄因子的研究?jī)H停留在表達(dá)水平上，花色苷合成相關(guān)基因的全長(zhǎng)和啟動(dòng)子序列在不同品種間是否有差異，基因的功能尚未鑒定，花色苷合成關(guān)鍵候選基因在品種間的遺傳多樣性還有待進(jìn)一步研究明確，今后應(yīng)進(jìn)一步研究花色苷生物合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制、克隆稻米的基因及其了解差異表達(dá)機(jī)理，為獲得花色苷含量高的稻米提供理論依據(jù)。

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