鄺少松，楊 林，嚴(yán)家榮，譚巧燕，代路路，唐小江

(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 佛山 528248)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種慢性、多系統(tǒng)受累的自身免疫性疾病[1]，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，突出表現(xiàn)為多種自身抗體并通過(guò)免疫復(fù)合物等途徑誘導(dǎo)的炎癥免疫反應(yīng)，而炎癥通路的激活、炎癥細(xì)胞(特別是巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞)的浸潤(rùn)及炎癥因子的表達(dá)發(fā)揮著重要作用[2-4]。研究表明，白細(xì)胞介素(interleukin, IL)、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 等細(xì)胞因子參與SLE的發(fā)病過(guò)程，尤其以T、B淋巴細(xì)胞免疫紊亂、產(chǎn)生大量的自身抗體為特征[5]。T淋巴細(xì)胞是高度異質(zhì)性的群體，根據(jù)發(fā)育的過(guò)程中出現(xiàn)的分化抗原的不同，可分為CD4+T和CD8+T細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞的功能主要是通過(guò)其分泌的細(xì)胞因子介導(dǎo)的。MRL/lpr小鼠作為一種研究狼瘡發(fā)病的代表性動(dòng)物模型，在16周齡自發(fā)產(chǎn)生與人類(lèi)疾病類(lèi)似的狼瘡癥狀[6]。本研究選取了4種細(xì)胞因子(IL-2、IL- 4、IL-17、TNF-α)和T淋巴細(xì)胞的主要表面標(biāo)志CD4和CD8進(jìn)行檢測(cè)，目的在于對(duì)不同月齡的MRL/lpr小鼠和野生型小鼠進(jìn)行一系列免疫機(jī)制基礎(chǔ)數(shù)據(jù)比較，為日后的廣大相關(guān)領(lǐng)域的科研工作者提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

B6.MRL-FaslprNJU小鼠，C57小鼠，SPF級(jí)雌性。3月齡體重15～18 g、4月齡體重18～22 g、5月齡體重22～25 g、6月齡體重25～28 g雌性B6.MRL-FaslprNJU小鼠各10只，3月齡15～18 g野生型雌性C57小鼠10只，共50只。購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(粵) 2013-0002]。所有實(shí)驗(yàn)在廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成[SYXK(粵) 2013-0002]，經(jīng)廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)審查，福利倫理審查證號(hào)B201404-06。

1.2 主要試劑與儀器

小鼠抗雙鏈ds-DNA抗體(IgG)、白介素IL-2、白介素IL- 4、白介素IL-17、 腫瘤壞死因子TNF-α ELISA試劑盒均購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司； Anti-CD3、Anti-CD4抗體購(gòu)自Abcam公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，型號(hào)Multiskan Go，美國(guó)Thermo Fisher公司；流式細(xì)胞儀，型號(hào)BD Accuri C6 美國(guó)BD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 解剖取材

小鼠稱(chēng)體重后，采用異氟烷吸入麻醉后摘眼球采集血液，離心，取血清置于-20℃保存；采集血液后斷頸處死，常規(guī)消毒動(dòng)物腹部皮膚，無(wú)菌打開(kāi)腹腔，取心、肝、脾、肺、腎稱(chēng)重，計(jì)算臟器系數(shù)；鈍性去除被膜取脾，脾組織分成兩份置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 指標(biāo)檢測(cè)

ELISA檢測(cè)血清中小鼠抗雙鏈ds-DNA抗體，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作；取脾組織用ELISA檢測(cè)免疫因子白介素IL-2、IL4、IL17、腫瘤壞死因子TNF-α，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作；運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞CD3含量及CD4/CD8細(xì)胞比率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同月齡MRL/lpr小鼠及正常C57BL/6小鼠臟器系數(shù)比較

與3月齡C57小鼠相比，3～6月齡MRL小鼠心臟系數(shù)、肝臟系數(shù)、肺臟系數(shù)、雙腎系數(shù)差異無(wú)顯著性(P> 0.05)，3～6月齡MRL小鼠脾臟系數(shù)均顯著升高(P< 0.05)(見(jiàn)表1)。

注：與3月齡C57小鼠比較，*P< 0.05；**P< 0.01。

Note.Compared with the 3-month old C57 mice，*P< 0.05；**P< 0.01．

表2 MRL/lpr小鼠與C57小鼠抗ds-DNA抗體水平的變化Tab.2 Changes of anti ds-DNA antibody levels in the MRL/lpr mice and C57 mice

注：與3月齡C57小鼠比較，*P< 0.05；**P< 0.01。

Note.Compared with the 3-month old C57 mice,*P< 0.05；**P< 0.01．

2.2 不同月齡MRL/lpr小鼠及正常C57BL/6小鼠抗ds-DNA抗體比較

與3月齡C57小鼠相比，3～6月齡MRL/lpr小鼠血清ds-DNA抗體濃度均顯著升高(P< 0.05)，但MRL/lpr小鼠不同月齡間ds-DNA抗體濃度之間無(wú)明顯趨勢(shì)(見(jiàn)表2)。

2.3 免疫因子白介素IL-2, IL- 4、IL17、腫瘤壞死因子TNF-α檢測(cè)

與3月齡C57小鼠相比，3～6月齡MRL/lpr小鼠白介素IL-2濃度、腫瘤壞死因子TNF-α均顯著升高(P< 0.05)，MRL/lpr小鼠不同月齡間白介素IL-2、TNF-α濃度無(wú)明顯趨勢(shì)；與3月齡C57小鼠相比，3～6月齡MRL/lpr小鼠白介素IL- 4、IL-17濃度差異無(wú)顯著性(P> 0.05)；MRL/lpr小鼠隨著月齡增大，白介素IL-17濃度顯著升高(P< 0.05)(見(jiàn)圖1 A～D)。

2.4 脾淋巴細(xì)胞CD3、CD4/CD8檢測(cè)

與3月齡C57小鼠相比， 6月齡MRL/lpr小鼠脾淋巴細(xì)胞CD3濃度顯著降低(P< 0.01)，MRL/lpr小鼠隨月齡增大CD3含量和D4/CD8比率有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)顯著性。(見(jiàn)表3)

注：(A)IL-2濃度；(B)IL- 4濃度；(C)IL-17濃度；(D)TNF-α濃度。與C57BL/6小鼠比較，*P< 0.05；與3月齡MRL/lpr小鼠比較，ΔP< 0.05，ΔΔP< 0.01。圖1 不同月齡MRL/lpr和C57BL/6小鼠血液炎癥細(xì)胞因子濃度Note.(A) Concentration of IL-2. (B) Concentration of IL- 4. (C) Concentration of IL-17. (D) Concentration of TNF-α. Compared with the C57BL/6 mice, *P< 0.05. Compared with the 3-month MRL/lpr mice, ΔP< 0.05，ΔΔP< 0.01.Fig.1 Blood concentration of inflammatory cytokines in the MRL/lpr mice and C57BL/6 mice at different ages

組別GroupsCD3(%)D4/CD8C57-3月齡3-montholdC57mice34.99±5.371.50±0.42MRL/lpr-3月齡3-montholdMRL/lprmice30.77±13.151.53±1.13MRL/lpr-4月齡4-montholdMRL/lprmice29.96±6.531.27±0.28MRL/lpr-5月齡5-montholdMRL/lprmice24.93±6.511.45±0.13MRL/lpr-6月齡6-montholdMRL/lprmice23.10±2.85**1.18±0.12

注：與3月齡C57小鼠比較，*P< 0.05；**P< 0.01。

Note.Compared with the 3-month old C57 mice，*P< 0.05；**P< 0.01．

3 討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種多系統(tǒng)、多器官受累的全身性自身免疫病，T細(xì)胞異?？赡苁荢LE發(fā)病的重要機(jī)制之一。SLE患者T細(xì)胞異常主要表現(xiàn)為輔助性T細(xì)胞(Th)活性增高，抑制性T細(xì)胞(Ts)活性下降。Th細(xì)胞按照功能可分為T(mén)h1、Th2和Th17細(xì)胞。在活動(dòng)性紅斑狼瘡中，Th細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子表達(dá)異常。Thl細(xì)胞因子水平反映的是細(xì)胞免疫功能水平，Th2細(xì)胞因子水平反映體液免疫功能，Th17細(xì)胞以分泌細(xì)胞因子IL-17為特征，Thl，Th2與Th17細(xì)胞之間的相互調(diào)節(jié)，令機(jī)體的免疫應(yīng)答處于一種精細(xì)而復(fù)雜平衡的狀態(tài)，細(xì)胞因子內(nèi)部平衡的改變導(dǎo)致機(jī)體免疫的紊亂，進(jìn)而誘導(dǎo)SLE疾病的發(fā)生和發(fā)展。IL-17能促進(jìn)炎性反應(yīng)以及加強(qiáng)機(jī)體的免疫防御功能[7]。IL-2促進(jìn)B細(xì)胞分化增殖，啟動(dòng)免疫球蛋白J鏈的翻譯合成，增強(qiáng)抗體的分泌，使B細(xì)胞分化成為能夠產(chǎn)生免疫球蛋白的活化細(xì)胞。TNF-α主要由單核巨噬細(xì)胞分泌，最主要的功能是參與機(jī)體的防御反應(yīng)，是重要的促炎癥因子和免疫調(diào)節(jié)因子，它通過(guò)抑制T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、促進(jìn)B細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的生長(zhǎng)以及誘導(dǎo)凋亡分子的產(chǎn)生等，參與自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制[8]。本研究顯示3～6月齡MRL/lpr小鼠血清IL-2和TNF-α的水平比正常小鼠顯著升高；IL- 4、IL-17的水平與正常小鼠相比差異不顯著。IL-2和TNF-α同屬Th1型細(xì)胞因子，IL- 4、IL-17分別屬于Th2、Th17型細(xì)胞因子，由此我們推測(cè)在3～6月齡MRL/lpr小鼠狼瘡樣病變發(fā)展過(guò)程中，Th1型細(xì)胞因子占優(yōu)勢(shì)，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的失衡，導(dǎo)致了機(jī)體免疫紊亂。因此，IL-2和TNF-α在MRL/lpr小鼠模型SLE疾病的發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程中起到了關(guān)鍵的作用。

CD3可表達(dá)于所有成熟T細(xì)胞表面，它是由五條肽鏈組成的復(fù)合分子，與其抗原受體(TCR)由非共價(jià)連接的方式形成完整的TCR/CD3復(fù)合體，共同參與對(duì)抗原刺激的免疫應(yīng)答，而T細(xì)胞亞群中的CD4+細(xì)胞與CD8+細(xì)胞的相互制約及平衡對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答具有重要的調(diào)節(jié)作用[9]。本研究顯示，6月齡MRL/lpr小鼠脾淋巴細(xì)胞CD3濃度顯著降低，D4/CD8比率下降，表明SLE存在T淋巴細(xì)胞失衡，T細(xì)胞功能紊亂現(xiàn)象。

抗ds-DNA抗體是一種能與天然的脫氧核糖核酸(DNA)結(jié)合的成分，它與細(xì)胞核的反應(yīng)位點(diǎn)在于DNA(外圍區(qū))脫氧核糖磷酸框架上?？筪s-DNA抗體對(duì)SLE的診斷高度特異，是紅斑狼瘡的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一，它能促進(jìn)抗原抗體復(fù)合物形成，激活補(bǔ)體，加劇了炎癥的發(fā)生，造成組織損傷[10]。本研究顯示3月齡MRL/lpr小鼠血清中的抗ds-DNA抗體濃度是正常的C57小鼠的1.7倍以上，MRL/lpr小鼠抗ds-DNA抗體的陽(yáng)性率高達(dá)90%以上，表明MRL/lpr小鼠3月齡開(kāi)始已出現(xiàn)SLE的特征，而且呈現(xiàn)出高水平的抗ds-DNA抗體。綜上，MRL/lpr小鼠是目前最常用的自發(fā)性系統(tǒng)性紅斑狼瘡動(dòng)物模型之一，研究初步表明MRL/lpr小鼠在3月齡已開(kāi)始出現(xiàn)T淋巴細(xì)胞失衡，免疫損傷的表現(xiàn)，在SLE發(fā)病發(fā)展過(guò)程中，Th1型淋巴細(xì)胞因子可能SLE免疫抑制的關(guān)鍵因素之一。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王晶晶，嚴(yán)尚學(xué)，張小丹，等. TACI融合蛋白對(duì)MRL/lpr小鼠免疫功能的作用及其部分機(jī)制 [J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011, 46(9): 865-870.

[2] Nowling TK, Gilkeson GS. Mechanisms of tissue injury in lupus nephritis [J]. Arthritis Res Ther, 2011, 13(6): 250.

[3] Gigante A, Gasperini ML, Afeltra A, et al. Cytokines expression in SLE nephritis [J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2011, 15(1): 15-24.

[4] 梁柳琴, 許韓師, 葉玉津, 等. 白細(xì)胞介素-15在狼瘡性腎炎活動(dòng)病變中的臨床意義 [J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2008, 24(8): 1581-1584.

[5] 袁敏, 慕思娟, 崔慧娟, 等. DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶在MRL/lpr狼瘡鼠CD4+T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)水平研究及功能分析 [J]. 中華風(fēng)濕病學(xué)雜志, 2009, 13(8): 521-524.

[6] Liu J, Karypis G, Hippen KL, et al. Genomic view of systemic autoimmunity in MRL/lpr mice [J]. Genes Immun, 2006, 7(2): 156-168.

[7] 秦衛(wèi)松, 劉志紅. Th17細(xì)胞與自身免疫性疾病 [J]. 腎臟病與透析腎移植雜志，2008, 17(5): 453-456.

[8] 葉倩舲, 翟志敏, 王會(huì)平, 等. 多發(fā)性骨髓瘤與系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血漿IL-2、TNF-α檢測(cè) [J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 51 (2): 255-258.

[9] 錢(qián)齊宏, 張學(xué)光, 於葛華, 等. T細(xì)胞亞群及共刺激分子表達(dá)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡免疫病理的關(guān)系 [J]. 蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2002, 22(1): 8-12

[10] 吳希國(guó)，劉秀珍，馬越. 173例系統(tǒng)性紅斑狠瘡患者ANA，ENA和ds-DNA抗體的聯(lián)合檢測(cè)分析 [J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2012, 22 (4): 781-782.