張 釗，涂 嬌，秦 涵，張 偉，黃云南，張小雪

(貴州大學 動物科學學院水產(chǎn)系，貴州 貴陽 550025)

黃鱔(Monopterusalbus)俗稱鱔魚或田鰻，屬合鰓目(Synbranchiformes)，合鰓科(Synbranchidae)，黃鱔屬(Monopterus)，廣泛分布于亞洲地區(qū)。因肉嫩味鮮，營養(yǎng)價值甚高，且具有藥用價值，黃鱔養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模在逐年擴大，然而隨之而來的疾病爆發(fā)也越來越嚴重[1]。出血病是黃鱔養(yǎng)殖過程中最常爆發(fā)，危害最嚴重的疾病，該病發(fā)病速度快，死亡率高，傳染性強，為黃鱔養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[2]，對黃鱔養(yǎng)殖的健康發(fā)展構(gòu)成極大地威脅。嗜水氣單胞菌是黃鱔出血病的主要致病病原菌[3]，溶菌酶作為魚類非特異性免疫物質(zhì)之一，具有使細菌裂解的重要作用[4]；酸性磷酸酶是溶酶體的重要組成成分，且和肝功能密切相關(guān)[5]；堿性磷酸酶是機體代謝過程中的關(guān)鍵酶[6]，超氧化物歧化酶是機體內(nèi)重要的氧化自由基清除劑[7]。方晨等[8]對感染本實驗室分離的嗜水氣單胞菌后黃鱔部分臟器酸性磷酸酶和堿性磷酸酶兩種酶的活性變化進行了初步研究。由于不同來源的菌株對不同的魚類毒力有區(qū)別，因此本研究采用標準嗜水氣單胞菌菌株感染黃鱔，考察其對黃鱔血清中溶菌酶、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)等四種酶活性的影響，以期進一步認識嗜水氣單胞菌對黃鱔抗病功能的影響，進而為闡明嗜水氣單胞菌對黃鱔的致病機理等提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與菌株

實驗用60尾黃鱔(104.5±13.1)g采集于貴州貴陽花溪地區(qū)池塘和田間，實驗用嗜水氣單胞菌ATCC7966。

1.2 主要試劑

酶檢測試劑盒購于南京建成生物公司。

1.3 方法

1.3.1感染菌液制備 制備LB固體培養(yǎng)基，將嗜水氣單胞菌ATCC7966涂抹在培養(yǎng)基上，復壯后轉(zhuǎn)移到LB液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫搖床培養(yǎng)24 h，用平板計數(shù)法測定菌液濃度。稀釋菌液濃度至4×108cfu/ml備用。

1.3.2實驗分組與處理 清洗消毒養(yǎng)殖水箱。將黃鱔隨機分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和對照組，每組15條，放入水箱用不含有嗜水氣單胞菌和氯的水適應性飼養(yǎng)2天。對照組每尾注射0.2 ml生理鹽水。其余3個處理組，每尾黃鱔注射0.2 ml嗜水氣單胞菌菌液，其濃度分別為：處理組Ⅰ組1×108cfu/ml、處理組Ⅱ組2×108cfu/ml、處理組Ⅲ組4×108cfu/m；注射后用酒精棉球?qū)ψ⑸洳课贿M行消毒，然后放入水箱中飼養(yǎng)，并加蓋防逃。

1.3.3取樣與酶活測定 分別在注射嗜水氣單胞菌后12 h、24 h和48 h 3個時間點對各組取血樣，每組隨機挑選5條，斷尾取血，收集血清，放入4℃冰箱過夜，第2天取出2500 r/min離心10 min，取上清液，用試劑盒測定血清中溶菌酶、AKP、ACP、總超氧化物歧化酶的酶活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用EXCEL和SPSS 15.0軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析，P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜水氣單胞菌感染后黃鱔外觀變化

在感染嗜水氣單胞菌初期，黃鱔活動正常，體表無明顯病變特征，解剖未發(fā)現(xiàn)臟器異常。感染24 h后，活動緩慢，最高濃度組有死亡2條，黃鱔體表出現(xiàn)細小血點，解剖可見腹腔有腹水，臟器顏色變淺，個別有細小血斑。感染48 h后黃鱔活動無力或死亡，體表粘液增多，并布有血斑，肛門紅腫，擠壓腹部有大量腹水溢出；解剖可見臟器充血腫脹，且有質(zhì)地變脆腐爛現(xiàn)象。

2.2 嗜水氣單胞菌感染對黃鱔血清中溶菌酶活性的影響

如圖1所示，在感染嗜水氣單胞菌后，各組黃鱔血清中溶菌酶活力在48 h內(nèi)不斷升高；與對照組比較，處理I組酶活力變化不明顯，處理組Ⅱ在12和24 h顯著上升(P<0.05)，處理組Ⅲ在感染12 h顯著上升(P<0.05)，在24h極顯著上升(P<0.01)，但3組均在48 h與對照組差異不明顯。

2.3 嗜水氣單胞菌感染對黃鱔血清中ACP活性的影響

如圖2顯示，感染嗜水氣單胞菌后各組黃鱔血清中ACP活性在48 h內(nèi)不斷升高；與對照組比較，處理組ⅠACP活性在24 h時顯著上升(P<0.05)，處理組II在12 h時顯著上升(P<0.05)，處理組III ACP在12、24 h時均顯著上升(P<0.05)，但3組均在48 h與對照組差異不明顯。

圖1 不同濃度嗜水氣單胞菌處理對黃鱔血清溶菌酶活力影響Fig. 1 Effect of different concentrationsand processing time of Aeromonas hydrophila on serum lysozyme activity in Monopterus albus

圖2 不同濃度嗜水氣單胞菌處理對黃鱔血清ACP酶活力影響Fig. 2 Effect of different concentrations and processing time of Aeromonas hydrophila on serum ACP enzyme activity in Monopterus albus

2.4 嗜水氣單胞菌感染對黃鱔血清中AKP活性的影響

圖3 不同濃度嗜水氣單胞菌處理對黃鱔血清AKP酶活力影響Fig. 3 Effect of different concentrations and processing time of Aeromonas hydrophila on serum AKP enzyme activity in Monopterus albus

從圖3可以看出，感染嗜水氣單胞菌后，處理組Ⅰ和處理組Ⅱ黃鱔血清中AKP活力持續(xù)升高，處理組Ⅰ在感染48 h時AKP活力升高極顯著(P<0.01)，處理組II在感染48 h時出現(xiàn)顯著升高(P<0.05)而處理組Ⅲ12 h升高，后出現(xiàn)顯著(24 h)和極顯著(48 h)下降。

2.5 嗜水氣單胞菌感染對黃鱔血清中T-SOD活性的影響

如圖4所示，在感染嗜水氣單胞菌后，除處理組Ⅲ48 h外，各組黃鱔血清中T-SOD活性不斷升高，與對照組比較，處理I組個時間點差異不明顯，處理II組48 h明顯升高(P<0.05)，處理III組在24 h時顯著升高，在48 h時則顯著下降。

圖4 不同濃度嗜水氣單胞菌處理對黃鱔血清T-SOD酶活力影響Fig .4 Effect of different concentrations and processing time of Aeromonas hydrophila treatment on serum T-SOD enzyme activity in Monopterus albus

3 結(jié)論與討論

溶菌酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶屬于魚體的體液免疫因子，在魚體免疫過程中發(fā)揮重要的作用。在受到外界抗原侵入時會快速合成并分泌到血液中，通過檢測其在血液中的活性可反映魚體免疫過程的規(guī)律和健康狀態(tài)[9]。

3.1 嗜水氣單胞菌感染后黃鱔組織病理學變化

本實驗結(jié)果顯示，在感染嗜水氣單胞菌24 h后，黃鱔出現(xiàn)明顯染病癥狀，組織病理變化主要表現(xiàn)為體表及組織器官出血變性，細胞壞死，導致器官功能衰竭直至死亡。有研究表明發(fā)病呈急性過程，在感染9 h后即出現(xiàn)明顯病變癥狀[10]；而本實驗在感染12 h后，黃鱔并未出現(xiàn)明顯病變癥狀，這可能與本實驗選擇在溫度較低的秋末有關(guān)，延長了黃鱔的發(fā)病時間，但是組織病理的變化與其一致，說明了低溫對嗜水氣單胞菌的感染有抑制作用。在感染初期，黃鱔組織病理變化不顯著，而四種酶的活性相比對照組變化也不顯著，而在感染后期，黃鱔組織器官受損變化顯著，黃鱔血清中四種酶的活力變化顯著。這從側(cè)面說明了四種酶的活力變化與黃鱔臟器功能變化密切相關(guān)。

3.2 嗜水氣單胞菌對黃鱔血清溶菌酶活力的影響

溶菌酶是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶，并使之裂解而被釋放，從而消除侵入體內(nèi)的異物。該酶不僅能殺滅革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌還可使病毒失活[11]，因此，該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。本研究結(jié)果證實感染嗜水氣單胞菌后，黃鱔血清中溶菌酶活性顯著升高，說明在感染嗜水氣單胞菌后，黃鱔非特異性免疫功能得到增強。處理組Ⅱ和Ⅲ在感染24 h后溶菌酶活性都比對照組高，但有隨時間下降的趨勢，這可能是嗜水氣單胞菌在體內(nèi)24 h后的繁殖程指數(shù)生長模式[12]，超出了黃鱔自身的防御能力，使酶活性降低。當然，影響溶菌酶活力的因素還有很多，比如季節(jié)、溫度、PH值、水質(zhì)等都會對其有所影響[13]，這可能就是對照組在48 h內(nèi)也有升高趨勢的原因，但對本實驗研究分析其活性變化趨勢無太大影響。

3.3 嗜水氣單胞菌感染對黃鱔ACP活力的影響

ACP是溶酶體的重要組成成分，與溶酶體參與細胞凋亡功能密切相關(guān)[14]。感染嗜水氣單胞菌后，日本鰻鱺血清中的ACP的活性明顯升高[15]。噴灑蛭弧菌后，草魚血清和肝臟中的ACP活性都有所升高[16]。對于黃鱔感染嗜水氣單胞菌，有關(guān)研究表明，黃鱔肝臟中ACP活力有隨著菌液濃度呈先升高后降低變化規(guī)律，隨著時間同樣呈現(xiàn)了先升高后降低的趨勢[8]。本研究結(jié)果也顯示了在感染嗜水氣單胞菌后初期，黃鱔血清中ACP活力也有升高的趨勢，但總體上隨時間延長并沒有降低的趨勢，而是在后期趨于不變；且隨濃度的升高，ACP活力在后期也趨于不變，或有少許升高，可能是由于實驗季節(jié)和溫度的原因，使嗜水氣單胞菌毒性有所下降。處理組Ⅱ組在24 h的活力相比12 h有所下降，但降低不顯著，總體趨勢并未下降，而是在后期升高，說明感染后期，黃鱔機體細胞凋亡加快，需合成分泌更多ACP參與細胞的凋亡。

3.4 嗜水氣單胞菌感染對黃鱔血清AKP活性的影響

AKP和ACP一樣是溶酶體的重要組成成分，并且和鈣磷的代謝有直接聯(lián)系，正常情況下，血清中的AKP含量遠遠低于肝臟，但是如果肝臟功能受到損傷時，肝臟內(nèi)的AKP就會釋放到血液中，從而導致血液中AKP含量或者活性升高[17]。有研究表明，在感染嗜水氣單胞菌后，黃鱔臟器中的AKP活力都有顯著升高，但在48 h后沒有差異性變化[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的菌液處理后，黃鱔血清中AKP活力程持續(xù)升高趨勢，這與之前的研究并無矛盾，這可能是由于季節(jié)和溫度造成的黃鱔免疫能力不同，使黃鱔應急反應的時間有延長。處理III組高濃度的菌液處理在感染初期也有升高趨勢，但是在24 h后有不斷下降的趨勢，這說明在處理初期，黃鱔肝臟即受到損傷，AKP大量釋放到血液中，使得血清中AKP活力增加，但高濃度菌液處理24 h后，黃鱔肝臟功能下降，AKP含量降低，釋放到血清中的AKP隨之降低，這與解剖發(fā)現(xiàn)的肝臟腫脹充血的現(xiàn)象相吻合，導致AKP活力增加后呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢。

3.5 嗜水氣單胞菌感染對黃鱔血清T-SOD的影響

超氧化物歧化酶是一種重要的抗氧化酶，其活性與生物的免疫水平密切相關(guān)，是機體對抗氧化應激反應的第一道屏障，對于及時消除機體內(nèi)氧自由基，增強吞噬細胞的防御能力和整個機體的免疫功能有重要作用[18]。本研究結(jié)果中，各組在感染嗜水氣單胞菌后超氧化物歧化酶活性都有明顯的上升，這與張偉妮所研究的感染嗜水氣單胞菌后日本鰻鱺血清中超氧化物歧化酶的活力的變化相似[15]。但在感染嗜水氣單胞菌48 h后，處理組Ⅲ黃鱔血清T-SOD活性顯著下降，而趙靜在以嗜水氣單胞菌感染齊口裂腹魚后也得到了相同的結(jié)果，其原因推測是過高濃度的菌液和感染時間過長導致黃鱔組織器官嚴重受損，引起代謝紊亂，從而使機體抗氧化能力下降[19]。

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