李曉如，白 晶，張 劍

（1. 山西大學化學化工學院，山西太原，030006；2. 山西勇寧記科技有限公司，山西太原，030006）

酯酶是一類既可催化酯鍵水解又可催化酯鍵合成的酶的總稱。其催化酯鍵水解時，使酯鍵斷裂，產物為醇和酸；催化酯鍵合成時，使酸的羧基和醇的羥基脫水縮合，產物為酯類及其他香味物質[1]。酯酶廣泛存在動物、植物、微生物中[2]，且微生物中細菌、真菌和酵母中的酯酶含量較為豐富，因此微生物發(fā)酵是酯酶的主要來源。由于微生物種類多、繁殖快，具有比動植物更廣的作用pH、作用溫度以及底物專一性[3]、便于工業(yè)生產等優(yōu)點，故微生物發(fā)酵酯酶得到了研究人員的關注，并且已經將其廣泛應用于食品加工、醫(yī)藥化學品、洗滌行業(yè)和環(huán)境保護等領域[4]。除此之外，酯酶的酶促反應具有較高的底物專一性、區(qū)域選擇性或者對映選擇性，酯酶是合成手性化合物（如手性藥物、農藥等）的高效生物催化劑[5]。近年來微生物發(fā)酵的酯酶已成為研究熱點[6]。本文從酯酶的來源、產酯酶菌株的篩選以及發(fā)酵條件和培養(yǎng)方法進行了綜述，并結合酯酶的分子結構，對酯酶的催化特性和應用做了總結，以期今后對酯酶的研究提供有益的借鑒。

1 酯酶

1.1 酯酶的來源

自然界中能產酯酶的微生物種類非常豐富，主要有真菌、酵母菌和細菌，其中真菌有曲酶菌、青霉菌、根霉菌、毛霉菌、鏈孢霉菌、犁頭霉菌、須霉菌、白地霉菌等12屬23種[7]；酵母類有假絲酵母、畢赤酵母、紅酵母等；而產酯酶的細菌種類特別多，包括芽孢桿菌、微球菌、假單孢菌、乳酸菌等。這些產酯酶微生物的分布環(huán)境也是多種多樣的，如工廠廢棄物、植物油加工廠、油脂污染的土壤等。

1.2 酯酶的特性

1.2.1 酯酶的結構及催化特性

酯酶是 a / b 水解酶，具有典型的 a / b 水解酶的結構特征[8]，由8個平行的 b 折疊和6個 a 螺旋組成[9]，其中疏水的 b 折疊排列在酶分子的結構中央，親水的 a 螺旋則分布在兩側，a 螺旋和 b 折疊之間則由Loop環(huán)連接[10-11]（如圖1）。

圖1 α/β水解酶折疊示意圖[12]

酯酶結構中含有一個絲氨酸-天冬氨酸-組氨酸的催化三聯(lián)體（Ser-Asp-His），使其具有催化活性[13]。催化過程一般為[8]：①酶分子活性中心絲氨酸殘基的羥基被組氨酸殘基活化后，絲氨酸殘基的羥基氧形成親核基團對底物羰基碳原子進行親核攻擊，發(fā)生親核加成反應；②親核加成反應后形成四面體化合物，四面體中間物的氧負離子與酶分子中氧陰離子的兩個氨基酸殘基酰胺鍵上的-NH-形成氫鍵以穩(wěn)定中間態(tài)；③底物酯鍵發(fā)生斷裂生成?；?，同時釋放底物醇。水分子繼而被組氨酸殘基激活，水分子中的羥基對酰化酶上的羰基碳原子發(fā)生親核攻擊；④組氨酸將質子傳遞給絲氨酸殘基的氧原子導致?；铬ユI斷裂，同時釋放出羧基產物，完成催化過程[14]。

在含水量低的條件下，反應體系由液-液雙相、液-固雙相、反膠團和微水相體系組成。一般情況酯酶溶解在反膠團或雙相體系中的水相里，還可以以不溶性粉粒或以固定化酶的形式存在于有機相中。大量的實驗數(shù)據(jù)表明，酯酶在有機相中的催化優(yōu)于在水相中的催化，這是由于有機介質可以增加酯酶的熱穩(wěn)定性，增加非極性底物的溶解度，減少反應的副產物，增加合成反應的速率。及時移出反應產物，有利于酯催化反應的進行。另外酶的用量、反應溫度和pH值也對酯酶催化有一定的影響[15]（圖2）。

圖2 酯酶水解Estera醋酸甲酯的典型機理示意圖[12]

1.2.2 酯酶與脂肪酶的差異

微生物酯酶和微生物脂肪酶的定義和分類在文獻報道中并沒有加以嚴格區(qū)分，但實際上還是存在一些差異：①酯酶與脂肪酶的差異主要在于作用底物碳鏈長短的不同，脂肪酶優(yōu)先水解長鏈酯類，酯酶則優(yōu)先水解短鏈酯類[16]。對于酯酶和脂肪酶催化酯類化合物分子的水解，酯酶作用于I型酯，脂肪酶作用于II型酯（如圖3），對于由較大基團的手性羧酸和較小基團的醇形成的酯，其水解或酯交換選擇酯酶催化較為適宜；而對于由較小基團的羧酸和較大基團的手性醇形成的酯，進行水解和轉酯化反應時則選擇脂肪酶催化較為適宜。②兩者作用底物的物理狀態(tài)不同，即脂肪酶主要在兩相體系（油-水界面）上作用，而酯酶只作用于水溶性的底物或者只能分解已溶解的底物[17]。③脂肪酶催化的反應存在界面激活現(xiàn)象，而酯酶的反應遵循經典的米氏動力學過程。酯酶和脂肪酶都能穩(wěn)定存在于有機溶劑中并表現(xiàn)出活性，但脂肪酶的這一特征更為突出。④雖然酯酶和脂肪酶結構大多都是 a / b 的水解酶的典型特征，但是脂肪酶存在一個疏水的蓋子結構，對催化反應有一定的選擇性[18]。

圖3 酯酶/脂肪酶催化多數(shù)底物特征

1.3 酯酶的分類

1.3.1 Alridge分類

1953年，Alridge通過對硝基苯酯的鑒別，把從兔的血清中提取的酯酶命名A酯酶和B酯酶，因此，后來的學者習慣就把Alridge對酯酶的分類定義為Alridge分類[19]。根據(jù)Alridge的分類，酯酶可以分為三類：A類酯酶，B類酯酶，C類酯酶。A類酯酶以有機磷化合物為作用底物，包括：①異丙基氟磷酸酯酶，這類酯酶水解化合物梭曼、沙林，一般需要金屬Co2+、Mg2+、Mn2+作輔助因子。②對氧磷酶水解對氧磷一類的有機膦化合物。這類酯酶以Ca2+為輔基。而B類酯酶卻被有機膦化合物所抑制，B類酯酶是一類廣泛分布于組織、器官的絲氨酸類，能水解許多含有羧酯鍵、硫酯鍵、酰胺鍵的內源性和外源性物質。其主要功能可能是參與藥物和毒物等的生物轉化、脂質代謝、信號轉導及維持生物膜結構的完整性，包括脂族酯酶和膽堿酯酶。其他不與有機膦化合物作用的酯酶稱為C類酯酶。Alridge分類不夠精確，各種酯酶不能逐一系統(tǒng)地進行分類，比較混亂。

1.3.2 標準分類

依據(jù)國際酶學委員會的標準，每一個酶的分類由4個數(shù)字組成，數(shù)字之前加上“E.C”。目前按這種分類的酯酶有31種大類[20]，包括羧酸酯酶（EC3.1.1)、硫酯酶（EC3.1.2)、磷酸單酯酶（EC3.1.3）、磷酸二酯酶（EC3.1.4）、三磷酸單酯酶（EC3.1.5）、硫酸酯酶（EC3.1.6）、二磷酸單酯酶（EC.3.1.7）、磷酸三酯酶（EC3.1.8）等。這種分類方法比較明確，但是目前對于酯酶的系統(tǒng)分類標準還不能滿足要求，經常有新鑒定和命名的酯酶需要調整分類地位和系統(tǒng)名稱。

1.3.3 其他分類

Walk[21]等根據(jù)酯酶對作用底物的特異性和等電點也進行了分類，這種分類方法也不夠精確，因為酯酶作用底物復雜多樣，并且有重疊性，難以逐一區(qū)分，且各種底物的等電點數(shù)值差異微小。

2 微生物酯酶的發(fā)酵

2.1 產酯酶菌株的篩選

產酯酶菌種的篩選一般有兩個步驟：初篩和復篩。初篩多是采用平板培養(yǎng)透明圈法，一般是將篩選到的菌種進行富集，然后用無菌水稀釋，涂布在含有酯酶的合適底物的平板上，通過培養(yǎng)一段時間后，平板上菌落周圍會形成透明水解圈，并根據(jù)透明圈的大小初篩合適的菌種。Guillermo[22]等利用透明圈變色法來篩選產酯酶的菌種，相比較傳統(tǒng)的篩選方法，篩選結果更為清晰可見，變色透明圈更為直觀。復篩是將初篩得到的產酯酶能力較強的菌株移入三角瓶內振蕩培養(yǎng)，然后通過較為精確的熒光比色法（乙酸萘酯或對硝基苯酚檢測法）對產物進行分析檢定，從中找出產酶量最高、性能上更符合要求的菌株。

“公司早期以把產品按照客戶的需求做出來為目標，注重成品是否滿足客戶的設計與需求”，吳重蔚坦言，而隨著時間的推移，栢科富翔嘗試為客戶提出建議，剛開始偏重于實物的建議，后來介入更高層次的設計環(huán)節(jié)?！肮緦ｉT成立了設計部，幫助客戶做出更加合理的設計。有的客戶甚至把整個項目交給我們來做，客戶給出預算，公司則按照預算金額完成設計和制作?！?吳重蔚也表示，有時候客戶描述得比較抽象，而使其具體化、圖像化確是件不容易的事，但換個角度來看，設計師的理想與現(xiàn)實的差距就是企業(yè)生存的空間。

2.2 微生物酯酶的發(fā)酵過程

通過改變培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件來提高酯酶的發(fā)酵產量已有許多相關報道[23]。培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件對菌種的生長以及酶的生產有著最直接的影響。

2.2.1 培養(yǎng)基成分

(1) 碳源

碳源是菌體細胞組成的原料，也是菌體生長發(fā)育必需的能源物質。某些碳源是酶的誘導劑，選擇適宜的碳源既可提高相應酶的產量，也有利于定向地促進某些酶的合成。如干酪乳桿菌產生的一種耐熱酯酶，需要三丁酸甘油酯的誘導；假單胞菌產生的磷酸三酯酶，需要磷酸鹽或者相應特殊碳源的誘導。Wang[24]等利用三乙酸甘油酯為底物，從自然發(fā)酵的黃皮果汁中篩選產酯酶優(yōu)良的菌種進行研究，三乙酸甘油酯為唯一碳源，且對酯酶的篩選有一定的促進作用，結果從樣品中篩選出一株產酯酶菌種C10，通過酶學特性分析，該菌種所產酯酶為堿性酯酶，最適條件為60℃，pH9，并且該酯酶有較好的耐熱性和穩(wěn)定性。

(2) 氮源

氮源是菌體蛋白質和核酸的重要組成原料。各種微生物對氮源的利用情況相當復雜。焦云鵬[25]等對黑曲霉產果膠酯酶發(fā)酵條件進行探討，發(fā)現(xiàn)以蛋白胨為氮源的液體發(fā)酵產生的果膠酯酶比以無機氮發(fā)酵產生的酯酶的量比高。

2.2.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)條件對酯酶產量也有影響，例如培養(yǎng)溫度。培養(yǎng)溫度不僅能影響酯酶菌體的生長，也影響酯酶的合成以及合成后的穩(wěn)定性，特別是耐熱性菌。 Thermurs sp.FD3041是國內溫泉分離得到的一株棲熱菌[26]，培養(yǎng)溫度為70℃，得到的胞內堿性磷酸酯酶FD2TAP，最適溫度是70℃；Pyrococcusabyssi是從深海火山中分離得到的異養(yǎng)古細菌[27]，最適生長溫度是100℃，得到胞內堿性磷酸酯酶的最適溫度為70℃。

2.3 微生物酯酶的發(fā)酵工藝

微生物酯酶的液體深層培養(yǎng)生產法就是采用液體培養(yǎng)基，在發(fā)酵瓶內進行一種通風攪拌式培養(yǎng)，其優(yōu)點是易于控制、不易染雜菌；缺點是周期長。潘名志[30]等通過對4株紅曲霉進行液體深層培養(yǎng)研究，篩選出產酯化酶能力較高的紅曲霉菌ZK，此菌種產酶的酶活力提高了42.3%。固體發(fā)酵生產法和液體深層培養(yǎng)生產法是產酯酶菌種常用的兩種方法，菌種培養(yǎng)大多時候只需要一種培養(yǎng)方法，有時候需要兩種方法配合完成。

3 酯酶酶活力的測定方法

目前酯酶酶活力測定的方法有比色法、氫氧化鈉滴定法、a -乙酸萘酯比色法等。

3.1 比色法

以對硝基苯酚為作用底物，利用紫外分光光度計在400nm處測體系的吸光度值。文獻報道的具體過程為[31]：取1mL 1mmol/L對硝基苯醋酸酯（p-NPC2）溶液、2mL Tris-HCL pH7.2的緩沖液加入試管，于40℃恒溫水浴15min，再加1mL酶液震蕩反應8min，立即加2mL 0.1mol/L鹽酸終止反應，在400nm處測吸光度值。以加入1mL滅活酶液作對照。每分鐘催化產生1mmol對硝基苯酚的酶量為1個酶活力單位。

3.2 氫氧化鈉滴定法

以NaOH滴定三醋酸甘油酯在酯酶作用下所釋放的醋酸來測定[32]。具體過程為：取5.9mL甘油三醋酸酯置于100mL的容量瓶中，加蒸餾水充分搖勻溶解，定容至100mL，取上述溶液20mL，放入三角瓶內，調溫40℃，用0.05mol/L的NaOH將pH值滴定至6.5。然后加2mL酶液，40℃攪拌反應30min，過程中以NaOH維持pH值為6.3～6.5，讀取NaOH耗量，用滅活酶液作對照。酶活力單位的定義：每分鐘催化分解三醋酸甘油酯釋放1mmol游離醋酸的酶量為1個酶活力單位。

3.3 α-乙酸萘酯比色法

乙酸萘酯是酯酶的一種作用底物，在顯色劑的輔助下可以用來檢測酯酶酶活力，其檢測的原理是：

乙酸萘酯+水+酶→萘酚+乙酸

萘酚+偶氮鹽→褐色偶氮化合物+氯化鋅+鹽酸

乙酸萘酯經酯酶水解后，生成的萘酚與偶氮鹽反應生成褐色偶氮化合物[33]，可以根據(jù)顏色的變化來確定酶活力的大小。Baumann M[34]等采用乙酸酯為篩選底物的方法，通過底物羧基端（乙酸）的釋放速度來測定酶活的大??；孫中濤、薛慶節(jié)[35]等通過a-乙酸萘酯檢測法對工程菌酯酶進行了純化、性質和固定化的研究。

4 酯酶的應用

酯酶作為一種重要的工業(yè)用酶，可催化酯交換、酯合成、多肽合成及內酯合成等多種反應，且具有反應不需要輔酶、反應條件較溫和、催化活性高以及選擇性強等優(yōu)點，因此，酯酶被廣泛應用于洗滌劑、食品、飲料、油脂、造紙、飼料、紡織、皮革、精細化工、新型材料、醫(yī)藥、化妝品、環(huán)境治理、生物能源等工業(yè)領域。

4.1 酯酶在食品加工中的應用

酯酶主要是通過酯交換、水解[36]及合成化合物等在食品加工中廣泛應用。與使用傳統(tǒng)酶相比較，將酯酶應用于食品加工過程中可減少纖維素水解、蛋白質消化等引起的食品污染問題，同時也可提高食品的食用性能。如醬油和食醋的釀造過程中加入酯酶，可提高乳酸乙酯、乙酸乙酯等酯類的含量，從而增加產品的香味，提高了產品的口感[37]；釀酒過程中加入酯酶，可催化合成香酯液，應用于濃香型白酒，大大縮短了發(fā)酵周期，提高了酒質和香味；同樣酯酶也可以使乳制品增香；食用油脂提煉工藝中，酯酶能催化脂肪酸與甘油之間的酯化反應，可以把油中的大量游離脂肪酸轉變成中性甘油酯，提高了食用油的價值；酯酶催化合成的單甘脂是食用量最大的食品乳化劑[38]。

4.2 酯酶在醫(yī)藥行業(yè)中的應用

由于酯酶酯化反應具有高底物專一性、區(qū)域選擇性、對映選擇性等優(yōu)點。在手性化合物拆分、藥物合成等領域呈現(xiàn)出很大的應用潛力。在醫(yī)藥領域很多藥物都是手性化合物，而近年來酯酶拆分已經成為手性化合物拆分的研究熱點。用酯酶拆分酮基布洛芬、(R)-氟比洛芬等手性藥物，均提高了對映體過量值，也提高了藥物的使用性和有效性。Zheng[39]等利用來自大腸桿菌的純化酯酶進行薄荷醇的轉酯化的拆分，結果表明，酯酶對乙酸薄荷酯的E值大于100，效果較好。宣磊[40]等采用巨大芽孢桿菌WZ009酯酶催化水解拆分(R,S)-3-羥基丁酸乙酯得到(R)-EHB，通過對酯酶催化水解反應條件的探討得出，在30℃，pH7的條件下，反應經過2h，(R)-EHB對映體過量值eep達到99%，底物轉化率達到55.5%。Zheng[41]等利用從重組細胞中提取的羧酸酯酶，在無水乙醇做溶劑，35℃，pH7.5條件下選擇性地合成了(S)-1-苯基-1，2-乙二醇，它的對映體過量值eep達到99%，底物轉化率達到45%。

4.3 酯酶在環(huán)保行業(yè)的應用

隨著科學的進步，農作物產量的提高，伴隨著農業(yè)生產中使用的農藥量也在不斷增加，帶來的農藥污染、殘留問題也日趨嚴重，其中農藥中菊酯類殺蟲劑在自然條件下難以降解，給食品安全和環(huán)境污染帶來了巨大隱患，并且有研究表明，菊酯類殺蟲劑具有類固醇結合活性，可能導致人體激素的波動。許多研究人員對菊酯類殺蟲劑做了大量的研究工作，起初是從小鼠肝臟中和昆蟲內發(fā)現(xiàn)了能降解菊酯農藥的酯酶，近年來，研究發(fā)現(xiàn)，酯酶降解菊酯具有良好的功效，目前已篩選到能有效降解氯氰菊酯和丙烯菊酯等相關的酯酶基因，并將酯酶基因克隆導入微生物中[42]。未來構建產酯酶的高效基因工程菌將是環(huán)境保護的一個發(fā)展趨勢。

4.4 酯酶在洗滌工業(yè)中的應用

酯酶可催化合成糖酯類生物表面活性劑，也有提高表面活性劑釋放的作用[43]，具有低毒、環(huán)保、特異性強等優(yōu)點，因此酯酶在洗滌用品等行業(yè)廣泛使用。Spicka[44]等利用芳基酯酶和過氧化氫原位產生的過乙酸在65℃下對棉織物漂白，得到了滿意的漂白效果。與傳統(tǒng)高溫高堿條件下的漂白相比，該方法的優(yōu)點是在溫和的作用條件下進行，即接近中性的pH和溫度為65℃的條件下，酶促反應產生的過乙酸具有很強的漂白性能。并且酶促漂白綠色環(huán)保，不需要添加大量的輔助劑和化學試劑。

5 展望

目前酯酶的結構已知是 a / b 水解酶的典型結構，但具體在催化過程所涉及到許多機理尚不明朗；酯酶的系統(tǒng)分類標準還不能滿足分類的要求，許多新檢索的酯酶還不能逐一詳細地進行命名分類；從環(huán)境中篩選產酯酶的微生物菌種效率低。但近年來，隨著基因文庫、基因工程、定向進化技術、固定化技術的發(fā)展，以及界面酶促過程等技術的深入研究，酯酶的研究可能具體到酯酶結構中的分子層，高效產酯酶菌種的篩選和酯酶發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化、誘變育種、基因克隆等，進而構建高效基因工程菌的研究取得了很大的發(fā)展。繼而可能挖掘酯酶在食品、醫(yī)藥、環(huán)保和洗滌行業(yè)中更加廣泛的應用。

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