李 杰，張 賀，王 欣，黃超群，徐 玥，張 會，劉天奇

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

脂肪酶（EC 3.1.1.3）是最穩(wěn)定水解酶之一，參與多種合成與水解反應(yīng)，廣泛應(yīng)用于食品、造紙和洗滌等行業(yè)[1-3]。

脂肪酶來源廣、應(yīng)用領(lǐng)域多、需求量大，目前采用多拷貝啟動子[4-5]，多拷貝目的基因[6]，融合表達(dá)[7]，密碼子優(yōu)化[8]，加入分子伴侶[9-10]，選擇高效表達(dá)系統(tǒng)[11]等方法提高脂肪酶基因表達(dá)量。楊江科等將黑曲霉脂肪酶基因經(jīng)密碼子優(yōu)化在畢赤酵母中誘導(dǎo)表達(dá)72 h后，發(fā)酵液酶活力達(dá)176.0 U·mL-1[12]。Chen等運用RSM試驗和單因子試驗優(yōu)化Aspergillus sp.F044產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵條件，結(jié)果表明，在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，脂肪酶經(jīng)72 h發(fā)酵酶活力達(dá)32.15 U·mL-1，比出發(fā)菌株提高2.88倍[13]。李秀鵬等通過降低背景蛋白及構(gòu)建多拷貝耐熱脂肪酶（TII）基因表達(dá)載體在黑曲霉SH-2中表達(dá)，轉(zhuǎn)化子發(fā)酵上清液酶活力最高為150·U·mL-1[14]。國內(nèi)目前脂肪酶產(chǎn)量仍無法滿足工業(yè)生產(chǎn)需求，尤其是食品級脂肪酶生產(chǎn)成本高，產(chǎn)量低，純化困難，提高食品級脂肪酶產(chǎn)量是現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)難題之一。黑曲霉是最重要工業(yè)生產(chǎn)和基礎(chǔ)遺傳研究菌株[15]，用于食品級酶制劑生產(chǎn)，高效生產(chǎn)表達(dá)食品級脂肪酶發(fā)展前景良好。

試驗擬用多拷貝策略，利用同源重組技術(shù)將1～2拷貝脂肪酶基因整合到黑曲霉CICC2462中高表達(dá)酸穩(wěn)定α-淀粉酶基因（asAA）位點，以期獲得高分泌黑曲霉脂肪酶食品級工程菌。同時，研究拷貝數(shù)對目的基因在黑曲霉中高效表達(dá)影響，為提高脂肪酶表達(dá)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

A.niger CICC2462（ΔpyrGΔasAA::pyrG）、農(nóng)桿菌AGL1、載體pSZHA由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌遺傳學(xué)實驗室構(gòu)建并保存。

1.1.2 主要試劑

Primer STAR DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶（購自TaKaRa公司）；質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒（購自康為世紀(jì)生物科技有限公司）；橄欖油（Olive oil）、聚乙烯醇（Poly vinyl alcohol）、尿苷（Uridine）（購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司）；5-FOA（5-Fluoroorotic acid）（購自美國Sigma公司）；抗生素：氨芐霉素、卡那霉素、利福平等（購自Sangon公司）。其他試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器

DK-8D三溫三控水槽（購自上海百典儀器有限公司）；高速離心機（購自美國Thermo Fisher Scien?tific）;PCR儀（購自北京比朗實驗設(shè)備有限公司）；震蕩培養(yǎng)箱（購自哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（購自上海博迅實業(yè)有限公司）；FSH-2A高速可調(diào)勻漿機（購自上海旌派儀器有限公司）；pH計（購自沈陽瑞豐精細(xì)化學(xué)品有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 黑曲霉基因組提取

根據(jù)康為世紀(jì)生物科技公司生產(chǎn)基因組提取試劑盒提供說明書提取黑曲霉基因組，具體步驟如下：

①吸取培養(yǎng)基中新鮮黑曲霉菌絲，離心10 min，稱量菌絲濕重0.1 g。

②加液氮于菌絲中充分研磨至粉末后，加400 μL Buffer LP1和 6 μL RNase A，旋渦震蕩60 s，室溫靜置10 min，再加130 μL LP2，混合均勻后，旋渦震蕩1 min。

③高速離心10 min，取上清液至新EP管中，加入1.5倍體積LP3，混勻后加DM吸附柱中，離心，棄廢液。

④加500 μL GW2（加入無水乙醇）于吸附柱中，離心，棄廢液。此步驟重復(fù)兩次。

⑤將吸附柱離心2 min后，倒掉收集管中廢液，將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，徹底將酒精晾干。

⑥50 μL ddH2O加到吸附柱中，室溫靜置2～5 min后，12 000 r·min-1，離心2 min，收集DNA，于-20℃冰箱保存。

1.2.2 基因克隆

根據(jù)黑曲霉脂肪酶AnlipA（Gene ID:4988581）序列，用軟件Primer 5.0設(shè)計黑曲霉脂肪酶基因特異引物（見表1）。

以黑曲霉基因組為模板，用引物P1和P2作PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pMD-19T（TaKaRa）并測序。

1.2.3 表達(dá)載體構(gòu)建

將本實驗室已有質(zhì)粒pT-6R與pT-6R-Tgla分別用ApaⅠ,HindⅢ和ApaⅠ，Bam HⅠ雙酶切并回收載體片段，上述相同限制性內(nèi)切酶雙酶切質(zhì)粒pT-AnlipA，回收目的基因片段，將載體與目的基因相連接，得質(zhì)粒pT-6R-AnlipA和pT-6R-Anli?pA-Tgla。再分別用XbaⅠ,HindⅢ和NheⅠ,HindⅢ雙酶切pT-6R-AnlipA和pT-6R-AnlipA-Tgla，將兩片段相連，即得質(zhì)粒pT-6R-AnlipA-Tgla-6R-Anli?pA。將表達(dá)載體pSZHA用XbaⅠ,HindⅢ雙酶切，純化后載體片段與AnlipA單拷貝與雙拷貝表達(dá)框相連（見圖1），即得表達(dá)載體pSZHA6R-AnlipA與pS?ZHA6R-2AnlipA。

表1 引物名稱及其序列Table 1 Primer name and sequence

圖1 pSZHA6R-AnlipA與pSZHA6R-2AnlipA表達(dá)閱讀框Fig.1 Expression cassette of pSZHA6R-AnlipA and pSZHA6R-2AnlipA

1.2.4 黑曲霉脂肪酶共培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化子鑒定

重組質(zhì)粒通過凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL1后，初次活化農(nóng)桿轉(zhuǎn)化子菌按1∶10比例接種于新鮮YEB培養(yǎng)基（100 mg·L-1利福平，100 mg·L-1卡那霉素和200 μmol·L-1乙酰丁香酮）中，當(dāng)OD600達(dá) 0.4～0.6時，取200 μL農(nóng)桿菌離心后沉淀與50 μL破碎黑曲霉菌絲混合，涂布于覆蓋在PDA平板玻璃紙上（200 μmol·L-1乙酰丁香酮）。30℃孵育2 d后，將含菌絲體玻璃紙倒置于新CD平板上（200 mmol·L-1頭孢、20 g·L-1麥芽糖、1 mol·L-1尿苷和1 mol·L-15-FOA）培養(yǎng)1 d后，取出玻璃紙，30℃培養(yǎng)至菌落形成。將平板上菌落接種在CD液體培養(yǎng)基（200 mmol·L-1頭孢、20 g·L-1麥芽糖、1 mol·L-1尿苷和1 mol·L-15-FOA）中培養(yǎng)5～7 d，收集黑曲霉菌絲提取其基因組DNA[16]。用引物P3和P4（見表1）鑒定黑曲霉純合轉(zhuǎn)化子。

1.2.5 熒光定量PCR檢測

提取黑曲霉脂肪酶發(fā)酵第5天菌體RNA并合成反轉(zhuǎn)錄cDNA。用Premix Ex Taq在SYBR's Strata?gene Mx3000P儀器（美國）作實時定量PCR。每個樣品反應(yīng)體系50 μL，設(shè)3個重復(fù)，用表1中列出引物P5，P6和P7，P8作Quantitative real time PCR分析。PCR程序步驟如下：95℃初始變性10 min，95℃，15 s，60℃，60 s，40個循環(huán)，在每個延伸步驟結(jié)束時，95℃測量熒光信號。內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)是同一樣品actin轉(zhuǎn)錄數(shù)[17]。

1.2.6 SDS-PAGE

發(fā)酵上清液和2×protein loading buffer按1∶1比例混合，加熱煮沸10 min。SDS-PAGE，用5%濃縮凝膠和12%分離凝膠對樣品處理。加考馬斯亮藍(lán)R-250染液過夜染色后，再作1～2 h脫色處理。

1.2.7 酶活測定

將培養(yǎng)5～7 d黑曲霉純合轉(zhuǎn)化子接種到工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基中（2%豆餅粉，2%玉米漿，10%葡萄糖，pH 5.5～6.0），30 ℃，250 r·min-1搖瓶振蕩培養(yǎng)，收集4～10 d發(fā)酵液。配置0.05 mol·L-1氫氧化鈉儲備液，稀釋為0.01 mol·L-1氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。取2個100 mL三角瓶，分別于瓶1與瓶2加入4 mL底物溶液（稱取聚乙烯醇40 g加800 mL蒸餾水在沸水浴中加熱、攪拌至全部溶解，加蒸餾水定容至1 L，冷卻至室溫后，干凈雙層紗布過濾，留濾液備用。量取上述溶液240 mL，加80 mL橄欖油，高速勻漿機處理6 min，共2次，間隔10 min，每次處理3 min。即得乳白色底物混合液，該底物溶液現(xiàn)用現(xiàn)配）和pH為7.5磷酸緩沖溶液5 mL（分別稱取磷酸二氫鉀3.92 g和79.24 g磷酸氫二鈉，用蒸餾水溶解并定容至1 L），再于瓶1中加入95%乙醇15 mL，40℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，兩瓶中加入適當(dāng)稀釋倍數(shù)酶液1 mL，立即混勻計時，準(zhǔn)確反應(yīng)15 min后，瓶2中立刻補加15 mL 95%乙醇終止反應(yīng)[18]。1、2兩瓶中各加兩滴酚酞指示劑，氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至微紅色并保持30 s不褪色為滴定終點，記錄氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗體積。每個樣品作3組平行。

脂肪酶制劑活力按如下公式計算：

X1：樣品酶活力（μ·g-1）；

V1：滴定瓶2時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）；

V2：滴定瓶1時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）；

c：氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mol·L-1）；

n1：樣品稀釋倍數(shù)。

1.2.8 脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)測定

最適pH：將酶液稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，調(diào)節(jié)緩沖溶液pH范圍為4～11，在40℃條件下，測定脂肪酶酶活。

最適溫度：將酶液稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，調(diào)節(jié)溫度范圍25～55℃，在磷酸緩沖溶液pH 7.5條件下，測定脂肪酶酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉脂肪酶AnlipA克隆

以黑曲霉基因組為模板，用引物P1、P2作PCR擴(kuò)增為1 055 bp目的條帶（見圖2），將AnlipA基因片段克隆至pMD-19T轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，搖瓶提取質(zhì)粒，然后作測序比對，比對結(jié)果表明該基因序列與黑曲霉CBS513.88相似度為100%。

圖2 AnlipA基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Cloning of AnlipA by PCR

2.2 多拷貝脂肪酶表達(dá)載體構(gòu)建

用XbaⅠ和HindⅢ雙酶切黑曲霉表達(dá)載體pSZHA6R-AnlipA和pSZHA6R-2AnlipA，分別得2 600 bp基因片段，15 280 bp載體片段和5 950 bp基因片段，15 280 bp載體片段（見圖3）。

2.3 凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGL1

將表達(dá)載體pSZHA6R-AnlipA，pSZHA6R-2AnlipA通過凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL1感受態(tài)中，在含卡那霉素和利福平抗性YEB培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)，直至長出大小適宜單菌落（見圖4）。

圖3 pSZHA6R-AnlipA，pSZHA6R-2AnlipA雙酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Double enzymes digestion results of vectors pSZHA6R-AnlipA and pSZHA6R-2AnlipA

圖4 重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌Fig.4 Expression vectors transferred into AGL1

2.4 黑曲霉轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定

使用出發(fā)菌株以pyrG為篩選標(biāo)記且重組菌株中不含抗生素抗性基因，符合食品級要求。挑取篩選培養(yǎng)基上黑曲霉轉(zhuǎn)化子單菌落，接種于液體CD培養(yǎng)基（200 mmol·L-1頭孢、20 g·L-1麥芽糖、1 mol·L-1尿苷、1 mol·L-15-FOA）中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d，提取黑曲霉菌絲體基因組DNA。用引物5'asAA-sense和3'asAA-antisense作PCR擴(kuò)增，鑒定黑曲霉純合轉(zhuǎn)化子。以水和出發(fā)菌株為陰性對照，pSZHA6R-AnlipA和pSZHA6R-2AnlipA質(zhì)粒分別為陽性對照，黑曲霉轉(zhuǎn)化子均擴(kuò)增出與質(zhì)粒對照相同目的條帶，見圖5～6。結(jié)果表明，CICC2462（pSZHA6R-AnlipA）、CICC2462（pSZHA6R-2Anli?pA）均為純合轉(zhuǎn)化子。

2.5 重組脂肪酶熒光定量PCR分析

將重組菌株 CICC2462（pSZHA6R-AnlipA）和CICC2462（pSZHA6R-2AnlipA）作搖瓶發(fā)酵，取發(fā)酵第5天菌體提取RNA，用引物P5，P6和P7，P8作Real-time PCR，在轉(zhuǎn)錄水平上比較不同拷貝數(shù)AnlipA基因表達(dá)量，如圖7所示。結(jié)果表明CICC2462（pSZHA6R-2AnlipA）中脂肪酶基因轉(zhuǎn)錄水平為CICC2462（pSZHA6R-AnlipA）1.26倍。

2.6 SDS-PAGE分析

取重組菌株搖瓶發(fā)酵4～10 d上清液用于SDSPAGE蛋白電泳，結(jié)果如圖8所示。箭頭所指為重組脂肪酶蛋白條帶，約為37.0 ku。

圖5 pSZHA6R-AnlipA黑曲霉重組轉(zhuǎn)化子PCR酶切鑒定結(jié)果Fig.5 Single enzyme digestion result of identification pSZHA6R-AnlipA recombinant transformants by PCR

圖6 pSZHA6R-2AlipA黑曲霉重組轉(zhuǎn)化子PCR酶切鑒定結(jié)果Fig.6 Single enzyme digestion result of identification pSZHA6R-2AnlipA recombinant transformants by PCR

圖7 CICC2462（pSZHA6R-AnlipA）和 CICC2462（pSZHA6R-2AnlipA）熒光定量PCR結(jié)果Fig.7 Transcription level of CICC2462（pSZHA6R-AnlipA）and CICC2462（pSZHA6R-2AnlipA）

圖8 重組脂肪酶菌株SDS-PAGE蛋白電泳Fig.8 SDS-PAGE of recombinant AnlipA strains

2.7 重組脂肪酶酶活檢測

將重組菌株搖瓶發(fā)酵，取4～10 d上清液測定脂肪酶活性（見圖9）。重組菌株CICC2462（pS?ZHA6R-AnlipA），CICC2462（pSZHA6R-2AnlipA）在第8天達(dá)最高酶活性，分別為1 120 U·mL-1，1 480 U·mL-1。至第9天由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)消耗和次級代謝物大量積累，發(fā)酵條件不適合菌體分泌蛋白，故酶活性下降。

圖9 CICC2462（pSZHA6R-AnlipA）與CICC2462（pSZHA6R-2 AnlipA）4～10 d酶活檢測結(jié)果Fig.9 Enzyme activities of recombinant AnlipA strains at 4-10 d

2.8 重組脂肪酶最適pH

取重組脂肪酶菌株CICC2462（pSZHA6R-2An?lipA）發(fā)酵表達(dá)量最高第8天發(fā)酵液，分別在pH 4～11條件下作酶活檢測，結(jié)果如圖10所示。pH為6時重組脂肪酶酶活最高，確定該脂肪酶最適pH為6，酶活為2 135 U·mL-1，且該重組脂肪酶在pH 6～7時酶活較高。隨pH增高，酶活迅速下降，pH＞9時酶活趨于平穩(wěn)但已喪失大部分活性。

2.9 重組脂肪酶最適溫度

取重組脂肪酶菌株CICC2462（pSZHA6R-2An?lipA）發(fā)酵表達(dá)量最高第8天發(fā)酵液，分別在25～55℃作酶活檢測，見圖11。溫度為35℃時，重組脂肪酶酶活最高，即35℃為該脂肪酶最適溫度，且在25～45℃酶活均較高，說明其適合溫度范圍較大。

圖10 CICC2462(pSZHA6R-2AnlipA)在不同pH下酶活檢測結(jié)果Fig.10 Enzyme activities of CICC2462(pSZHA6R-2AnlipA)at different pH

圖11 CICC2462(pSZHA6R-2AnlipA)在不同溫度下酶活檢測結(jié)果Fig.11 Enzyme activities of CICC2462(pSZHA6R-2AnlipA)at different temperature

3 討論與結(jié)論

黑曲霉作為食品級安全受體菌株可分泌大量同源和外源蛋白，對分泌蛋白作正確翻譯后修飾，發(fā)酵產(chǎn)物安全。研究利用黑曲霉表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)AnlipA基因轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明，搖瓶發(fā)酵后含2個拷貝AnlipA重組菌株最高酶活力達(dá)1 480 U·mL-1，比1拷貝重組菌株最高酶活力提高32%。與林俊涵等研究結(jié)果相符，證明增加目的基因拷貝數(shù)可增強轉(zhuǎn)錄水平，提升目的基因表達(dá)產(chǎn)量[19-21]。但與Vas?sileva等結(jié)果不同，2拷貝酶活力未呈線性增加，僅為1拷貝1.32倍[22]，推測可能是引入多拷貝正調(diào)控元件強啟動子和過多基因拷貝數(shù)引發(fā)調(diào)控蛋白滴定效應(yīng)[23]，在其他整合位點引入正調(diào)控蛋白amyR與目的基因共表達(dá)是解決問題有效途徑[24]。另一方面也可能因過大基因劑量，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)生部分非折疊蛋白響應(yīng)[25-26]，蛋白表達(dá)量下降、平穩(wěn)或增加幅度減緩，加入具有協(xié)同作用輔助因子，可能是降低或消除負(fù)反饋作用手段之一[27]。

徐蘇煒等在畢赤酵母中表達(dá)RML基因，其酶活為102 U·mL-1[28]； Garcíasilvera等在粘質(zhì)沙雷氏菌中表達(dá)胞外脂肪酶，酶活為124 U·mL-1[29]；本研究中2拷貝AnlipA重組黑曲霉菌株的酶活力達(dá)1 480 U·mL-1，符合食品級要求，安全優(yōu)勢和生產(chǎn)潛力顯著。

實驗室建立黑曲霉表達(dá)系統(tǒng)中，將目的基因整合到高表達(dá)asAA基因整合位點，在分泌目的蛋白同時也產(chǎn)生大量背景蛋白，主要包括葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，且目的蛋白與背景蛋白均由amyR基因調(diào)控[17]，在amyR表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子一定情況下，目的蛋白與背景蛋白存在競爭關(guān)系，故敲除背景蛋白，會相應(yīng)減少或解除競爭機制，間接增加目的基因表達(dá)。后續(xù)研究將敲除葡糖淀粉酶和α-淀粉酶基因，以利目的蛋白高效表達(dá)，提高目的蛋白純度、減少生產(chǎn)成本；同時利用RSM統(tǒng)計學(xué)方法，優(yōu)化接種量、培養(yǎng)溫度，發(fā)酵時間等條件，提高脂肪酶表達(dá)量[30]。

試驗采用多拷貝脂肪酶基因表達(dá)框策略構(gòu)建黑曲霉重組菌株CICC2462（pSZHA6R-AnlipA）和CICC2462（pSZHA6R-2AnlipA）。結(jié)果表明含2個拷貝AnlipA較含1拷貝AnlipA黑曲霉轉(zhuǎn)化子表達(dá)量有所提高。研究為黑曲霉高效表達(dá)重組蛋白提供有效途徑，為食品級黑曲霉脂肪酶工業(yè)化生產(chǎn)提供工程菌株。

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