李麗琪，徐華容，劉 陽，李 瀟，蔡 依，阮金蘭

(1武昌理工學院生命科學院/生物多肽糖尿病藥物湖北省協同創(chuàng)新中心，武漢 430223；2武漢工程大學化工與制藥學院，武漢 430073)

骨骼肌和肝臟是葡萄糖攝取的主要靶器官[1-5]，當骨骼肌和/或肝臟對葡萄糖的使用發(fā)生異常時，胰島素抵抗的發(fā)生機率將提高[6]，所以探究HepG2用于建立體外胰島素抵抗模型探索核桃多肽促葡萄糖吸收以及改善胰島素抵抗的機制具有重要的意義。

1 試驗材料

1.1 試驗材料

L6細胞、HepG2細胞，中南民族大學藥學院藥理實驗室；HT多肽、HT-1、HT-2，武昌理工學院生物多肽糖尿病藥物湖北省協同創(chuàng)新中心自制(HT多肽批號：20141218；HT-1批號：20150816；HT-2批號：20150816)。

1.2 試驗試劑

MEM-α培養(yǎng)基、胎牛血清，美國Hyclone公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，碧云天生物技術研究所；葡萄糖攝取細胞的測定試劑盒、葡萄糖攝取細胞的測定試劑盒、ECL化學發(fā)光檢測試劑盒，Amersham-Pharmacia，Piscataway，USA；甘油、過氧硫銨、Tris-HCl、無菌PBS溶液、二甲亞砜，國藥集團化學試劑有限公司；聚偏氟乙烯膜，Pall Corporation，Washington，USA；RIPA組織/細胞裂解液，北京陽光生物科技有限公司；BCA蛋白含量測定試劑盒，美國Abgent公司；門冬胰島素注射液，丹麥諾和諾德公司；IRS-1抗體、p-IRS-1抗體、IRβ抗體、GLUT2抗體、β-actin抗體、Anti-rabbit IgG、Anti-mouse IgG，美國Cell Signaling公司；胰酶，美國GIBCO公司；雙抗溶液，上海suer生物科技有限公司；丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、甘氨酸、四甲基已二胺、溴酚藍、二硫代蘇糖醇、甲醇、氨基丁三醇，美國Tedia公司。

1.3 試驗儀器

Bio-RAD凝膠成像系統，美國Bio-Rad公司；Gel Image系統，APLEGEN，INC，USE；超凈臺，鄭州宏朗儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司；XSM-20生物顯微鏡，寧波順宇儀器有限公司；酶標儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；WH-1微型漩渦混合儀，江蘇盛藍儀器制造有限公司；電泳儀，北京六一儀器廠；YXQ-LS-100 S II高溫高壓蒸汽滅菌鍋，濟南思卓醫(yī)療儀器制造有限公司。

2 試驗方法

2.1 HT蛋白、HT多肽、HT-1、HT-2活性篩選

2.1.1 GLUT4轉膜活性篩選[7]含有pIRAP-mOrange cDNAs的質粒通過lipofectamineTM 2000轉染入L6細胞，轉染操作依照試劑盒說明進行。將穩(wěn)定表達IRAP-mOrange(L6 IRAP-mOrange)的L6細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)液中，隔天換液，于細胞培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng)。實驗前，細胞于48孔板中按照15 000個細胞/孔培養(yǎng)至融合狀態(tài)，然后無血清饑餓培養(yǎng)4h。分別加入100 nmol的胰島素和待篩選50μg/mL的HT多肽、HT-1、HT-2(胰島素作為陽性對照藥，每個樣品重復3次)，在0～30min之間，每5min拍攝1張，采用激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察IRAP-mOrange的轉運上膜變化，實驗中采用不加入Ca2+的觀測模式，采用555 nm的激光通道。以細胞膜上熒光強度作為測量指標，用SPSS和Excel統計軟件進行數據整理和統計，多組間顯著性差異比較。

2.1.2 L6肌管細胞葡萄糖攝取活性篩選[8-9]L6成纖維細胞在含有10%胎牛血清、青霉素100 kU/L、鏈霉素100mg/L的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)培養(yǎng)，細胞長至80%左右傳代。換用2%胎牛血清、青霉素100 kU/L、鏈霉素100mg/L的α-MEM培養(yǎng)基中進行分化，每48h換液1次。至第7天成纖維細胞90%以上分化為肌管細胞。將細胞接種于96孔板中，待其100%鋪滿孔底，換用無糖、無血清培養(yǎng)基饑餓2h。配置含100μg/mL濃度HT多肽、HT-1、HT-2的α-MEM培養(yǎng)基(胰島素作為陽性對照給藥濃度為100nmol)備用。L6細胞饑餓完成后，將每孔中培養(yǎng)基吸出，換用含藥物培養(yǎng)基，每孔加入100μL配置好的給藥培養(yǎng)基，孵育12h。隨后按照葡萄糖氧化酶試劑盒的說明方法，分別取各孔上清培養(yǎng)液加2μL加入200μL反應試劑中，37℃恒溫箱孵育30min，用酶標儀在波長為505 nm下檢測各孔吸光度，細胞葡萄糖攝取率=[(空白組OD-給藥組OD)/(空白組OD-未給藥組OD)]*100%。

2.2 HT多肽、HT-1、HT-2對高糖誘導HepG2細胞 模型的影響[10]

2.2.1 細胞培養(yǎng) 配制培養(yǎng)基100mL(90%+10%胎牛血清+1mL雙抗)，復蘇HEPG2細胞至培養(yǎng)瓶中，于5%CO2、37℃、95%空氣飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)，待細胞完全貼壁后更換培養(yǎng)液，每3d按1∶3進行細胞傳代，取對數生長期的細胞用于實驗。當細胞長滿80%時，用1mL胰酶消化，消化完全后，加入5mL培養(yǎng)液終止消化，反復吹打均勻并吸取2mL于10mL EP管中，用普通DMEM培養(yǎng)基稀釋5倍，均勻接種于96孔板，每孔150μL，24 h后棄去上清液。

2.2.2 高糖培養(yǎng)基的配制 配制120mmol/L的高糖培養(yǎng)基為母液，精密稱取171.2mg溶于10mL新鮮含酚紅培養(yǎng)基中，用0.22μm濾頭過濾除菌。分別配制0、30、40、50、60、70、80、90、100、120mmol/L高糖培養(yǎng)基。

2.2.3 高糖培養(yǎng)基的誘導 吸取掉廢棄培養(yǎng)基，換新配制的高糖培養(yǎng)液，每個濃度6個復孔，每孔15μL，普通DMEM培養(yǎng)基為對照，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，吸取掉高糖培養(yǎng)基，為防止酚紅對結果的影響，用新鮮無酚紅培養(yǎng)基清洗1遍，并點板，每孔100μL，放置培養(yǎng)箱24h。

2.2.4 GOD-POD法測葡萄糖吸收 從培養(yǎng)板中取2μL細胞培養(yǎng)液與200μL工作液于另一個96孔板混合，沒有細胞的無酚紅培養(yǎng)基為空白對照，在37℃反應30min，用酶標儀在505nm處測定吸光度，吸光度值越大，含糖量越高，選用葡萄糖消耗量最大時的葡萄糖添加量為最佳濃度的高糖培養(yǎng)基。

2.2.5 細胞給藥 以2.2.4中得到的最佳效果的溶度建立模型，配制高糖培養(yǎng)基15mL，按2.1.1培養(yǎng)細胞，精密稱取HT多肽凍干粉、HT-1、HT-2各1.0mg溶于10μL DMSO中，用無酚紅培養(yǎng)基稀釋，配制濃度為100μg/mL的培養(yǎng)液1mL，分別給藥點板，每孔100μL，設置6個復孔，以5μg/mL的小檗堿為對照，高糖培養(yǎng)基為對照組，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。吸取掉高糖培養(yǎng)基，用新鮮無酚紅培養(yǎng)基清洗1遍，并點板，每孔100μL，放置培養(yǎng)箱24h，新鮮無酚紅培養(yǎng)基為空白對照，按2.1.4測葡萄糖吸收。選擇給藥效果最好的樣品，設置3個濃度梯度，重復實驗。

2.3 蛋白質印跡分析[11]

2.3.1 高糖、低胰島素刺激誘導HepG2-IR細胞模型的建立 配制培養(yǎng)基200mL(90%普通培養(yǎng)基+10%胎牛血清+2mL雙抗)，培養(yǎng)細胞，待長滿80%～90%時，從培養(yǎng)瓶中取4mL，用普通DMEM培養(yǎng)基稀釋至10mL，于6孔板點板，每孔2mL，培養(yǎng)24h后，實驗組為優(yōu)選出的最佳濃度高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，對照組仍用普通DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，24h后用室溫預熱的PBS沖洗2遍后，用含100nmol/L胰島素的普通DMEM培養(yǎng)基孵育10min(放置5%CO2，37℃培養(yǎng)箱)。

2.3.2 細胞給藥 選用3.3.2中效果最佳的樣品精密稱取1.0mg，用10μL DMSO超聲使充分溶解后，于普通DMEM培養(yǎng)基稀釋，分別配制終濃度為50、100μg/mL的含藥培養(yǎng)基2mL，以5μg/mL的小檗堿為對照組，空白對照孔仍用普通DMEM培養(yǎng)基，每孔2mL，培養(yǎng)24h。

2.3.3 Westernblot檢測蛋白表達

實驗步驟：潤洗→檢漏→上分離膠→除氣泡→封滿靜置使凝膠→上濃縮膠→插梳→靜置使凝膠→拔梳→上樣→跑膠→轉膜→封膜→敷一抗→敷二抗→顯影

BCA法繪制蛋白標準曲線圖：按50體積BAC試劑A加1體積BAC試劑(50∶1)配制適量的BCA工作液，充分混勻(室溫24h使用完)。完全溶解的蛋白標準品，取10μL用PBS稀釋100μL，使終濃度為0.5mg/mL，將標準品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板中，加PBS稀釋到20μL，各孔再加BCA工作液200μL，37℃放置30min。用酶標儀檢測波長562nm吸光度，繪制蛋白標準曲線。

藥物干預24h后，棄去培養(yǎng)液，用PBS將細胞洗3遍，分別轉入2mL EP管中，放入離心機2 000r離心10min，去掉上清液留底部細胞，每孔加入100μL裂解液用槍吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸，置冰上40min，期間每隔10min用振蕩儀振蕩1次。充分裂解后，12 000r離心10min，取上清液即為細胞總蛋白，根據標準曲線檢測蛋白濃度，剩余蛋白經緩沖液處理、蛋白變性。

2.3.4 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗 選擇1.5cm的制膠板，清洗干凈晾干后組裝好垂直電泳板，去離子水潤洗并加滿檢漏，20min后液面沒有下降，倒掉去離子水，每邊用移液槍加入8%分離膠1 000μL*6，緩慢加入200μL異丙醇除氣泡，去離子水封滿，靜置30min，倒掉制膠器中液體，加滿濃縮膠，迅速插入樣梳，將整個制膠器放入透明槽內，加滿1*Running Buffer，靜置30min拔梳，去除蛋白樣品，溫水浴解凍，取等量蛋白樣品30μg上樣(根據蛋白標準曲線換算為體積)，插上電極，在80V電壓下跑膠40min，切換電壓120V，跑膠2h。

2.3.5 轉膜 電泳結束后，采用濕轉法將蛋白轉移至NC膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫搖床30r封閉2h封膜，將切割大小與凝膠大小一致的PVDF膜置于無水甲醇中浸泡3min，將泡好的PVDF膜及濾紙放于轉移緩沖液中，約30～60min，排凈膜上空氣，按3層濾紙、PVDF膜、凝膠、3層濾紙的順序從下到上放入轉膜儀中，恒定電流300mA下電轉1.5h。

2.3.6 封閉 轉膜結束后，將PVDF膜浸泡于5%脫脂牛奶中封閉液，完全排除氣泡后，低速搖床30r室溫封閉2 h，封閉完成后洗膜。

2.3.7 蛋白抗體的孵育 將封閉后的PVDF膜浸沒于相應蛋白的一抗(1∶2 000)4℃搖床低速30r孵育1夜，p-IRS-1抗體孵1天2夜，β-actin 2 h，孵育結束后，棄去封閉液，用TBST室溫震搖洗膜，將PVDF膜浸于用適量TBST按1∶5 000稀釋的二抗溶液中，在室溫下孵育1h。結束孵育后，用TBST洗液室溫振搖洗膜3次，每次10min。

2.3.8 顯影 將含蛋白面的PVDF膜置朝上放置潔凈的玻璃皿上，并將ECL化學發(fā)光試劑A液和B液等體積充分混合均勻，用移液槍吸取滴于PVDF膜蛋白面上，完全浸濕，室溫反應1min，于ECL化學發(fā)光儀中曝光，曝光時間由目的蛋白的熒光強弱而定。印跡條帶利用Odyssey雙色紅外熒光成像系統對目的條帶進行掃描，然后用Image軟件進行條帶分析。

3 結果與討論

HT多肽、HT-1和HT-2在降糖生物活性上都有一定的作用，其中HT-2的降糖效果最為顯著。

3.1 GLUT4轉膜活性篩選

由圖1可知，HT多肽、HT-1、HT-2均有一定的促GLUT4活性，但是量效曲線分布趨勢不相同，其中趨勢分布較好的為HT-2，隨著時間延長，促GLUT4轉膜效應逐漸增加，核桃多肽促GLUT4上膜效應很快，5min即達峰值，HT-2促GLUT4上膜效應較慢，15min開始響應，30min達峰值。胰島素(100nmol)和小檗堿(BBR，5μg/mL)作為陽性對照藥，均顯示很強的促GLUT4轉膜活性，轉膜提升倍數分別為2.66、2.46倍，說明選擇的系統和構建的模型成功；HT多肽、HT-1、HT-2以50μg/mL給藥均具有一定的促GLUT4轉膜活性(圖2)。運用基于L6細胞GLUT4熒光標記和轉染的促GLUT4轉位上膜篩選方法對HT多肽、HT-1、HT-2進行了篩選，結果顯示，核桃多肽富集部位HT-2具有良好的促GLUT4轉位上膜活性，在25min細胞膜上GLUT4增加1倍(圖3)。

圖1 HT多肽、HT-1、HT-2對GLUT4轉膜的時間效應

圖2 HT多肽、HT-1、HT-2對GLUT4轉膜的促進作用

圖3 HT-2對L6細胞中GLUT4轉位的影響注：A給藥前L6細胞中GLUT4的分布情況；B給藥25min后L6細胞中GLUT4的分布情況；C給藥25min內熒光值的變化；D給藥前和給藥25min后熒光值的變化；*P≤0.05，與給藥前相比較

3.2 L6肌管細胞葡萄糖攝取(消耗)活性篩選

由圖4可知，胰島素(100nmol)和小檗堿(BBR，5μg/mL)作為陽性對照藥，在L6細胞上均顯示很強的葡萄糖攝取活性，攝取率分別為2.38、1.78，說明選擇的系統和構建的模型成功；HT-多肽、HT-1和HT-2均有一定的葡萄糖攝取活性，攝取率分別為1.16、1.06和1.36。

圖4 HT蛋白、HT-1、HT-多肽和HT-2葡萄糖攝取活性

3.3 不同濃度高糖誘導的HepG2葡萄糖消耗量的影響

與對照組相比，實驗組的葡萄糖吸光度均有明顯的下降，綜合考慮葡萄糖用量，選用50mmol/L高糖誘導建立胰島素抵抗細胞模型(圖5)。

圖5 不同濃度高糖培養(yǎng)基誘導的HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響

3.4 HT多肽、HT-1、HT-2對高糖誘導的HepG2葡萄糖消耗量的影響

50mmol/L的高糖培養(yǎng)基誘導后，不同組分的核桃多肽(100μg /mL)對HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響，與空白對照組相比，實驗組的吸光度均有一定的降低，陽性組小檗堿有良好的降糖效果，實驗組中HT-2效果相對較好(圖6)。

圖6 核桃多肽對高糖誘導的HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響

3.5 HT-2對高糖誘導的HepG2葡萄糖消耗量的影響

與對照組和空白對照組相比，HT-2有一定的降糖作用，且隨著給藥濃度的加大，葡萄糖消耗量增加，即降糖作用與HT-2的濃度呈依賴性增加(圖7)。

圖7 不同濃度HT-2高糖誘導的HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響

3.6 Westernblot檢測蛋白表達結果

蛋白標準曲線圖見附表、圖8。本研究通過蛋白印跡進行HT-2改善脂質代謝的體內分子機制的研究，用一定濃度的HT-2處理胰島素抵抗的HepG2細胞，評估HT-2對IRβ、IRS-1、P-IRS-1、GLUT2的影響，與空白對照組相比，IRβ、IRS-1蛋白、GLUT2蛋白的表達水平呈濃度依賴性增加，圖9表明，HT-2通過胰島素信號傳導途徑改善葡萄糖代謝。

附表 標準蛋白吸光度數據

圖8 蛋白標準曲線

圖9 HT-2對高糖誘導HepG2細胞胰島素受體蛋白、磷酸化胰島素受體蛋白、GLUT2蛋白表達水平的影響注：與正常組比較，+++P<0.001、++P<0.01、+P<0.03，與模型組比較，+++P<0.001、++P<0.01、+P<0.03

4 結論

根據GLUT4轉膜活性篩選和L6肌管細胞葡萄糖攝取活性篩選結果，HT多肽、HT-1和HT-2均顯示有一定的生物活性，其中HT-2轉膜活性和葡萄糖攝取活性相對較好；并且在高糖誘導HepG2細胞檢測葡萄糖攝取實驗中，HT-2的降糖效果也較HT多肽、HT-1的顯著。肝臟是用于儲存和釋放碳水化合物的主要組織，GLUT2存在于肝臟組織中，并且GLUT2易位可刺激葡萄糖的攝取，因此GLUT2在肝臟葡萄糖和脂質代謝的調節(jié)中起著關鍵的作用，在蛋白質印跡結果中可發(fā)現，HT-2可以上調糖尿病小鼠肝臟組織GLUT2蛋白水平，并對IRβ、IRS-1蛋白的表達水平具有一定的增強效果，表明HT-2對高糖誘導的胰島素抵抗HEPG2細胞具有有益作用，即通過胰島素信號通路改善肝臟糖脂代謝，包括改善葡萄糖耐量，降低高血糖并恢復胰島素水平。◇

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