李井春，李 琦，韓淑敏，張 帆，孫思怡，李雁冰，魏國生

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319）

豬在配種和人工授精 （artificial insemination，AI）后，有45%左右的精子通過子宮頸回流而喪失［1-2］。此外，大部分精子由于精液誘導的子宮局部免疫反應而被子宮內的嗜中性粒細胞（PMNs）清除［3］。雖然T淋巴細胞、巨噬細胞和PMNs是健康非懷孕豬子宮上皮中的主要白細胞類型，但在發(fā)情期和發(fā)情間期只有PMNs數量顯著增加［4］。由人工授精引發(fā)的大量PMNs進入子宮腔［5］，AI后24 h內將生殖道精子數減少至1%［6］。目前，調控PMNs向子宮腔快速趨化移動和吞噬活性的機制還不清楚。

如何調控PMNs的快速趨化及對精子的吞噬，已成為人工授精技術研究的熱點之一。有研究報道，咖啡因在一定程度上能夠有效抑制PMNs對精子的趨化和吞噬作用［7］。此外，通常用作抗凝血劑的肝素可以刺激公牛精子獲能，并且被證實可以抑制兔PMNs的吞噬作用［8-10］。然而，關于肝素對豬PMNs吞噬作用和公豬精子趨化性影響的研究鮮有報道。

該研究主要應用趨化小室檢測豬嗜中性粒細胞對精子的趨化性，利用共培養(yǎng)方法檢測PMNs對精子的吞噬性，以探究不同濃度的肝素對豬PMNs趨化和吞噬活性的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品和培養(yǎng)液

Histopaque-1077、肝素 （heparin）等均購自Sigma公司。采用TL-HEPES-PVA培養(yǎng)液進行體外培養(yǎng)試驗 （由黑龍江八一農墾大學動物繁殖學實驗室提供的改良配方配制）。

1.2 豬PMNs的準備

采用前腔靜脈采血法，采集健康大白母豬（由黑龍江八一農墾大學豬場提供）血液10～20 mL，經檸檬酸鹽抗凝處理后于4℃條件下保存，并在2 h內運回實驗室；將血液在1 000×g、4℃條件下離心10 min，收集血漿和血細胞之間的白色PMNs層，置于15 mL干燥無菌離心管中，重復上述操作3次。收集含有PMNs的混合液用D-PBS稀釋，并在4℃條件下以320×g離心10 min，取上清液用4 mL的PBS稀釋，待用。將稀釋的混合液小心放到預先制備的Histopaque-1077（3 mL）液面上并離心（400×g、30 min、25 ℃）。離心后，將上清液（主要包括巨噬細胞和淋巴細胞）去除，剩下的是PMNs和血細胞，用紅細胞溶解液 （150 mmol/L NH4Cl、12 mmol/L KHCO3、0.13 mmol/L EDTA）溶解紅細胞，直至將所有的紅細胞溶解，剩下PMNs為止，最后用PBS洗滌3次，置于4℃冰箱中保存，備用。

1.3 精子的準備

通過手握法收集4頭公豬（長白公豬）精液中富含精子的部分 （30～50 mL）。精液用改良的Modena溶液稀釋5倍，在收集后2 h內將稀釋后的樣品運送到實驗室。 通過離心（750×g，3 min）洗滌1次后，將精子以1×107細胞/mL的濃度重懸于TL-HEPES-PVA溶液中。分別利用LIVE/DEAD精子活力試劑盒和常規(guī)顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)精子的活率和活力分別為（91.5±1.8）%和（81.5±2.4）%，精子質量符合后續(xù)試驗要求。

1.4 血清的制備

當采取黃體期的豬靜脈血制備PMNs時，分別收集4頭母豬的血漿，并在4℃下以1 000×g離心10 min?；厥丈锨逖宀⒃?20℃下儲存直至使用。在56℃下熱處理30 min使血清（5 mL）試樣滅活，然后在-20℃下貯存，備用。

1.5 PMNs的吞噬試驗

根據Matthijs等［11］報道的方法做部分調整。取四孔培養(yǎng)皿，加入PMNs以及含有不同濃度肝素（0、100、500、1 000 μg/mL） 的 TL-HEPES-PVA 培養(yǎng)液80 μL，之后培養(yǎng)皿中放入預先準備好的精子20 μL，與 PMNs液混合，PMNs和精子的最終濃度分別為 8×106細胞/mL和 2×106細胞/mL， 最后置于38.5℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min。向培養(yǎng)后的混合液中滴加100 μL的肝素充分混合，用移液器吸取少量樣本制片，在400倍顯微鏡下觀察PMNs的吞噬率 （每個樣本至少觀察200個以上的PMNs），最后計算PMNs對精子的吞噬率。

1.6 PMNs的趨化性測定

利用Blind well chamber進行PMNs的趨化性試驗［12］。根據試驗設計，在趨化小室的下層小室放入待測的樣品（含精子、卵黃和豬精漿等）100 μL，之后放入膜孔徑8 μm的膜（市售），然后安裝趨化小室的上層并在上層添加100 μL含1×107細胞/mL PMNs的TL-HEPES-PVA培養(yǎng)液，最后將整個趨化小室放到38.5℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90 min，培養(yǎng)完成后，取出趨化小室，棄去上層小室中的PMNs液，將孔徑8 μm的膜取出，用PBS洗滌除去附著于膜表面的PMNs，置于載玻片上，自然干燥，然后用固定液固定15 min，風干后用吉姆薩染液染色20 min，然后用水漂洗至無殘留液，再用固定液固定制片封存，待鏡檢。

2 結果與分析

2.1 不同濃度的肝素對豬PMNs吞噬性的影響

從圖1可以看出，在血清存在的條件下，添加不同濃度的肝素可以降低血清刺激PMNs對精子的吞噬活性（P＜0.01）。隨著肝素濃度的增加，PMNs的吞噬率呈下降趨勢，當肝素濃度為1 000 μg/mL時，豬PMNs對精子的吞噬率最低。但是，在培養(yǎng)液中添加 100 μg/mL 和 500 μg/mL 肝素時，PMNs對精子的吞噬活性在二者之間沒有顯著差異 （P＞0.05）。

圖1 不同濃度的肝素對豬PMNs吞噬精子活性的影響

2.2 不同濃度的肝素對豬PMNs趨化性的影響

從表1可以看出，當在培養(yǎng)室的上部添加100、500、1 000 μg/mL 的肝素進行趨化活性檢測時，隨著肝素濃度的增加，PMNs趨化性指數呈下降趨勢（P＜0.05），而在添加量為 100 μg/mL 和 500 μg/mL肝素時沒有顯著差異（P＞0.05）。添加1 000 μg/mL肝素時，PMNs的趨化性指數最低 （P＜0.05）。

表1 不同濃度的肝素對豬PMNs趨化性的影響

3 討論

研究表明，通過添加新鮮血清可顯著刺激PMNs的趨化活性，但熱滅活血清不會增加PMNs的趨化活性，因此，該研究利用新鮮血漿作為激活豬PMNs活性的激活劑。肝素在采集血液白細胞時通常用作抗凝血劑。肝素抑制PMNs吞噬作用的機制是肝素與質膜結合并屏蔽了配體，包括與PMNs結合的配體。在該研究中，肝素不僅顯著降低了豬PMNs的吞噬活性，而且顯著降低了PMNs的趨化活性，因此，似乎肝素抑制了PMNs的凝集與結合，也改變了PMNs的功能，從而降低其了遷移能力。肝素也被用做在體外誘導精子獲能［8］。超活化是精子獲能的標志［13-14］。非?；钴S的精子可能難以被PMNs吞噬。然而，在該研究中，即使肝素僅在培養(yǎng)室的上部（含有PMNs），PMNs的趨化活性也顯著降低。此外，當精子與PMNs共培養(yǎng)時，肝素對吞噬精子的PMNs發(fā)生率的影響較大，尤其是當肝素濃度為1 000 μg/mL時，PMNs對精子的吞噬率最低，因此，筆者推測吞噬精子的PMNs百分比下降，不是由于肝素誘導的獲能引起的活化精子增加，而是由于肝素使得PMNs的活性降低。

參考文獻：

［1］STEVERINK D W，SOEDE N M，BOUWMAN E G，et al.Semen backflow after insemination and its effect on fertilisation results in sows ［J］.Animal Reproduction Science，1998，54（2）：109-119.

［2］MATTHIJS A，HAKZE R，POSTMA A，et al.Leukocyte recruitment and phagocytosis of boar spermatozoa［M］//JOHNSON L A，GUTHRIE H D.BoarSemen Preservation Ⅳ.Lawrence：Allen Press，2000：35-41.

［3］WOELDERS H，MATTHIJS A.Phagocytosis of boar spermatozoa in vitro and in vivo ［J］.Reproduction Supplement，2001，58：113-127.

［4］KAEOKET K，PERSSON E，DALIN A M.The sow endometrium at different stages of the oestrous cycle：studies on morphological changes and infiltration by cells of the immune system［J］.Animal Reproduction Science，2001，65（1/2）：95-114.

［5］PURSEL V G，SCHULMAN L L，JOHNSON L A.Distribution and morphology of fresh and frozenthawed sperm in the reproductive tract of gilts after artificial insemination ［J］.Biology of Reproduction，1978，19（1）：69-76.

［6］FIRST N L，SHORT R E，PETERS J B，et al.Transport and loss of boar spermatozoa in the reproductive tract of the sow ［J］.Journal of Animal Science，1968，27 （4）：1037-1040.

［7］LI J C，F(xiàn)UNAHASHI H.Effect of blood serum，caffeine and heparin on in vitro phagocytosis of frozen-thawed bull sperm by neutrophils derived from the peripheral blood of cows ［J］.Theriogenology，2010，74 （4）：691-698.

［8］PARRISH J J，SUSKO-PARRISH J,WINER M A，et al.Capacitation of bovine sperm by heparin ［J］.Biology of Reproduction，1988，38（5）：1171-1180.

［9］VICTOR M，WEISS J，ELSBACH P.Heparin inhibits phagocytosisby polymorphonuclearleukocytes ［J］.Infection and Immunity，1981，32（1）：295-299.

［10］李井春，李雁冰，舟橋弘晃.豬精漿和卵黃調控體外牛嗜中性粒細胞對精子的趨化和吞噬活性的研究［J］.中國畜牧雜志，2013，49（11）：27-30.

［11］MATTHIJS A，HARKEMA W，ENGEL B，et al.In vitro phagocytosis of boar spermatozoa by neutrophils from peripheral blood of sows［J］.Journal of Reproduction and Fertility，2000，120（2）：265-273.

［12］李井春，李雁冰.咖啡因、雙丁酰環(huán)磷腺苷調控體外豬嗜中性粒細胞對精子吞噬性的研究［J］.中國畜牧雜志，2013，49（3）：28-30.

［13］CHAMBERLAND A，F(xiàn)OURNIER V，TARDIF S，et al.The effect of heparin on motility parameters and protein phosphorylation during bovine sperm capacitation ［J］.Theriogenology，2001，55（3）：823-835.

［14］潘興翠，張恒信，石傳林.提高種公豬精液品質的技術措施［J］.黑龍江動物繁殖，2017，25（2）：11-12.