許玉鳳，陽海鷹，原 梅，李 樺

（軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物和毒理學國家重點實驗室，北京 100850）

黃藥子（黃獨，Dioscorea bulbiferaL.）是薯蕷科植物黃獨的地下塊莖。黃藥子在中國已有上千年的藥用歷史，具有多種生物活性［1］。1963年《中國藥典》記載，其性味苦、平，具有涼血、降火、消癭和解毒等功能。現(xiàn)代藥理學研究表明，黃藥子具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎、抗菌和治療甲狀腺腫等作用［2］。臨床常見的黃藥子制劑有白蝕丸和增生平片等。長期服用黃藥子會導致嚴重的肝損傷［3］，由此引起用藥安全性的關注。已有研究表明，黃獨素B（diosbulbin B，DIOB）是黃藥子發(fā)揮抗腫瘤和抗炎活性的藥效成分，也是導致肝毒性的毒效成分［4-5］。DIOB結構中的呋喃環(huán)在肝經(jīng)代謝酶作用，代謝活化生成反應性產(chǎn)物，與蛋白質等大分子結合，產(chǎn)生肝毒性［6-8］。

黃藥子的肝毒性與其代謝性質密切相關。DIOB在大鼠和小鼠的藥動學研究已有報道［9-11］。目前，臨床上常以黃藥子煎劑或黃藥子復方制劑形式給藥，而DIOB尚未成藥。以黃藥子或黃藥子醇提物（ethanol extract fromD.bulbiferaL.，EEDB）給藥的血漿藥動學及靶組織分布尚無報道。為此，本研究采用液相-串聯(lián)質譜法（liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS），比較研究EEDB和DIOB單體ig給藥后DIOB在大鼠體內的代謝差異，為黃藥子毒理學研究和臨床合理用藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

DIOB購自成都曼斯特生物科技有限公司（批號MUST-15031805），純度為95.11%；黃藥子藥材購于北京同仁堂藥店，經(jīng)鑒定為薯蕷科薯蕷屬黃藥子。鹽酸普萘洛爾購于美國Sigma（批號BCBB9359V），純度≥98%；甲醇和乙腈（色譜純），美國Fisher公司；甲酸，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 儀器和設備

美國Aligent 6410B三重四級桿串聯(lián)質譜，配備Agilent1290超高液相色譜儀（UHPLC），電噴霧離子化電源和MassHunterB.04.00數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；微量臺式離心機Fresco 21購于美國Thermo公司；小型臺式恒溫搖床MaxQ 4450購自美國Thermo Scientific公司。

1.3 實驗動物

雄性SD大鼠，SPF級，體質量180～220 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK（京）2016-0006。

1.4 黃藥子醇提物的制備

黃藥子打碎成粗粉，加6倍體積75%乙醇浸泡30 min后，加熱回流提取2 h，倒出藥液，殘渣再以6倍體積75%乙醇重復回流提取3次。合并提取液，減壓濃縮至浸膏，-80oC保存。經(jīng)LC-MS/MS方法分析，EEDB中DIOB的含量為0.13%。

1.5 LC-MS/MS定量分析

色譜條件：CAPCELLPAKC18色譜柱（2.0mm×50mm，3μm），流動相A為含5mmol·L-1甲酸銨和0.1%甲酸的水，流動相B為含0.1%甲酸的乙腈。DIOB梯度洗脫程序：0～0.5min，10%B；0.5～2.0min，10%～60%；2.0～2.5 min，60%～ 90%；2.5～2.7 min，90%～10%。

流速：0.3 mL·min-1；柱溫25oC；進樣體積5 μL。

質譜條件：采用ESI源正離子檢測，掃描方式為多反應監(jiān)測；質譜分析參數(shù)：毛細管電壓4000 V，毛細管溫度320oC，霧化電壓35 psi，干燥氣流速11 L·min-1。DIOB檢測離子對m/z 362→317，裂解電壓112 V，碰撞電壓16 V。

1.6 方法學驗證

考察血漿樣品中DIOB在1～1000 μg·L-1濃度范圍內的線性范圍和最低定量限（lower limit of quantification，LLOQ）。配制2，50和800 μg·L-1質控血漿樣品，考察DIOB在LLOQ和上述質控濃度水平的精密度和準確度，以及3個質控濃度的提取回收率和基質效應，測定在室溫或4oC放置24 h，-20oC放置30 d和反復凍融（-20～4oC）條件下的穩(wěn)定性。在血漿樣品方法學全面驗證的基礎上，對組織樣品進行線性、提取回收率和基質效應等的驗證。

1.7 藥動學實驗

取SD大鼠10只，隨機分為DIOB單體組和EEDB組，分別ig給予EEDB 1.0 g·kg-1或DIOB 1.3 mg·kg-1（與EEDB中DIOB等量），于2，5，15和30 min及1，2，4，8，12和24 h眼眶取血，肝素抗凝，5000×g，4oC離心10 min，分離血漿待測。

1.8 組織分布測定

取SD大鼠60只，隨機分為DIOB單體組和EEDB組，分別ig給予DIOB 1.3 mg·kg-1或EEDB 1.0 g·kg-1。給藥前禁食12 h，自由飲水。于給藥后0.17，0.5，2，6，12和 24 h處死大鼠，每時間點5只。大鼠股動脈取血，并摘取心、肝、脾、肺、腎、腦、肌肉和脂肪等器官和組織。器官組織用預冷的蒸餾水沖洗，吸干多余水分后稱重，用蒸餾水以1∶4的比例制成組織勻漿，取50 μL血漿或組織勻漿，加入150 μL內標工作液（含普萘洛爾100 μg·L-1的乙腈溶液），渦旋振蕩1 min，18 800×g，4oC離心10 min，取上清5 μL進樣至LC-MS/MS分析。

1.9 蛋白結合率測定

采用快速平衡透析法（rapid equilibrium dialysis，RED）［12］測定DIOB在血漿和組織（肝、肺）的蛋白結合率。肝和肺組織加蒸餾水制備1∶4的勻漿，根據(jù)DIOB給藥后的血漿和組織峰濃度，取大鼠血漿和組織勻漿制備濃度為200或1000 μg·L-1的DIOB含藥樣品，并以普萘洛爾（200 和1000 μg·L-1）為陽性對照，測定蛋白結合率。將DIOB 200 μL或普萘洛爾樣品加入樣品室，PBS緩沖液350 μL加入緩沖液室。密封、置37°C恒溫搖床，100 rpm振搖孵育4 h。透析結束后，從樣品室和緩沖液室分別取50 μL樣品置于離心管中，并分別補加50 μL不含藥的PBS緩沖液和肝、肺空白組織勻漿，加入沉淀劑渦旋振蕩2 min，18 800×g，4°C 離心10 min，取5 μL上清液進樣分析。

1.10 數(shù)據(jù)處理

應用公式①和②分別計算DIOB在大鼠血漿和組織勻漿的游離分數(shù)（?u），應用公式③進行稀釋倍數(shù)的校正，計算組織的游離分數(shù)（?u，組織）［13］。式中，D代表組織的稀釋倍數(shù)。應用公式④和⑤分別計算血漿和組織中DIOB的游離濃度。

采用 WinNonLin 6.4（Pharsight Inc，USA）軟件的非房室模型分析，得到藥動學參數(shù)。實驗結果數(shù)據(jù)以表示，用SPSS 20進行成組t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LC-MS/MS方法學建立及驗證

應用本研究確定的LC-MS/MS分析條件，DIOB與內標普萘洛爾分離度良好，生物樣品中內源性物質對DIOB的測定沒有干擾（圖1），方法專屬性好。在1～1000 μg·L-1濃度范圍內DIOB呈良好線性關系（r2＞0.99），LLOQ為1.0 μg·L-1。

在LLOQ和2，50和800 μg·L-13個質控濃度水平，血漿和組織樣品中DIOB的定量檢測批內和批間精密度相對標準差（relative standard deviation，RSD）＜15%，準確度相對誤差（relative error，RE）為-10.3%～14.9%。DIOB在血漿和組織樣品的提取回收率為96.6%～112.2%，基質效應在88.8%～99.2%范圍內。稀釋線性RE為-6.5%～13.8%，RSD＜9.1%。質控樣品濃度在室溫、4oC進樣倉、-20oC放置30 d和-20oC反復凍融的條件下穩(wěn)定性良好（RSD＜10.7%），建立的方法能滿足本研究的需要。

Fig.1 Representative multiple reaction monitoring chromatograms of diosbulbin B（DIOB）in plasma of rats.A：blank plasma；B：DIOB；C：propranolol hydrochloride；D：blank plasma spiked with lower limit of quantification（propran?olol hydrochloride 100 μg·L-1and DIOB 1.0 μg·L-1）；E：plasma sample taken at 2 h from DIOB 1.3 mg·kg-1dosed rats（propranolol hydrochloride 100 μg·L-1and DIOB 19.6 μg·L-1）.1：DIOB；2：propranolol hydrochloride.

2.2 大鼠血漿藥動學

大鼠分別ig給予等劑量DIOB的EEDB1.0g·kg-1和DIOB單體1.3 mg·kg-1，定時采集血樣，得到DIOB的藥時曲線（圖2）和藥動學參數(shù)（表1）。2個給藥組的DIOB在大鼠體內的吸收和消除均較快，給藥后2 min即可在血漿中檢測到DIOB，12 h的血漿濃度低于定量下限。EEDB組的DIOB血藥濃度在（0.23±0.17）h 達峰，cmax為（131±67）μg·L-1，AUC（0-8h）為（189±70）μg·h·L-1。DIOB單體組的DIOB血藥濃度在（0.12±0.07）h達峰，cmax為（312±67）μg·L-1，顯著高于EEDB組（P＜0.01）；盡管DIOB單體組的AUC值＞EEDB組的AUC值，但二者之間無統(tǒng)計學差異。比較2個給藥組的DIOB消除可見，DIOB單體組的末端消除半衰期t1/2為（1.17±0.28）h，顯著快于EEDB組的（2.34±0.83）h（P＜0.05）；同樣，2組的平均滯留時間MRT也有顯著差異（P＜0.05）。結果表明，大鼠DIOB單體和EEDB給藥后的藥動學存在一定的差異，主要表現(xiàn)為血漿峰值和消除的差異。

Fig.2 Plasma concentration-time profiles of DIOB in rats after ig administration of compound DIOB and ethanol extract of Dioscorea bulbifera L.（EEDB）,respec?tively.After a single ig administration of DIOB 1.3 mg·kg-1or EEDB 1.0 g·kg-1，blood samples were collected，and the plasma concentrations of DIOB were measured by a validated LC-MS/MS method

Tab.1 Pharmacokinetic parameters of DIOB in rats after ig administration of DIOB and EEDB

2.3 組織分布

分別ig給予大鼠等劑量DIOB的EEDB和DIOB單體，不同時間點測定DIOB的血漿和心、肝、脾和肺等組織分布濃度，得到組織濃度峰值cmax和AUC等參數(shù)。表2和圖3結果表明，EEDB和DIOB單體給藥后，DIOB可快速至各組織。DIOB單體組各組織的濃度在0.17 h達到峰值，0.5 h的濃度顯著降低；除肺組織外，其他組織DIOB濃度在2 h降低至定量限。DIOB單體組DIOB在各組織中的暴露量AUC（0-24h）由高到低依次為肺＞肝＞血漿＞腎＞脾＞心＞肌肉＞脂肪＞腦。肺的分布濃度（4527.0±557.7）ng·h·g-1顯著高于其他組織，其次是肝和腎組織183.0±51.1和（64.4±22.4）ng·h·g-1。EEDB組DIOB組織分布模式與DIOB單體組相似，DIOB很快進入組織；除肺組織，大多數(shù)組織DIOB消除較快。EEDB組DIOB的AUC（0-24h）由高到低排序為肺＞肝＞腎＞脾＞血漿＞心＞肌肉＞脂肪＞腦，肺、肝和腎的暴露量AUC分別為6507.9±424.3，（467.5±202.7）和（238.6±70.0）ng·h·g-1，均顯著高于DIOB單體組（P＜0.05，P＜0.01）。2個給藥組DIOB在肺組織不僅分布高，且消除較慢，給藥24 h時肺濃度才降低至峰濃度的1/10。

Tab.2 Tissue distribution of DIOB in rats after ig administration of DIOB and EEDB.

Fig.3 Tissue dynamic distribution of DIOB in rats after ig administration of DIOB（A）and EEDB（B）.See Fig.2 for the rat treatment.After administration of DIOB and EEDB，tissue samples were collected at 0.17，0.5，2，6，12 and 24 h.The samples were measured by LC-MS/MS.The unit in plasma sample was μg·L-1.

2.4 DIOB的蛋白結合率和組織/血漿濃度比

為了排除非特異性蛋白結合對DIOB組織分布濃度的影響，采用RED法測定DIOB在血漿、肝和肺組織的蛋白結合率。陽性藥普萘洛爾在200和1000 μg·L-1時，其血漿蛋白結合率分別為82.5%和84.8%，與文獻報道（87%）一致［14］。DIOB在200和1000 μg·L-1時，其血漿蛋白結合率分別為38.7%和43.6%，在肝組織的蛋白結合率分別為61.3%和66.9%，在肺組織的蛋白結合率分別為61.4%和64.7%；在肝和肺組織的蛋白結合率高于血漿，且在測定的2個藥物濃度之間無顯著差異。DIOB在血漿、肝和肺組織的游離分數(shù)（?u）見表3。由?u計算得到DIOB在血漿、肝和肺組織的游離濃度，并計算游離濃度AUC的組織/血漿比值Kp，AUC，?u。DIOB在肝和肺組織的游離濃度仍高于血漿（圖4）。DIOB單體組 DIOB 在肝和肺組織的Kp，AUC，?u為 1.9±0.4 和55.0±19.9，EEDB組為2.1±0.3和48.0±5.4，提示DIOB在存在肺組織特異性分布。

Tab.3 Unbound fractions for DIOB in rat plasma，liver and lung tissues

Fig.4 Unbound plasma and tissues concentrations of DIOB in rats after ig administration of DIOB（A）and EEDB（B）.See Fig.3 for the rat treatment.Unbound plasma and tissues concentrations of DIOB were calculated with unbound cPlasma=cPlasma×?u，Plasmaand unbound cTissue=cTissue×?u，Tissue.The unit of plasma sample was μg·L-1.

3 討論

大鼠血漿藥動學研究發(fā)現(xiàn)，DIOB單體和EEDB給藥后，DIOB在大鼠體內的血漿動力學存在一定的差異，單體組DIOB吸收入血快，cmax是EEDB組的2.4倍，消除也顯著快于EEDB。提示黃藥子藥效中的其他成分可能減慢DIOB吸收進入血循環(huán)、以及從血循環(huán)消除的過程。在研究黃藥子肝毒性時，應考慮不同給藥對象因藥動學行為差異導致的毒性差異。

文獻報道，DIOB主要經(jīng)代謝活化產(chǎn)生肝毒性［15］。因此，DIOB單體和黃藥子中DIOB的靶器官分布對研究黃藥子的毒性至關重要。本研究發(fā)現(xiàn)，無論是以DIOB單體還是以EEDB的形式給藥，DIOB均可快速進入組織，且在大部分組織中的消除較快。2個給藥組DIOB在毒性靶器官肝的整體暴露水平僅次于肺，顯著高于其他組織。DIOB單體組肝峰值濃度高于肺，EEDB組DIOB在肝分布峰值濃度較低，消除也較慢。經(jīng)游離分數(shù)校正得到的肝/血游離濃度比值Kp，AUC，?u仍接近或＞2，表明肝是DIOB的分布靶器官之一，DIOB在肝組織的高暴露水平與其肝毒性相關。

本研究發(fā)現(xiàn)，DIOB在肺組織有很高的分布，且消除顯著慢于其他組織，其肺/血游離濃度的AUC比值為48～55，在肺的游離濃度遠高于血漿，具有特異性分布的特征。比較2個給藥組，EEDB組DIOB在肺的AUC顯著高于DIOB單體組。黃藥子在臨床上可用于治療慢性氣管炎、百日咳和小兒頑固性哮喘等，肺是DIOB的藥效靶器官之一，其在肺組織的分布特征可能有助于藥效的發(fā)揮。目前，尚未見黃藥子或DIOB肺毒性報道。黃藥子和DIOB的肺器官藥效學和毒理學值得進一步研究。

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