韓 龍，康冀川，雷幫星，文庭池，錢一鑫

(1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025; 2. 貴州大學(xué) 教育部西南藥用生物資源工程研究中心，貴州 貴陽 550025)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)為茄科茄屬一年生草本植物，是僅次于水稻、小麥和玉米的第四大糧食作物[1]，具有耐旱、耐寒、耐貧瘠、適應(yīng)性廣及種植效率高等特點[2]，素有“地下金蘋果”和“第二面包”之稱。我國馬鈴薯種植面積約占全球種植面積的1/4，總產(chǎn)量占全球總產(chǎn)量的1/5，均居世界第一位[3]。馬鈴薯早疫病是由茄鏈格孢菌(Alternariasolani)引起的一種潛伏期短、再侵染頻繁、流行性強的氣傳病害，在世界各大馬鈴薯種植區(qū)均有發(fā)生，被認(rèn)為是僅次于馬鈴薯晚疫病的第二大真菌病害[4]。該菌可引起馬鈴薯植株葉片黃化、干枯，嚴(yán)重影響植株的光合作用，使植株早衰；還可侵染馬鈴薯薯塊，導(dǎo)致馬鈴薯薯塊腐爛，品質(zhì)下降和產(chǎn)量降低，在發(fā)生嚴(yán)重的地區(qū)產(chǎn)量損失率達30%以上[5]，已成為馬鈴薯產(chǎn)量的主要制約因素之一；還可侵染番茄引起番茄早疫病，造成番茄產(chǎn)量下降。

目前，馬鈴薯早疫病仍以化學(xué)防治為主，如施用丙森鋅、代森錳鋅、百菌清和氫氧化銅[6]等防治該病，但防治效果并不理想。隨著化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性、農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染等問題日益嚴(yán)重，使得尋求安全有效的生物防治方法成為研究熱點。由于生物防治安全、無污染、與環(huán)境兼容性好，在植物土傳病害綜合治理中具有不可替代的作用[7]。其中利用微生物及其代謝產(chǎn)物抑制馬鈴薯早疫病已有一些報道，但主要集中在利用單一微生物抑制早疫病方面，而單一微生物及其代謝產(chǎn)物存在抑菌作用不穩(wěn)定和防治機制單一等問題，所以本試驗在利用三株細菌單一發(fā)酵液對早疫病有抑制作用的基礎(chǔ)上，進一步將三株細菌進行混菌發(fā)酵，研究各菌株之間是否存在協(xié)同作用，為開發(fā)有效控制馬鈴薯早疫病的高效、低成本混合型生物農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試菌株 供試細菌有解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)D1、解淀粉芽孢桿菌hd213、解淀粉芽孢桿菌DEB-2、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)he41、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)F2、缺陷假單胞菌(Brevundimonasbullata)hd13和紡錘形賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillusfusiformis)he14，均由貴州大學(xué)貴州省生化工程中心分離保藏。

1.1.2培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、LB固體培養(yǎng)基、玉米粉蔗糖培養(yǎng)基(CMA)、燕麥培養(yǎng)基(OA)、水瓊脂培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1馬鈴薯早疫病菌的分離 采用組織分離法[8]，將病葉標(biāo)樣用自來水沖洗，75%的酒精擦洗，進行表面消毒，然后從病斑邊緣交界處切取一小塊病組織約2～3 mm，放在75%的酒精中浸泡2～3 s，再放在0.1%的升汞中浸泡3～5 min，然后用無菌水漂洗3次，將其移置到PDA培養(yǎng)基上，每皿2～3塊，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

當(dāng)菌落直徑長到1～2 cm時，鏡檢各菌落、菌絲及孢子，以確定目標(biāo)菌落。在無菌操作下，從目標(biāo)菌落的邊緣挑取一小塊約為2～3 mm帶有菌絲的培養(yǎng)基，再移接于PDA培養(yǎng)基上進行純化，直至菌落生長整齊一致無雜菌出現(xiàn)為止。

1.2.2病原菌的分子鑒定 收集在PDA培養(yǎng)基經(jīng)28℃培養(yǎng)9 d的分離菌株菌絲體，采用CTAB法提取病原菌基因組DNA，并用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系(25μL)為：2 μLdNTP(2.5 mmol/L)，2.5 μL10×Reaction buffer，0.5 μLTaq聚合酶(5 U/μL)，ITS1和ITS4各0.5 μL，2 μL模板DNA，17 μLdd H2O。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min 16℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察到預(yù)期的條帶后，將PCR產(chǎn)物提交生工生物工程(上海)股份有限公司進行純化和測序。

1.2.3病原菌的形態(tài)學(xué)觀察 將病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3 d，觀察病原菌的菌落形態(tài)。將病原菌接種到OA培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)7 d后，切成4 mm×4 mm的菌塊，轉(zhuǎn)接到CAM培養(yǎng)基，21℃培養(yǎng)3 d即可產(chǎn)生大量孢子，觀察病原菌的分生孢子梗及分生孢子的形態(tài)。

1.2.4病原菌的致病性測定 根據(jù)柯赫氏法則[9]進行致病性檢測，將健康的馬鈴薯葉片經(jīng)自來水沖洗后，75%酒精表面消毒，無菌水漂洗，切取馬鈴薯早疫病菌餅放在馬鈴薯葉片上，于水瓊脂培養(yǎng)基、20℃暗培養(yǎng)。每天觀察馬鈴薯葉片的發(fā)病情況，發(fā)病后從病健交界處再分離病原菌并進行分子與形態(tài)鑒定。

1.2.5茄鏈格孢菌拮抗細菌的篩選 采用平板對峙法[10]測定供試細菌對馬鈴薯早疫病菌的抑制作用。將活化培養(yǎng)的茄鏈格孢菌菌餅置于PDA培養(yǎng)基平板的中央，在其兩側(cè)對稱等距接種經(jīng)LB固體培養(yǎng)基28℃活化，培養(yǎng)2 d的細菌，28℃對峙培養(yǎng)，觀察抑菌作用、測量抑菌圈大小，以在供試細菌位置處放置瓊脂塊為對照，每處理3次重復(fù)，計算抑菌率。

抑菌率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%

1.2.6細菌發(fā)酵液的制備 將在LB固體培養(yǎng)基上經(jīng)28℃培養(yǎng)2d的細菌單菌落接入到50 mL的LB液體培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min搖床培養(yǎng)1 d即為細菌發(fā)酵母液；然后吸取1 mL菌液接種到裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28℃、150 r/min搖床培養(yǎng)4 d(以下發(fā)酵條件與此相同)。發(fā)酵物經(jīng)4℃、12000 r/min離心處理15 min、收集上清液、0.2 μm無菌過濾器過濾除菌即得無菌體發(fā)酵液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7單一細菌發(fā)酵液對早疫病的抑制作用 采用生長速率法[11]，用PDA培養(yǎng)基配成分別含發(fā)酵液1%、2%、4%、8%、16%、32%、64%的不同濃度處理，分別將100 mL培養(yǎng)基倒入90 mm直徑滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板，以不加發(fā)酵液的培養(yǎng)基為對照，每個處理設(shè)3個重復(fù)。用直徑10 mm的打孔器切取培養(yǎng)7 d的茄鏈格孢菌菌餅，在每處理平板中央各放置一個菌餅，于28℃暗培養(yǎng)4 d后，測量各處理的菌落直徑，計算相對抑菌率(計算方法與1.2.5相同).

1.2.8混菌發(fā)酵液對早疫病菌的抑制作用 將細菌的發(fā)酵母液按體積比1∶1接種后進行混菌發(fā)酵，并進行抑菌試驗(方法與1.2.7相同)。

1.2.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 用Excel 2007對所得的原始試驗數(shù)據(jù)進行整理，用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)處理，采用Duncan新復(fù)極差法進行單因素試驗統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 病原菌的分子鑒定

用ITS1和ITS4作為引物擴增的序列進行測序，將此序列與GenBank中已經(jīng)登陸的序列進行Blast比對，結(jié)果顯示，該病菌的ITS序列與鏈格孢屬Alternaria的序列相似性最高，達到100%，可以確定該菌是鏈格孢屬真菌。

2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

馬鈴薯早疫病菌株的形態(tài)如圖1，其在PDA培養(yǎng)基上的菌落呈圓形擴展， 菌絲初為白色，后為暗褐色，菌絲有橫隔和分支，并有灰白色氣生菌絲；分生孢子梗單生，短桿形；分生孢子側(cè)生，倒棒狀或手雷形，黃褐色，孢身(67.0～140.5)μm×(15.5～28.5)μm，具橫隔膜，橫隔膜3～11個，頂端有喙(OA培養(yǎng)基)。這些形態(tài)特征與茄鏈格孢(Alternariasolani)相符。

A：分生孢子梗及孢子；B-C：分生孢子；D：菌落. 標(biāo)尺： A-C=10 μm，D=40 mm

2.3 病原菌的致病性測定

根據(jù)柯赫氏法則，培養(yǎng)3 d后產(chǎn)生黑色病斑(圖2)，將病斑剪下，經(jīng)75%酒精消毒和無菌水漂洗，放于水瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分離純化出與原接病原菌形態(tài)特征一樣的菌株，該菌株經(jīng)分子鑒定，結(jié)果表明為Alternariasolani，與病原菌的分子鑒定結(jié)果一致。

A： 感病的馬鈴薯葉片

2.4 早疫病菌拮抗細菌的篩選

通過平板對峙法測定，菌株he41、D1、hd213、hd13、he14、F2與DEB-2(表1)，能形成明顯的抑菌圈，其中抑菌率在60.00%以上的有嗜麥芽寡養(yǎng)單孢菌he41與解淀粉芽孢桿菌D1，抑菌作用最強的是he41菌株；菌株hd213、hd13、he14與F2的抑菌率在50.00%～60.00%之間，其中hd213的抑菌率相對較高，菌株hd13、he14與F2的抑菌率無明顯差異；解淀粉芽孢桿菌DEB-2的抑菌作用相對較弱，抑菌率為46.02%。

表1 拮抗細菌活體菌株對茄鏈格孢菌的抑菌作用Tab.1 Inhibition effect of living antagonistic strains against A. solani

A： 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌he41， B： 解淀粉芽孢桿菌D1， C： 解淀粉芽孢桿菌hd213， D： 缺陷假單胞菌hd13， E： 紡錘形賴氨酸芽孢桿菌he14， F： 枯草芽孢桿菌F2， G： 解淀粉芽孢桿菌DEB-2， H： 對照

2.4 三株細菌單一發(fā)酵液對早疫病菌的抑制作用

采用生長速率法測定了菌株he41、D1與hd213的無菌體發(fā)酵液對早疫病菌的抑制作用，結(jié)果表明：三株細菌的無菌體發(fā)酵液能顯著抑制茄鏈格孢菌菌絲的生長，對菌絲的抑制率隨發(fā)酵液濃度的升高而增強。當(dāng)發(fā)酵液的濃度為4%時，3株細菌的抑菌率達60%以上，其中嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌he41的抑制率最高，為73.87%，解淀粉芽孢桿菌D1和解淀粉芽孢桿菌hd213的抑菌率分別為68.59%、62.12%。當(dāng)發(fā)酵液濃度為32%時，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌he41和解淀粉芽孢桿菌D1的抑菌率達到100%，病原菌不生長。

2.5 混菌發(fā)酵液對茄鏈格孢菌的抑制作用

通過對菌株he41、hd213與D1進行混菌發(fā)酵，試驗結(jié)果表明：菌株he41與hd213混菌發(fā)酵后，其抑菌效果與單一菌株he41、hd213的發(fā)酵液的抑菌效果相比，抑菌率分別減小31.33%，16.67%；菌株he41與D1混菌發(fā)酵后，其抑菌效果與單一菌株he41、D1的發(fā)酵液的抑菌效果相比，抑菌率分別減小22.85%、17.15%；菌株hd213與D1混菌發(fā)酵后，其抑菌效果與單一菌株hd213、D1的發(fā)酵液的抑菌效果相比，抑菌率分別減小22.45%，31.38%；菌株he41、hd213與D1混菌發(fā)酵后，其抑菌效果與單一菌株he41、hd213、D1的發(fā)酵液的抑菌效果相比，抑菌率分別減小28.53%、13.27%、23.25%。混菌發(fā)酵的抑菌效果弱于單一菌株發(fā)酵液的抑菌效果。

表2 不同濃度梯度發(fā)酵液對茄鏈格孢菌菌絲生長的抑制作用Tab.2 Inhibition effects of different concentrations of fermentation broth on hypha growth of A. solani.

表3 3株細菌混菌發(fā)酵液對茄鏈格孢菌菌絲的抑制作用Tab.3 Inhibitory effects of mixed fermentations of he41, D1 and hd213 on hypha growth of A. solani

A-G：分別含有1%-64%解淀粉芽孢桿菌D1發(fā)酵液. I-O：含有解淀粉芽孢桿菌hd213 1%-64%發(fā)酵液. Q-W：含有嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌he411%-64%發(fā)酵液. H， P， X：對照。

3 結(jié)論與討論

微生物源農(nóng)藥在生物農(nóng)藥中占有很大的比重，開發(fā)利用微生物源農(nóng)藥具有廣闊的空間。在過去的研究中，有很多利用微生物及其代謝產(chǎn)物抑制早疫病菌生長的實例。高麗輝等[12]將木霉菌T-115D的發(fā)酵液稀釋3倍后對馬鈴薯早疫病菌菌絲生長的抑制率為90.4%；吳穎等[13]發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌代謝物原液對茄鏈格孢菌菌絲生長的抑制率為55.44%；梁寧和蔣繼志[14]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌B309的發(fā)酵原液對茄鏈格孢的抑制率為79.32%。與這些已報道的菌株相比，本研究獲得的菌株D1、hd213與he41對馬鈴薯早疫病的抑制作用更具優(yōu)勢，在發(fā)酵濃度為32%時，其抑菌率分別為 100%、96.7%、100%，在馬鈴薯早疫病的防治中具有潛在的應(yīng)用價值。

將不同生防菌混合發(fā)酵后有可能產(chǎn)生新的活性物質(zhì)或增大活性物質(zhì)的量以增強防病效果，這使得開發(fā)混合菌劑成為生物農(nóng)藥發(fā)展的重要方向。黃河清濤等[15]發(fā)現(xiàn)，將黑曲霉與康氏木霉混菌發(fā)酵后，其降解纖維素的能力比單菌種發(fā)酵強；將兩種來自喜樹的內(nèi)生真菌混合發(fā)酵后，其喜樹堿的產(chǎn)量明顯高于單一菌株的產(chǎn)量[16];將兩種海洋真菌通過混合發(fā)酵后產(chǎn)生了一種新型豆香素[17]。在使用單菌株發(fā)酵進行抑菌試驗的基礎(chǔ)上，將菌株he41、D1與hd213進行混菌發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵的抑菌效果弱于單菌株發(fā)酵的抑菌效果。混合型發(fā)酵液的抑菌能力因菌種、接種比例、培養(yǎng)時間不同，其抑菌效果不同。對早疫病菌有強抑制作用的混菌組合有待進一步篩選，以期為有效應(yīng)用混合型微生物農(nóng)藥控制早疫病提供更多依據(jù)。

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