李學(xué)龍， 劉國麗， 李 超， 李 躍， 楊 鎮(zhèn)

(遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所/遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物工程中心，遼寧 沈陽 110161)

2016年5月，國土資源部中國地質(zhì)調(diào)查局發(fā)布《中國地球化學(xué)調(diào)查報告(2016)》，報告顯示在調(diào)查的 9.20×107hm2耕地中，重金屬污染耕地占比8.2%，覆蓋面積 7.53×106hm2，重金屬污染已成為影響農(nóng)田土壤安全的重要因素，因此修復(fù)重金屬超標(biāo)的農(nóng)田土壤對保持土壤環(huán)境及水生態(tài)系統(tǒng)安全具有重要意義。重金屬進(jìn)入農(nóng)田土壤后，不僅對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、土壤酶系活性產(chǎn)生負(fù)面影響[1]，導(dǎo)致土壤肥力下降，而且會影響種植作物的正常生長代謝過程，引起農(nóng)作物產(chǎn)量及品質(zhì)降低，并且在植株及果實、種子中積累，最終進(jìn)入人體，導(dǎo)致人體健康受到極大危害[2-3]。

傳統(tǒng)重金屬污染處理方法主要是將重金屬離子通過生物炭吸附鈍化或施用吸附劑進(jìn)行固化[4-8]。相比于傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法，特異性微生物及其分泌的胞外聚合物處理污染土壤中重金屬具有更大的優(yōu)勢[9]。微生物對重金屬的吸附作用主要取決于重金屬對微生物菌體本身的親和性，包括配位、絡(luò)合、離子交換、氧化還原等物理化學(xué)過程[10-11]，重金屬在微生物細(xì)胞吸附位點(diǎn)主要有細(xì)胞表面吸附沉淀及細(xì)胞內(nèi)積累，涉及到的細(xì)胞代謝過程主要包括擴(kuò)散、離子通道、離子泵運(yùn)輸?shù)萚12-13]。此外，諸多研究結(jié)果表明微生物胞外聚合物(EPS)對重金屬吸附具有重要作用[14]，EPS主要由微生物分泌的有機(jī)物質(zhì)及細(xì)胞水解后產(chǎn)生的片段和破損的細(xì)胞膜組成[15]，主要組分包括蛋白質(zhì)、多糖、核酸等大分子胞外分泌物[16]。

目前微生物吸附重金屬的機(jī)理研究主要在重金屬在細(xì)胞作用位點(diǎn)及吸附后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化方面[17-19]，對胞外聚合物及菌體本身吸附重金屬的機(jī)理研究較少。王亮等[20]研究了白腐真菌及其胞外聚合物對Pb2+的吸附行為，結(jié)果表明EPS對Pb2+具有較強(qiáng)的吸附能力，去除EPS的菌體對Pb2+吸附能力明顯降低。Jose等[21]研究了細(xì)菌產(chǎn)生的EPS對不同重金屬吸附的影響。熊芬等[22]研究了煙曲霉胞外聚合物對Pb2+的吸附行為及機(jī)理，結(jié)果表明EPS中多糖對Pb2+的吸附起主要作用。

本試驗采用不同濃度Cd2+培養(yǎng)基培養(yǎng)蠟樣芽胞桿菌A-15，考察菌體生長及胞外聚合物的生成量，同時考察細(xì)胞菌體及胞外聚合物對Cd2+的吸附作用，為探索用蠟樣芽胞桿菌及其胞外聚合物處理重金屬污染農(nóng)田土壤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

1.1.1 菌株來源 蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)A-15分離自鎘污染土壤中，保存于遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物工程中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 菌種保存培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 L，pH7.0～7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 L，pH7.0～7.2。

1.2 菌株的液體發(fā)酵培養(yǎng)

無菌條件下向裝有100 ml培養(yǎng)基的250 ml錐形瓶中接入2接種環(huán)的A-15菌種，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h至對數(shù)生長期，接種10 ml菌懸液到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行同步培養(yǎng)。每隔4 h取樣，采用分光光度法測定光密度，繪制生長曲線，并測定菌體分泌的EPS產(chǎn)量。

1.3 樣品制備

1.3.1 EPS樣品的制備方法 采用改進(jìn)的離心沉淀-乙醇提取法提取胞外聚合物EPS。將培養(yǎng)結(jié)束的菌懸發(fā)酵液4 ℃下6 000g離心20 min，上清液用0.45 μm水系濾膜過濾。在濾液中加入5倍體積無水乙醇，4 ℃下靜置24 h，10 000g離心20 min，沉淀物為EPS及生物小分子混合物。將此混合物轉(zhuǎn)移至透析袋(MD34-3500)中，透析袋室溫下置于純凈水中進(jìn)行透析純化，得到純化EPS，-65 ℃下冷凍干燥得到EPS凍干粉。

1.3.2 細(xì)菌菌體(不含EPS)樣品的制備方法 將培養(yǎng)結(jié)束的菌懸發(fā)酵液4 ℃下6 000g離心20 min，沉淀物用純凈水洗滌，4 ℃下12 000g離心20 min。重復(fù)純凈水洗滌及離心1次，-65 ℃下冷凍干燥得到不含EPS菌體凍干粉。

1.3.3 細(xì)菌菌體-EPS復(fù)合物樣品的制備方法 將培養(yǎng)結(jié)束的菌懸發(fā)酵液45 ℃下真空濃縮，置于透析袋(MD34-3500)中，透析袋室溫下置于純凈水中進(jìn)行透析純化，得到純化菌體-EPS復(fù)合物。-65 ℃下冷凍干燥得到菌體-EPS復(fù)合物凍干粉。

1.4 分析方法

1.4.1 EPS組成成分分析 EPS凍干粉用純凈水溶解后定容，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用苯酚-H2SO4法測定多糖含量。以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量。

1.4.2 Cd2+標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備與測定 稱取高純鎘(99.9%) 0.100 0 g，置于250 ml燒杯中，加入10 ml鹽酸，加熱溶解后移入100 ml容量瓶中，稀釋至刻度搖勻，即制得1 mg/ml的Cd2+標(biāo)準(zhǔn)溶液。用此標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋配制試驗中所用50 mg/L及100 mg/L的Cd2+溶液。各處理試驗吸附、透析平衡后吸取透析袋內(nèi)液體，用鹽酸溶液稀釋，Cd2+濃度用原子吸收分光光度計(HITACHI Z 2000)測定。Cd2+吸附量q(mg/g)的計算公式：q=[(C0-Ct)V/m]×1 000，式中C0為吸附試驗初始Cd2+濃度(mg/L)，Ct為t吸附時刻Cd2+濃度(mg/L)，V為吸附反應(yīng)Cd2+溶液體積(ml)，m為吸附處理樣品干質(zhì)量(g)。EPS組分中蛋白質(zhì)和多糖含量(r)的計算公式：r=mt/m0，式中mt為培養(yǎng)時間t時刻EPS組分中蛋白質(zhì)和多糖的質(zhì)量(g)，m0為培養(yǎng)時間t時刻EPS干質(zhì)量(g)。

1.4.3 透射電鏡及能譜分析 將EPS、細(xì)菌菌體(不含EPS)、細(xì)菌菌體-EPS復(fù)合物懸浮液分別滴至鍍有碳膜的銅網(wǎng)微柵上，自然干燥后，在透射電鏡(HITACHI HT7700)95 kV加速電壓下進(jìn)行觀察，并進(jìn)行能譜分析。

1.4.4 細(xì)菌生長曲線的測定 在不同時間點(diǎn)上測定發(fā)酵液的OD600值，以時間為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)菌生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠟樣芽孢桿菌A-15生長曲線

從圖1可以看出，蠟樣芽孢桿菌A-15在0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L Cd2+脅迫條件下均可生長，但隨著Cd2+濃度增加，在 0～48 h內(nèi)，菌體延遲生長期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定生長期時間均有所變化。相同培養(yǎng)時間下，0 mg/L、50 mg/L Cd2+脅迫下菌體光密度值均有所下降，0 mg/L Cd2+下，菌體延遲生長期較短，較快進(jìn)入對數(shù)生長期，16 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長期。在50 mg/L、100 mg/L Cd2+下菌體延遲生長期明顯延長，分別在4 h、8 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，20 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長期，但在穩(wěn)定生長期菌體光密度值仍有小幅度增加。0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L Cd2+濃度下菌體生長最大光密度值分別為229、210、196。50 mg/L、100 mg/L高濃度Cd2+下菌體生長40 h后光密度值有所下降，但下降幅度并不明顯，可能與菌體分泌胞外聚合物吸附Cd2+，從而降低了Cd2+對菌體的毒害作用有關(guān)。

圖1 蠟樣芽胞桿菌A-15在不同Cd2+濃度下的生長曲線Fig.1 The growth curves of Bacillus cereus A-15 under different Cd2+ concentrations

2.2 蠟樣芽孢桿菌胞外聚合物(EPS)生成量變化曲線

從圖2可以看出，蠟樣芽胞桿菌A-15在不同Cd2+濃度脅迫條件下分泌的EPS產(chǎn)量隨培養(yǎng)時間而變化。0 mg/L Cd2+濃度下，菌體經(jīng)過較短時間就進(jìn)入快速分泌時期，12 h左右達(dá)到EPS穩(wěn)定生成時期，最大產(chǎn)生量為1.707 g/L。50 mg/L、100 mg/L Cd2+濃度下菌體20 h、40 h后進(jìn)入EPS穩(wěn)定生成階段，但EPS生成量仍有一定幅度的增長，最大產(chǎn)生量分別為1.614 g/L、1.644 g/L，可能與不同濃度Cd2+對菌體細(xì)胞誘導(dǎo)分泌EPS有關(guān)。通過對比EPS生成量變化曲線與生長曲線發(fā)現(xiàn)，EPS產(chǎn)量變化與生長曲線呈一定耦合相關(guān)性，說明蠟樣芽胞桿菌A-15分泌EPS與菌體生長緊密聯(lián)系。

圖2 蠟樣芽胞桿菌A-15在不同Cd2+濃度下EPS生成量變化Fig.2 Change of production of extracellular polymeric substances(EPS) by Bacillus cereus A-15 under different Cd2+ concentrations

2.3 EPS組成成分及定量分析

從EPS生成量變化曲線中可以看出，菌體培養(yǎng)8 h后，EPS開始快速生成，因此從8 h開始，每隔4 h，分別提取EPS，測定EPS中多糖和蛋白質(zhì)含量，分析EPS中多糖及蛋白質(zhì)在不同培養(yǎng)時間含量的變化情況。

從圖3可以看出，蠟樣芽胞桿菌A-15在不同培養(yǎng)時間生成的EPS組分主要為多糖和蛋白質(zhì)，其含量之和占EPS干質(zhì)量的 68%～87%，其余可能為核酸、有機(jī)碳等有機(jī)物質(zhì)。多糖及蛋白質(zhì)在 8～48 h內(nèi)緩慢變化，蛋白質(zhì)在EPS中所占比例高于多糖。8～48 h菌體生長期內(nèi)多糖占EPS干質(zhì)量的28%至34%，蛋白質(zhì)占EPS干質(zhì)量的40%至55%。多糖在16 h及36 h時含量最高，為34%；蛋白質(zhì)在20 h時含量最高，為55%。在 8～48 h生長期內(nèi)，多糖及蛋白質(zhì)之和所占EPS比例相對穩(wěn)定，并且在一定范圍內(nèi)變化，但比例沒有明顯規(guī)律。

圖3 EPS中多糖及蛋白質(zhì)在不同培養(yǎng)時間含量的變化Fig.3 Changes of polysaccharide and protein content at different incubation time

2.4 EPS、細(xì)菌菌體(不含EPS)、細(xì)菌菌體-EPS復(fù)合物對Cd2+的吸附量

分別于蠟樣芽胞桿菌A-15液體培養(yǎng)穩(wěn)定生長期制備EPS、細(xì)菌菌體(不含EPS)、細(xì)菌菌體-EPS復(fù)合物。利用EPS、細(xì)菌菌體(不含EPS)、細(xì)菌菌體-EPS復(fù)合物于100 mg/L Cd2+溶液中振蕩吸附，間隔40 min測定各組分對Cd2+的吸附量。

圖4顯示，EPS、細(xì)菌菌體(不含EPS)、細(xì)菌菌體-EPS復(fù)合物對Cd2+均表現(xiàn)一定的吸附能力，菌體(不含EPS)對Cd2+吸附能力較弱，在Cd2+溶液中吸附40 min后達(dá)到平衡狀態(tài)，吸附量在80 mg/g至110 mg/g之間。細(xì)菌菌體-EPS復(fù)合物對Cd2+的吸附能力最強(qiáng)，在Cd2+溶液中吸附120 min后達(dá)到吸附平衡，最大吸附量為322 mg/g，并且在 120～360 min內(nèi)吸附能力基本穩(wěn)定。EPS對Cd2+的吸附能力介于細(xì)菌菌體(不含EPS)與細(xì)菌菌體-EPS復(fù)合物之間，吸附時間200 min時最大吸附量為265 mg/g。由上述結(jié)果可以看出，在Cd2+吸附處理過程中，EPS吸附作用效率最高，在細(xì)菌菌體-EPS復(fù)合物對Cd2+吸附過程中貢獻(xiàn)最大，貢獻(xiàn)率約為83%，不含EPS的細(xì)菌菌體也有一定的Cd2+吸附能力，可能與菌體表面存在的化學(xué)基團(tuán)有關(guān)。

圖4 EPS、細(xì)菌菌體(不含EPS)、細(xì)菌菌體-EPS復(fù)合物對Cd2+的吸附Fig.4 Adsorption of Cd2+ by EPS, Bacillus cereus A-15 and Bacillus cereus A-15(excluding EPS)

2.5 吸附Cd2+前后菌體及EPS的透射電鏡-X射線光散射能譜(SEM-EDX)

由于吸附時間200 min時，EPS、細(xì)菌菌體(不含EPS)對Cd2+的吸附量達(dá)到最大，因此選擇此時的EPS、細(xì)菌菌體(不含EPS)進(jìn)行透射電鏡分析及能譜分析。將EPS溶液及細(xì)菌菌體(不含EPS)懸浮液分別滴至于鍍有碳膜的銅網(wǎng)微柵上，自然干燥后，在透射電鏡95 kV加速電壓下進(jìn)行觀察，并進(jìn)行能譜分析。結(jié)果顯示，EPS、細(xì)菌菌體(不含EPS)對Cd2+均有吸附。從圖5可以看出，吸附Cd2+前蠟樣芽孢桿菌菌體呈桿狀，有鞭毛，且鞭毛呈相互纏繞狀，菌體大小為 1.0～1.1 μm×3.5～4.2 μm；吸附Cd2+后菌體發(fā)生了明顯的變化，菌體大小為 0.65～0.80 μm×3.8～4.5 μm，主要表現(xiàn)為菌體長度變小，寬度有所增加，而且菌體鞭毛變少，菌體在電鏡下顏色變深。菌體表面能譜分析結(jié)果顯示，Cd2+吸附前菌體表面主要形成C、Ca、O、Cu、Cl吸收峰，而Cd2+吸附后菌體表面主要形成C、Cd、O、P、Cu、Cl吸收峰，Cd吸收峰的形成是由于菌體細(xì)胞對Cd2+吸附所致，而P吸收峰強(qiáng)度有所加強(qiáng)，可能是由于Cd2+脅迫導(dǎo)致細(xì)胞膜透性發(fā)生改變，使細(xì)胞內(nèi)磷脂結(jié)構(gòu)細(xì)胞器外泄至細(xì)胞表面所致。吸附前后Ca峰被Cd峰取代是由于細(xì)胞內(nèi)含有的Ca2+與溶液中Cd2+交換至細(xì)胞表面所致。

對吸附Cd2+前后EPS進(jìn)行電鏡掃描，觀察到吸附Cd2+前EPS呈現(xiàn)碎片化狀態(tài)，吸附Cd2+后EPS呈現(xiàn)不規(guī)則狀態(tài)，并且EPS表面布滿黑色的顆粒狀物質(zhì)(圖5)。通過能譜分析發(fā)現(xiàn)，Cd2+吸附前EPS主要形成C、Ca、O、Cu、W吸收峰，而Cd2+吸附后菌體表面主要形成C、Cd、O、P、Cu、W吸收峰。吸附Cd2+前EPS存在Ca吸收峰，可能是由于EPS中蛋白質(zhì)與Ca特異性結(jié)合形成鈣調(diào)蛋白所致，吸附后Ca2+結(jié)合位點(diǎn)被Cd2+取代。

A：吸附Cd2+前菌體(×4 000)及X射線光散射能譜；B：吸附Cd2+后菌體(×4 000)及X射線光散射能譜；C：吸附Cd2+前EPS(×4 000)及X射線光散射能譜；D：吸附Cd2+后EPS(×4 000)及X射線光散射能譜。圖5 菌體(不含EPS)、EPS吸附Cd2+前后電鏡掃描及能譜分析Fig.5 The SEM-EDX analysis of Bacillus cereus A-15 (excluding EPS) and EPS before and after adsorption Cd2+

3 討 論

本研究利用1株分離自鎘污染土壤中的耐鎘蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)A-15，通過液體培養(yǎng)及吸附試驗，研究了Cd2+脅迫下蠟樣芽胞桿菌生長及其EPS的產(chǎn)生規(guī)律、產(chǎn)量、組成，以及菌體及EPS對Cd2+吸附作用的影響。蠟樣芽胞桿菌在不同Cd2+濃度脅迫下均可生長，隨著Cd2+濃度的增加，各生長時期有所延后。胞外聚合物(EPS)產(chǎn)量與菌體生長密切相關(guān)，有一定耦合性。EPS主要成分為多糖和蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)含量高于多糖含量。EPS最大生成量為1.707 g/L，多糖與蛋白質(zhì)含量之和占EPS干質(zhì)量的68%～87%。

蠟樣芽孢桿菌A-15菌體及其EPS對Cd2+均有一定吸附能力，對Cd2+的吸附能力大小順序為細(xì)菌菌體-EPS復(fù)合物>EPS>細(xì)菌菌體(不含EPS)。透射電鏡-X射線光散射能譜(SEM-EDX)分析結(jié)果顯示，蠟樣芽孢桿菌吸附Cd2+后細(xì)胞形態(tài)及表面結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，吸附后細(xì)胞表面形成Cd2+吸收峰，EPS吸附Cd2+后表面形成不規(guī)則的含有Cd2+的顆粒狀物質(zhì)。

以上研究結(jié)果表明，蠟樣芽孢桿菌A-15菌體及其EPS對重金屬Cd2+具有很好的吸附效果，這為當(dāng)前日益嚴(yán)重的農(nóng)田重金屬污染治理，提供了一種綠色、高效的途徑。該細(xì)菌菌體對高濃度Cd2+具有較高耐受性，且EPS生成量受Cd2+濃度影響較小，通過細(xì)胞表面吸附沉淀及細(xì)胞內(nèi)積累作用，以及EPS表面吸附及離子置換作用，可使環(huán)境中Cd2+濃度降低，達(dá)到修復(fù)重金屬污染的目的。

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