張曉瑩，么宗利，來琦芳，厲成新，周 凱，劉進(jìn)紅，隋延鳴，馬慶男，高鵬程

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，鹽堿水域漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3.光明漁業(yè)有限公司，江蘇大豐 224153）

在池塘養(yǎng)殖中，高密度放養(yǎng)及飼料的過量投喂易破壞池塘的生態(tài)系統(tǒng)，造成水體亞硝酸鹽含量升高［1－3］。高濃度亞硝酸鹽會影響魚類攝食、活動及生長［4－5］，長期脅迫會降低魚類的免疫力，增加致病菌的易感性，嚴(yán)重脅迫甚至?xí)鹚劳觯?－7］。魚體為應(yīng)對脅迫因子的影響，會產(chǎn)生一系列的生理生化響應(yīng)，直接反應(yīng)在其代謝率的變化，另一方面魚體的活動能力亦會受到影響［8］，監(jiān)測脅迫下魚類的代謝率可以反應(yīng)其在不同水環(huán)境中的活動規(guī)律、生理代謝水平、能量需求水平［9－11］。

標(biāo)準(zhǔn)代謝率 （standard metabolic rate，SMR）是滿足魚體的最低能量需求［12－13］，能反應(yīng)魚類的生態(tài)習(xí)性［14］，預(yù)測其能量分配［12］。魚體在應(yīng)對不同環(huán)境因子脅迫時，均會啟用相應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制，SMR 發(fā) 生 顯 著 變 化［8，15］。最 大 代 謝 率（maximum metabolic rate，MMR）是魚體力竭運(yùn)動后的最大耗氧率，與魚體的行為和活動能力有密切關(guān)系，越活躍的魚類越能維持更高水平的耗氧量［16］，能反映出一些魚類特殊的代謝模式［14，17］。有氧代謝范圍（aerobic scope，AS）是MMR與SMR的差值，反映環(huán)境因子對魚體生理代謝的影響，通常用來評價(jià)滿足魚類基本生理代謝需求外，完成其它有氧代謝活動的能力。AS的下降會破壞魚體的代謝平衡，引起能量需求沖突，不利于魚體的健康生長［16，18］。亞硝酸鹽在魚體內(nèi)會將血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，導(dǎo)致魚體載氧能力下降，從而影響代謝［19－21］。

異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）是我國淡水養(yǎng)殖的主要種類之一，具有營養(yǎng)豐富、肉味鮮美、適應(yīng)性強(qiáng)、生長快等特點(diǎn)［22－23］。本實(shí)驗(yàn)旨在探索異育銀鯽在不同濃度亞硝酸鹽水環(huán)境下SMR、MMR、AS、MHb／Hb的變化規(guī)律，以期進(jìn)一步揭示亞硝酸鹽對異育銀鯽呼吸生理、有氧代謝及運(yùn)動能力的潛在生態(tài)毒性，為異育銀鯽的健康養(yǎng)殖、生長模型構(gòu)建提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)于2016年6－8月在光明漁業(yè)有限公司進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)用的異育銀鯽幼魚取自光明食品集團(tuán)上海市海豐標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖池塘，放入體積為300 L、直徑為2 m的圓形魚缸中暫養(yǎng)2周，暫養(yǎng)期間水溫 （25.5±0.5）°C，pH 7.84±0.12，總氨氮濃度 （0.12 ±0.01）mg·L－1，亞硝酸鹽濃度（0.07±0.01）mg·L－1，溶氧水平不低于5 mg·L－1，每天投喂飼料1次，投喂量約為體重的5%，投餌后2 h吸走殘餌糞便，日換水量為30%。選取規(guī)格均勻、健壯的個體作為實(shí)驗(yàn)對象。實(shí)驗(yàn)用水采用過濾的河水加入一定量NaNO2（AR）配制而成，亞硝酸鹽濃度測定采用重氮-偶氮光度法［24］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照陳家長等［6］、譚樹華等［25］、單娜［26］的研究結(jié)果及預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，呼吸代謝實(shí)驗(yàn)的魚體質(zhì)量為 （15.31±2.28）g、體長為 （9.03±0.55）cm，亞硝酸鹽設(shè)置3個濃度梯度，分別為0.5、1、1.5 mg·L－1，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)放3尾異育銀鯽；MHb／Hb實(shí)驗(yàn)的魚體質(zhì)量為（58.79±4.94）g、體長為 （12.03±0.87）cm，亞硝酸鹽設(shè)置4個濃度梯度，分別為0.5、1、2、3 mg·L－1，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)20尾異育銀鯽。以過濾的河水作為對照組，每隔6 h測定并調(diào)節(jié)亞硝酸鹽濃度，實(shí)驗(yàn)期間不進(jìn)行投喂，其它實(shí)驗(yàn)條件與暫養(yǎng)期間一致。

1.2.2 呼吸代謝測定

為排除攝食對魚體代謝率的影響，實(shí)驗(yàn)開始前48 h停止投喂［27］；實(shí)驗(yàn)開始前及結(jié)束后均測定對照呼吸室（空白對照）中的溶氧變化，排除實(shí)驗(yàn)水體中微生物耗氧對代謝率的影響［13，28］。

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)代謝率 （SMR）的測定

實(shí)驗(yàn)采用魚類流水式呼吸室測定異育銀鯽的SMR，實(shí)驗(yàn)水體為2 L，將實(shí)驗(yàn)魚放入含有不同濃度亞硝酸鹽的呼吸室中脅迫96 h后，連續(xù)24 h每隔1 h監(jiān)測呼吸室中溶氧的變化，整個實(shí)驗(yàn)過程保證水中溶氧水平不低于飽和溶氧的80%，每次測定時間為5 min。為保證呼吸室中水體充分混合并減少對魚體的驚擾，測定期間關(guān)閉呼吸室的外循環(huán)，打開內(nèi)循環(huán)；未測定時打開外循環(huán)，關(guān)閉內(nèi)循環(huán)。溶氧采用多參數(shù)水質(zhì)測量儀 （YSI 6600，USA）監(jiān)測。整個實(shí)驗(yàn)過程在黑暗環(huán)境中進(jìn)行，根據(jù)代謝率公式計(jì)算相關(guān)數(shù)值，最小10%數(shù)據(jù)的平均值作為 SMR［12，29］。

代謝率MO2＝△O2·V／（t· m）

其中，△O2為實(shí)驗(yàn)呼吸室中溶氧變化量與對照呼吸室（空白對照）溶氧變化量之差，V為呼吸室的體積，t為測定的總時間，m為實(shí)驗(yàn)魚的體質(zhì)量［8，30］。

1.2.2.2 最大代謝率 （MMR）的測定

將實(shí)驗(yàn)魚放入不同濃度的亞硝酸鹽水環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)水體為100 L，脅迫96 h后將實(shí)驗(yàn)魚放入環(huán)形水道內(nèi)，參照J(rèn)EROEN等［28］的方法，人工驅(qū)趕實(shí)驗(yàn)魚5～10 min，使之力竭，力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)為實(shí)驗(yàn)魚不再游泳前進(jìn)，在20 s內(nèi)立刻將實(shí)驗(yàn)魚轉(zhuǎn)移到呼吸室中，測定水中溶氧的變化，根據(jù)代謝率公式計(jì)算相關(guān)數(shù)值，以測量值的最大值作為MMR［16，29］。

1.2.2.3 有氧代謝范圍（AS）的測定

有氧代謝范圍 AS值為 MMR與 SMR之差［31］。

1.2.3 高鐵血紅蛋白比例 （MHb／Hb）測定

將實(shí)驗(yàn)魚放入不同濃度的亞硝酸鹽水環(huán)境中脅迫，實(shí)驗(yàn)水體為200 L，分別于脅迫 24、48、72、96 h后采樣，每次每組隨機(jī)采樣5 ind。MS-222進(jìn)行麻醉，濕紗布裹住魚體，露尾部，用浸潤肝素鈉的2 mL注射器從實(shí)驗(yàn)魚尾靜脈采集血液1 mL左右，時間不超過1 min，置于潔凈的2 mL離心管中，血樣保存于 -80℃ 冰箱中備用。MHb／Hb采用江蘇省南京建成生物工程研究所有限公司試劑盒進(jìn)行測定，具體操作參照說明書，用Synergy H1酶標(biāo)儀 （Bio-tek，USA）檢測其吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）。數(shù)據(jù)處理使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果用單因素方差分析 （one-way ANOVA）進(jìn)行顯著性檢測，若方差分析差異顯著，則再用 Duncan進(jìn)行多重比較，顯著水平 P為0.05；采用曲線模型進(jìn)行回歸分析，顯著水平P為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硝酸鹽脅迫下異育銀鯽呼吸代謝的變化

2.1.1 亞硝酸鹽脅迫下標(biāo)準(zhǔn)代謝率（SMR）的變化

與對照組（182.14±6.67）mg·（kg·h）－1相比，異育銀鯽SMR隨水環(huán)境亞硝酸鹽濃度的升高而顯著升高 （P＜0.05），當(dāng)水環(huán)境亞硝酸鹽濃度為 0.5、1、1.5 mg·L－1時，SMR分別增加了16%、28%和40% （圖1）。通過回歸分析，SMR與水環(huán)境亞硝酸鹽濃度呈二次方回歸關(guān)系：y＝181．995＋67．237x－12．577x2，R2＝1．000，P＜0.05。

圖1 亞硝酸鹽脅迫下異育銀鯽標(biāo)準(zhǔn)代謝率的變化Fig.1 Changes of standard metabolic rate of C．a(chǎn)uratus gibelio under nitrite stress注：“*”表示試驗(yàn)組與對照組具有顯著差異（P＜0.05）Note：“*” represents significant differences between the experiment group and control group（P＜0.05）

2.1.2 亞硝酸鹽脅迫下最大代謝率 （MMR）的變化

與對照組（549.52 ±14.81）mg·（kg·h）－1相比，異育銀鯽MMR隨水環(huán)境亞硝酸鹽濃度的升高而顯著降低（P＜0.05），當(dāng)水環(huán)境亞硝酸鹽濃度為 0.5、1、1.5 mg·L－1時，MMR分別減少了12%、16%和18% （圖2）。通過回歸分析，MMR與水環(huán)境亞硝酸鹽濃度呈二次方回歸關(guān)系：y＝548．662－143．193x－54．502x2，R2＝0．997，P＜0.05。

圖2 亞硝酸鹽脅迫下異育銀鯽最大代謝率的變化Fig.2 Changes of the maximum metabolic rate of C．a(chǎn)uratus gibelio under nitrite stress注：“*”表示試驗(yàn)組與對照組具有顯著差異（P＜0.05）Note：“*” represents significant differences between the experiment group and control group（P＜0.05）

2.1.3 亞硝酸鹽脅迫下有氧代謝范圍 （AS）的變化

與對照組（367.38±4.78）mg·（kg·h）－1相比，異育銀鯽AS隨水環(huán)境亞硝酸鹽濃度的升高而顯著降低（P＜0.05），當(dāng)水環(huán)境亞硝酸鹽濃度為 0.5、1、1.5 mg·L－1時，AS分別減少了25%、39%和45% （圖3）。通過回歸分析，AS和水環(huán)境亞硝酸鹽濃度呈二次方回歸關(guān)系：y＝366．668－210．431x＋67．079x2，R2＝0.999，P＜0.05。

圖3 亞硝酸鹽脅迫下異育銀鯽有氧代謝范圍的變化Fig.3 Changes of aerobic scope of C．a(chǎn)uratus gibelio under nitrite stress注：“*”表示試驗(yàn)組與對照組具有顯著差異（P＜0.05）Note：“*” represents significant differences between the experiment group and control group（P＜0.05）

2.2 亞硝酸鹽脅迫下異育銀鯽高鐵血紅蛋白比例 （MHb／Hb）的變化

隨水環(huán)境亞硝酸鹽濃度的升高，異育銀鯽MHb／Hb顯著升高 （P＜0.05）。異育銀鯽在亞硝酸鹽濃度為0.5 mg·L－1及3 mg·L－1的水環(huán)境中96 h后MHb／Hb分別為0.05±0.00和0.23±0.01，是對照組的2.2和10倍 （圖4）。通過回歸分析，MHb／Hb和水環(huán)境亞硝酸鹽濃度存在三次方回歸關(guān)系：y＝0．017＋0．072x－0．05x2＋0．015x3，R2＝0.998，P＜0.05。在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，異育銀鯽MHb／Hb在48 h內(nèi)趨于穩(wěn)定。

圖4 亞硝酸鹽脅迫下異育銀鯽高鐵血紅蛋白比例的變化Fig.4 Methemoglobin proportion of C．a(chǎn)uratus gibelio exposed to nitrite stress注：“*”表示試驗(yàn)組與對照組具有顯著差異（P＜0.05）Note：“*” represents significant differences between the experiment group and control group（P＜0.05）

3 討論

3.1 亞硝酸鹽脅迫下異育銀鯽標(biāo)準(zhǔn)代謝率（SMR）及最大代謝率（MMR）的變化規(guī)律

在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，異育銀鯽SMR與水環(huán)境亞硝酸鹽濃度呈正相關(guān)，MMR則與之呈負(fù)相關(guān)，MMR和SMR反映了生物體有氧能量代謝的上限和下限［16］。結(jié)果表明，在高亞硝酸鹽脅迫下，維持異育銀鯽基本生存的能量需求升高，可提供的有氧代謝總能量降低。根據(jù)陳家長等［6］、單娜［26］、TONI等［32］的研究，在高亞硝酸鹽水環(huán)境中，魚體血液中溶菌酶、堿性磷酸酶、補(bǔ)體 C3、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶的活性均顯著降低，導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，增加了對致病菌的易感性，因此異育銀鯽所需能量增加，用于修復(fù)自身機(jī)能并維持基本生理功能［8，33］。INSEOK等［34］的研究表明，在高亞硝酸鹽水環(huán)境中，葡萄糖和總蛋白含量顯著下降，證明了魚體內(nèi)大量能量物質(zhì)的損耗；STORMER等［35］發(fā)現(xiàn)魚體乳酸含量隨亞硝酸鹽含量的升高而顯著升高，說明魚體無氧代謝能力增強(qiáng)，間接說明了魚體有氧代謝能力下降，導(dǎo)致游泳能力下降，逃逸、捕食及繁殖等行為均受到限制［36－37］。

3.2 亞硝酸鹽脅迫下異育銀鯽有氧代謝范圍（AS）的變化規(guī)律

在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，異育銀鯽的AS與水環(huán)境亞硝酸鹽濃度呈負(fù)相關(guān)，即在高濃度亞硝酸鹽水環(huán)境中完成有氧代謝活動的范圍變窄，包括攝食、生長及繁殖等［18］。當(dāng)生存環(huán)境惡化時，魚體需要更多的能量應(yīng)對脅迫，而可提供的有氧代謝能量減少，CLAIREAUX等［30］的研究結(jié)果表明，低AS不能滿足魚類攝食消化的能量需求，易造成生理與活動過程對能量需求的沖突，尤其不利于幼魚的生長并且會降低魚體應(yīng)對環(huán)境變化的能力，導(dǎo)致死亡率顯著升高［37－38］。JEROEN等［29］發(fā)現(xiàn)歐洲鱸 （Perca fluviatilis Linneaus）在臨近致死溫度（CTmax）的水環(huán)境中，通過增加溶氧水平能增加AS，在高亞硝酸鹽水環(huán)境中能否通過升高溶氧水平來增加異育銀鯽的AS，以增強(qiáng)魚體應(yīng)對脅迫的能力，有待進(jìn)一步研究。

3.3 亞硝酸鹽脅迫下異育銀鯽高鐵血紅蛋白比例 （MHb／Hb）變化規(guī)律

在高亞硝酸鹽水環(huán)境下，異育銀鯽血液中MHb／Hb顯著升高，說明其載氧能力下降。高亞硝酸鹽使亞鐵血紅蛋白（Fe2＋）迅速轉(zhuǎn)化成高鐵血紅蛋白（Fe3＋），同時失去攜氧功能，導(dǎo)致魚體載氧能力顯著下降，造成魚體組織缺氧，有氧代謝能力下降［35］，因此推測高亞硝酸鹽環(huán)境中的異育銀鯽AS下降應(yīng)與MHb／Hb密切相關(guān)。此外，在本實(shí)驗(yàn)中MHb／Hb與水環(huán)境亞硝酸鹽濃度呈三次方回歸關(guān)系，亞硝酸鹽濃度由2 mg·L－1上升至3 mg·L－1時，MHb／Hb快速升高，說明在此范圍異育銀鯽對亞硝酸鹽脅迫有敏感點(diǎn)，這與陳家長等［6］對尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的研究結(jié)果相似，亞硝酸鹽濃度小于1.5 mg·L－1時，尼羅羅非魚血清非特異性免疫酶（溶菌酶、堿性磷酸酶、補(bǔ)體C3）活性與對照組相比無顯著性差異，高于3 mg·L－1的脅迫會顯著降低魚體血清非特異性免疫酶的活性。

4 小結(jié)

本研究結(jié)果顯示在高濃度亞硝酸鹽脅迫下，異育銀鯽一方面通過各項(xiàng)生理活動來應(yīng)對脅迫的影響，導(dǎo)致SMR升高，另一方面由于 MHb／Hb上升導(dǎo)致魚體載氧能力的下降，MMR下降，AS減小，因此從有氧代謝角度考慮，可以探索在高亞硝酸鹽水環(huán)境中通過增加溶氧量緩解高亞硝酸鹽對魚體的脅迫。

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