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(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

0 引言

雞毒支原體(Mycopiasma Galliscepticum, MG)是引起雞慢性呼吸道病(chronic respiratory disease, CRD)的主要病原，發(fā)病特征主要以出現(xiàn)呼吸道啰音、咳嗽、流鼻涕為主要癥狀，引起雞呼吸道黏膜卡他性炎癥，造成幼雞生長(zhǎng)發(fā)育受阻，種雞產(chǎn)蛋量、受精率和孵化率下降。支原體感染一般發(fā)病率高，死亡率低，但也可出現(xiàn)10%～30%,甚至更高的死亡率。MG通過(guò)降低病雞免疫力，引起其他病原微生物的混合感染，增加雞群的病死率，嚴(yán)重影響了養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展[1-2]。MG傳染性極強(qiáng)，傳播方式多，途徑廣泛。一方面通過(guò)空氣塵埃、飛沫核以及飲水和飼料水平傳播，另一方面，隨種蛋和精液垂直傳播，此外，注射被MG污染的疫苗也會(huì)引起感染[3]。感染后病雞沒(méi)有明顯的特征癥狀，因此可長(zhǎng)期持續(xù)存在于雞群中?？刂芃G感染的最根本有效方法就是對(duì)感染雞群進(jìn)行及時(shí)準(zhǔn)確的檢測(cè)和診斷，凈化雞群，從根本上切斷MG流行。因此建立一種簡(jiǎn)單、快速的MG檢測(cè)方法尤為重要。

目前，MG檢測(cè)方法主要有分離培養(yǎng)法、DNA熒光染色法、電鏡法、血清學(xué)方法等[4]。此外，分子生物學(xué)診斷方法如核酸探針?lè)?、聚合酶鏈反?yīng)(Polymerase Chain Reaction ，PCR)等也被廣泛應(yīng)用到雞毒支原體的檢測(cè)，PCR技術(shù)比培養(yǎng)法快速、簡(jiǎn)單、靈敏，對(duì)某些難以用培養(yǎng)法和血清學(xué)方法檢測(cè)的支原體，PCR技術(shù)有明顯的優(yōu)勢(shì)，因此廣泛應(yīng)用于支原體的實(shí)驗(yàn)室診斷。1998年屈小玲等[5]建立了 PCR檢測(cè) MG的方法，其結(jié)果最低能檢出18 pg的 DNA，在MG 感染的分子流行病學(xué)調(diào)查中有重要的應(yīng)用價(jià)值。周云雷等[6]針對(duì)MG pvpA基因建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MG的方法，20 μL的體系中其最低檢測(cè)限為72拷貝，并具有較高的特異性、穩(wěn)定性和靈敏度。賈麗艷等[7]以16s rRNA基因序列建立了套式PCR檢測(cè)方法。

MG脂蛋白位于細(xì)胞膜表面，是一種由MGA0674基因編碼的脂蛋白家族2同系物，具有免疫原性，在弱毒株中表達(dá)降低，在強(qiáng)毒株Rlow敲除該基因后毒力衰減[8]。遲秀玲等[9]研究表明MG膜蛋白可直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本試驗(yàn)針對(duì)MG脂蛋白的基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并測(cè)定了其靈敏度和特異性，利用該P(yáng)CR對(duì)雞胚樣品進(jìn)行檢測(cè)，為MG的臨床診斷提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種和主要試劑

雞毒支原體(Mycoplasma Gallisepticum，MG)、大腸桿菌(E.coil)、豬肺炎支原體(Mhp)、新城疫病毒(NDV)、沙門(mén)氏菌(SE)，由本實(shí)驗(yàn)室保存；MEM培養(yǎng)基，購(gòu)自江蘇省宜興市賽爾生物化工廠；無(wú)菌胎牛血清、ExTaq酶、dNTPs、DL2000 Marker，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；蛋白酶K，購(gòu)自德國(guó)Merch KgaA公司;Tris-飽和酚，購(gòu)自TBD BIO公司;酵母提取物(Yeast extract)和胰蛋白胨(Tryptone)，購(gòu)自O(shè)XOID公司；瓊脂糖，購(gòu)自iowest；其他常規(guī)試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.2 主要儀器

DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；GL-20G-II型高速冷凍離心機(jī)和TGL-16G高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠；PCR儀，購(gòu)自Eppendorf公司；LDZM型立式智能壓力蒸汽滅菌器，購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠；DYY-Ⅲ電泳槽，購(gòu)自北京六一儀器廠；JEDA801E凝膠成像分析系統(tǒng)，江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司軟件；EPS-100穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.3 MG菌體培養(yǎng)

MG菌種在KM2液體培養(yǎng)基中復(fù)壯后，按照1:10接種，傳代培養(yǎng)3代后擴(kuò)大培養(yǎng)。37 ℃培養(yǎng)至培養(yǎng)物pH值降至6.6～6.8，即菌液顏色由紅色變?yōu)辄S色，無(wú)沉淀即可收獲。培養(yǎng)物經(jīng)涂片，瑞士染色，鏡檢呈多形態(tài)菌體，無(wú)雜菌，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，共傳3代。

1.4 MG脂蛋白基因的引物合成

根據(jù)文獻(xiàn)[10]，合成兩條引物，預(yù)期擴(kuò)增的產(chǎn)物大小為400 bp：

MG-LP上游引物

P1:GATTTCGAAGAATCAACTGT

MG-LP下游引物

P2:AAGGGATTAATATTCCCAAC

1.5 MG模板的制備

1.5.1 MG菌體收集

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG培養(yǎng)物，4℃ 12000 r·min-1離心10 min，棄沉淀，將上清液于4 ℃ 10000 r·min-1離心30 min，收集沉淀，用PBS(0.2 moL·L-1pH 7.2)洗滌3次，最后將沉淀用微量PBS懸浮，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 采用酚氯仿抽提法提取MG基因組DNA[11]

4 ℃ 12000 r·min-1離心10 min收集支原體，沉淀用570 μL TE緩沖液懸浮，加入10%SDS 15 μL和蛋白酶K(20 mg·mL-1)15 μL，混勻后37℃水浴作用1 h，加入等體積的苯酚：氯仿，充分混勻后，靜置30 min，4 ℃10000 r·min-1離心5 min，取上清液，沉淀用酚氯仿重新抽提1次，離心后將上清液移入一干凈Eppendorf管中，加入1/10體積的3 moL·L-1醋酸鈉，2倍體積無(wú)水乙醇，-20 ℃作用1 h，4 ℃ 10000 r·min-1離心10 min，沉淀用70%乙醇洗滌，10000 r·min-1離心10 min，棄上清，沉淀于超凈臺(tái)上風(fēng)干后，溶于30 μL TE緩沖液中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 凝膠電泳檢測(cè)MG基因組NDA

取5 μL DNA樣品于1%瓊脂糖凝膠上電泳，拍照保存；取1 μL樣品進(jìn)行濃度和光密度值測(cè)定。

1.6 PCR擴(kuò)增

1.6.1 PCR反應(yīng)體系(見(jiàn)表1)

表1 PCR反應(yīng)體系

1.6.2 PCR反應(yīng)條件

95 ℃ 10 min

72 ℃ 5 min

將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)，紫外燈下觀察，與標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker條帶進(jìn)行比較，判斷是否與預(yù)期大小一致，其余產(chǎn)物于-20 ℃保存，凝膠成像系統(tǒng)中拍照保存。

1.7 PCR反應(yīng)的靈敏度檢測(cè)

用TE緩沖液(pH 8.0)對(duì)濃度為195.7 ng·μL-1的 DNA模板進(jìn)行10倍的倍比稀釋，共設(shè)8個(gè)濃度稀釋度，采用上述PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)其靈敏度。

1.8 PCR反應(yīng)的特異性檢測(cè)

取已制備好的雞毒支原體(MG)、沙門(mén)氏菌(SE)、大腸桿菌(E.coli)、豬肺炎支原體(Mhp)、雞新城疫病毒(NDV)的DNA或cDNA，在上述PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)，進(jìn)行特異性檢測(cè)。

1.9 樣品的檢測(cè)

1.9.1 雞胚(尿囊液)樣品模板DNA的制備

提取方法參考文獻(xiàn)[12]，并稍有改動(dòng)。抽取尿囊液1000 μL在4 ℃12000 r·min-1離心5 min；棄上清，取沉淀加30 μL TE溶液，重懸后煮沸10 min，再次離心，取上清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9.2 樣品PCR檢測(cè)

隨機(jī)抽取樣品25個(gè)，用上述PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA測(cè)定結(jié)果

通過(guò)微量蛋白核酸測(cè)定儀測(cè)定基因組DNA濃度為195.7 ng·μL-1，OD260/OD280值為2.07；瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可見(jiàn)，電泳條帶清晰無(wú)拖尾，符合PCR擴(kuò)增條件，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 MG基因組DNA

注：1-5:MG基因組DNA

2.2 MG脂蛋白基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由圖2可見(jiàn)電泳條帶與預(yù)期結(jié)果(400 bp)相符，利用此PCR條件和體系擴(kuò)增出了MG脂蛋白基因。

圖2 MG脂蛋白基因的PCR擴(kuò)增

注：M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-4：PCR產(chǎn)物

2.3 靈敏度檢測(cè)

以不同濃度稀釋后的MG基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖中可見(jiàn)，1-7擴(kuò)增出了400bp大小的目的片段，初始濃度為195.7 ng·μL-1的 DNA模板經(jīng)107倍稀釋后，未能擴(kuò)增出目的片段。經(jīng)計(jì)算得最低檢出濃度為0.2 pg·μL-1。

圖3 PCR反應(yīng)的靈敏度檢測(cè)

注：M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn); 1-9：100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀釋度

2.4 特異性檢測(cè)

按上述反應(yīng)體系及條件，分別用雞毒支原體、大腸桿菌、豬肺炎支原體、新城疫病毒、沙門(mén)氏菌的基因組DNA為模板，作PCR反應(yīng)特異性檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 PCR反應(yīng)的特異性檢測(cè)

注：M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-5：雞毒支原體，大腸桿菌、豬肺炎支原體、新城疫病毒、沙門(mén)氏菌

由圖4可見(jiàn)，只有以MG基因組DNA為模板擴(kuò)增出與預(yù)期相符的目的條帶，其他均未擴(kuò)增出條帶，說(shuō)明PCR反應(yīng)的特異性較好。

2.5 樣品檢測(cè)

制備雞胚樣品DNA模板后，PCR法檢測(cè)雞胚樣品中有無(wú)MG污染，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品檢測(cè)結(jié)果 %

在隨機(jī)抽檢的25份樣品中，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示有17份擴(kuò)增出了特異性條帶，核酸陽(yáng)性率達(dá)76%，部分瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 部分雞胚樣品檢測(cè)結(jié)果

注：M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:陽(yáng)性對(duì)照；2：陰性對(duì)照；3-10：雞胚樣品

3 討論與結(jié)論

MG分類學(xué)上屬于支原體科支原體屬，無(wú)細(xì)胞壁，僅細(xì)胞膜包裹，目前只發(fā)現(xiàn)一個(gè)血清型，但各個(gè)分離株之間的致病性和趨向性不一致[13]。有研究證實(shí)支原體具有顯著改變抗原成分以逃避宿主免疫反應(yīng)的能力，使致病支原體在感染期間持續(xù)存活于雞群[14-17]，給MG的診斷帶來(lái)了很大的困難。

MG污染檢測(cè)的傳統(tǒng)方法主要有病原分離和血清學(xué)診斷如血清平板凝集試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等，但這些方法存在MG分離困難，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，成本高，假陽(yáng)性等問(wèn)題，在實(shí)際養(yǎng)禽生產(chǎn)應(yīng)用中均受到一定的限制。2015年，寧官保[18]等首次建立了MG膠體金免疫層析試紙條診斷雞MG感染，具有很好的準(zhǔn)確性、靈敏性和特異性，但制作成本高，生產(chǎn)受限，目前難以在生產(chǎn)線大規(guī)模生產(chǎn)。

近二十年來(lái)，PCR法在MG的污染檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用，出現(xiàn)了許多針對(duì)MG特異性片段檢測(cè)方法。目前使用PCR檢測(cè)MG主要包括常規(guī)的PCR擴(kuò)增以及斑點(diǎn)雜交法、套式PCR擴(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)方法。針對(duì)MG16srRNA，賈麗艷[19]等在2005年建立PCR檢測(cè)方法，但易出現(xiàn)假陰性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。張映[20]等采用地高辛標(biāo)記探針檢測(cè)MG的斑點(diǎn)雜交法特異性較好，但操作過(guò)程繁瑣，實(shí)驗(yàn)試劑昂貴，增加了檢測(cè)成本。周云雷等針對(duì)pvpA建立的實(shí)時(shí)熒光定量方法因熒光易與引物二聚體結(jié)合，增加了假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)以及鑒別引物二聚體的困難。黎敏[21]等針對(duì)pMGA基因建立的多重套式PCR擴(kuò)增方法特異性好，敏感度高，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

如前言所述，MG脂蛋白具有較好的特異性，在MG致病機(jī)理中發(fā)揮重要作用。本研究針對(duì)MG脂蛋白基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行了PCR反應(yīng)的靈敏度和特異性檢測(cè)。結(jié)果顯示，該P(yáng)CR法特異性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單快捷，實(shí)驗(yàn)條件要求低，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，可同時(shí)檢測(cè)多份樣品，在MG污染檢測(cè)中可行、易推廣。

實(shí)驗(yàn)中樣品選擇雞胚，是由于隨著近年來(lái)隨著生物制品的快速發(fā)展，尤其是雞群疫苗的制備是以雞胚為原型，若用感染或污染的不合格雞胚會(huì)影響疫苗的質(zhì)量，故對(duì)隨機(jī)抽檢的雞胚樣品中的MG進(jìn)行檢測(cè)，以防MG的進(jìn)一步感染。隨機(jī)檢測(cè)的25份樣品中，陽(yáng)性檢出率為76%。該P(yáng)CR法為MG的預(yù)防和臨床檢測(cè)提供了一定的理論參考。

[1] 蔣紅霞,陳杖榴,鄧旭明,等.MG敏感株與耐藥株超微結(jié)構(gòu)的比較[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2004,26(6):439-442.

[2] Nakamura K, Ueda, Tanimural T, et al. Effect of mixed live vaccine(Newcastle disease and infectious bronchitis) and Mycoplasma gallisepticum on the chicken respiratory tract and on Escherichia coli infection[J].J Comp Pathol.1994,111(1):33-42.

[3] 王廷鴻.MG感染診斷方法與防治[J].中國(guó)動(dòng)物保健,2016,37(7):106-110.

[4] 陳繼榮,曾振靈,鄧碧琴,等.臨床分離MG粘附素蛋白編碼基因pvpA的分子特征[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,41(8):2467-2473.

[5] 屈小玲,畢丁仁.雞毒霉形體感染的PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J],華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1998,17(5): 70-75.

[6] 周云雷,魏飛龍,李健,等.雞毒支原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J],中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,44(11):2371-2378.

[7] 賈麗艷,逯曉敏,張映.兩步PCR法檢測(cè)雞新城疫疫苗中MG污染的研究[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008,28(3):316-319.

[8] Szczepanek S M, Frasca S Jr, Schumacher V L, et al. Identification of lipoprotein MslA as a neoteric virulence factor of Mycoplasma gallisepticum[J].Infect Immun,2010,78(8):3475-3483.

[9] 遲秀玲,嚴(yán)奉祥.支原體引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制[J].國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志,2006,26(6)：546-549.

[10] Serpil Kahya, Seran Temelli, Aysegul Eyigor, et al. Real-time PCR culture and serology for the diagnosis of Mycoplasma gallisepticum in chicken breeder flocks[J]. Veterinary Microbiology,2010,144(3-4):319-324.

[11] 謝志勤,謝芝勛,龐耀珊,等.應(yīng)用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)雞毒支原體、雞滑液囊支原體和禽衣阿華支原體的研究[J],畜牧與獸醫(yī),2000,32(5):4-6.

[12] 王嘉力, 賈存靈, 蘇利紅, 等. 家雞CHD1 基因PCR 快速性別鑒定方法的建立及其在早期雞胚中的應(yīng)用[J], 家禽科學(xué)2009,(12):3-7.

[13] 張磊.雞毒支原體JN株的分離鑒定及PCR檢測(cè)方法的建立[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[14] 寧宜寶.雞群健康的潛在殺手――MG病的防制[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2003,39(10):44-46.

[15] Boguslavsky S, Menaker D, Lysnyansky I, et al. Molecular characterization of the Mycoplasma gallisepticum pvpA gene which encodes a putative variable cytadhesin protein[J].Infection and Immunity,2000,68(7):3956-3964.

[16] Liu T, Garcia M, Levisohn S, et al. Molecular variability of the adhesin-encoding gene pvpA among Mycoplasma gallisepticum strains and its application in diagnosis[J].Journal of Clinical Microbiology,2001,39(5):1882-1888.

[17] Reinhardt A K, Gautier-Bouchardon A V, Gicquel-Bruneau M, et al. Persistence of Mycoplasma gallisepticum in chickens after treatment with enrofloxacin without development of resistance[J].Veterinary Microbiology,1998,106(20):129-137.

[18] 寧官保,劉國(guó)莉,張鼎,等.MG膠體金免疫層析試紙條的研制和初步應(yīng)用[J],動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,36(5):25-28.

[19] 賈麗艷,李彥明,張映.獸用疫苗支原體污染的PCR檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用[J],動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2005, 26(6):55-58.

[20] 馬艷琴,張映.斑點(diǎn)雜交法在雞毒支原體污染檢測(cè)中的應(yīng)用[J], 中國(guó)畜牧獸醫(yī),2010,37(3):201-203.

[21] 黎敏,管鳳霞,劉玲,等.應(yīng)用多重套式PCR檢測(cè)雞毒支原體和雞滑液囊支原體[J], 廣東畜牧獸醫(yī)科技2010, 35(4)：34-36.