紀善博，向建英，劉保東,*，計紅玲

(1 哈爾濱師范大學(xué)，哈爾濱 150025；2 西南林業(yè)大學(xué) 云南生物多樣性研究院，昆明 650224；3 黑龍江省普通高等學(xué)校植物生物學(xué)重點實驗室，哈爾濱 150025)

桫欏科(Cyatheaceae)是侏羅紀孑遺的唯一樹狀蕨類，在生態(tài)適應(yīng)、系統(tǒng)演化等研究領(lǐng)域有獨特而重要的價值，中國產(chǎn)桫欏共3屬14種，主要分布在云南、廣西、廣東、海南、臺灣等省區(qū)，都曾因生境的破壞而不斷瀕危，受到國家重點保護[1]。隨著生境的改善，近年來多數(shù)居群的植株長勢均有顯著好轉(zhuǎn)[2]，但多數(shù)種類又都出現(xiàn)了幼苗數(shù)量較少、生殖障礙加劇等新的瀕危趨勢[3]。

精卵結(jié)合是蕨類有性生殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，真蕨類植物的精子都是沒有細胞壁的單細胞、單倍體，需在水中游動并感知雌性物質(zhì)的濃度而游進頸卵器完成受精作用[4]。以往關(guān)于蕨類精子的研究主要集中在精原細胞、精母細胞、成熟精子等各階段的超微結(jié)構(gòu)[5-8]、形態(tài)發(fā)生[9-10]等方面，包文美等[11]對莢果蕨(Matteucciastruthiopteris(L.) Todaro)等做了精子形態(tài)觀察、戴錫玲等[12]對水蕨(Ceratopteristhalictroides(L.) Brongn.)精子由精細胞至游動精子的變化過程有過報道，都表明精子的結(jié)構(gòu)對有性生殖起決定性作用。Sakaushi等[13]報道了海金沙(Lygodiumjaponicum(Thunb.) Sw.)精子的鞭毛數(shù)、游動方向及超微結(jié)構(gòu)，從系統(tǒng)學(xué)的角度把精子與單細胞移動藻類進行了演化關(guān)系的討論。許冰等[14]對球子蕨(OnocleasensibilisL.)的精子行為也有過簡單報道，但缺乏圖像信息；就高等植物而言，種子植物精子的研究已經(jīng)深入到基因調(diào)控層面[15]，苔蘚植物精子已經(jīng)進行了動力學(xué)分析[16]，但對桫欏科植物精子的游動行為及其游動過程中的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化、精子對水媒介物質(zhì)的感知等方面尚無報道。而闡明桫欏類植物由精細胞至精子的完整變化過程、精子的行為和結(jié)構(gòu)，既是生殖生物學(xué)的基本補充，也是保護該科植物的必要環(huán)節(jié)。

筆筒樹(Sphaeropterislepifera(Hook.) R. M. Tryon)為中國桫欏科的重要物種，廣泛分布在臺灣省各地山區(qū)，在華南地區(qū)有少量引種栽培。近年來，臺灣的野生種群遭受大面積病害[17]，其生殖發(fā)育特征及其瀕危趨勢受到了廣泛關(guān)注。本研究通過孢子培養(yǎng)獲得成熟配子體，對精子器的發(fā)生、精細胞的發(fā)育、精子行為、精子結(jié)構(gòu)等進行了細致觀察，以期為中國桫欏科植物有性生殖研究、瀕危趨勢評估提供參考資料。

1 材料和方法

1.1 材 料

筆筒樹的孢子采自深圳仙湖植物園栽植10年以上的健康成熟植株，憑證標本現(xiàn)存于哈爾濱師范大學(xué)植物標本室(HANU)，孢子處理方法同曹建國等[9]。

1.2 方 法

取黑龍江省東部山區(qū)闊葉林下暗棕壤，按水∶土為2∶1的質(zhì)量比提取浸出液，用該浸出液配制1/2MS半固體(瓊脂占8‰)培養(yǎng)基，接種消毒后的孢子，置于20～28 ℃、光強50～80 μmol·m-2·s-1條件下培養(yǎng)至配子體成熟。在OLYMPUS SZX2-FOF實體顯微鏡下挑取有較多精子器的成熟配子體于載玻片上，滴加20～24 ℃的蒸餾水，置OLYMPUS BX53顯微鏡下觀察精細胞的釋放、精子的行為并吸取游動精子，用改良Noland染色液染色。改良Noland染色液的染色觀察法擬另文報道。精子器產(chǎn)精量、精子游動速度、精子自轉(zhuǎn)頻率等，均給出10個數(shù)值的范圍或平均值。

2 觀察結(jié)果

2.1 精細胞的逸出

筆筒樹配子體自50日齡起陸續(xù)產(chǎn)生精子器，精子器需5～8 d才能發(fā)育成熟，成熟的精子器呈截球型，直徑約50 μm，內(nèi)部精細胞輪廓清晰，數(shù)量為38～45個。遇水后成熟精子器的壁細胞吸水膨脹，引起蓋細胞縫裂，球形精細胞自裂縫處逐個逸出。精子器釋放用時約6～10 min，釋放的速度先快后慢(圖1)。多數(shù)精子器內(nèi)會留有1～2個精細胞不能逸出，于精子器內(nèi)轉(zhuǎn)化為游動精子。精子器成熟后若不能接觸明水，則始終無法釋放精細胞，3～4 d后精子器過熟，遇到明水也能釋放精細胞，只是精細胞不能轉(zhuǎn)化為游動精子。

2.2 精子運動行為

自精子器逸出的精細胞最初是不能運動的球形，15～30 s后，精細胞的細胞膜被水溶解，精子開始迅速運動，運動方式包括逆時針自轉(zhuǎn)和向前位移；游動精子可分為3個時期：初游期(initial period)、平穩(wěn)期(stable phase)和衰亡期(idecline period)。初游期即精細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫娱_始，至自轉(zhuǎn)速度和位移速度達到最大值時為止，時長約1～3 s，最大自轉(zhuǎn)頻率約200 r·min-1，最大位移速度約130 μm·s-1；平穩(wěn)期即精子維持最大自轉(zhuǎn)頻率和位移速度的時期，持續(xù)約17～20 min；衰亡期即精子自轉(zhuǎn)頻率和位移速度逐漸降低、直至靜止的時期，約5～7 min。

精子自掙脫質(zhì)膜束縛后迅速沿逆時針方向自轉(zhuǎn)，頻率于初游期結(jié)束時達到最大，平穩(wěn)期自轉(zhuǎn)頻率基本保持穩(wěn)定，衰亡期自轉(zhuǎn)頻率緩慢降低，5～7 min后精子停止自轉(zhuǎn)，鞭毛仍保持5～10 s的不規(guī)則顫動直至靜止死亡(圖2)。

每精子器平均逸出精細胞42(38～45)個圖1 筆筒樹精細胞自精子器逸出速度Per antheridium expelled 42 (38～45) sperm cells on averageFig.1 The speed of Sphaeropteris lepifera sperm cells escaping from antheridium

圖2 筆筒樹精子的自轉(zhuǎn)頻率Fig.2 The frequency of S. lepifera sperm rotation

圖3 筆筒樹精子的位移速度Fig.3 S. lepifera sperm’s displacement velocity

伴隨精子自轉(zhuǎn)頻率的升高，精子位移速度于初游期結(jié)束時達到最大；平穩(wěn)期精子游動速度基本保持穩(wěn)定，可在三維空間內(nèi)隨機變換方向，但筆者沒發(fā)現(xiàn)后退現(xiàn)象，即使遇到假根等障礙而原位轉(zhuǎn)動，也不后退；衰亡期的精子位移速度逐漸降低，最終靜止死亡(圖3)。

2.3 精子各時期形態(tài)

逸出的精細胞呈球形，直徑約6～8 μm，暫不能運動(圖版Ⅰ, 1)，自精子器逸出15～30 s后，細胞膜逐漸被水溶解變薄并被精子掙脫，質(zhì)膜破裂后，高度螺旋的精核于0.5 s內(nèi)向橫向及縱向同時彈開，側(cè)面觀表現(xiàn)為精核螺距增加(圖版Ⅰ, 2)，頂面觀表現(xiàn)為精核螺旋直徑擴大(圖版Ⅰ, 3)，精核初解旋過程中存在鞭毛呈輪狀排列的瞬間(圖版Ⅰ, 4)，隨著鞭毛的舒展，精子立即開始運動，自轉(zhuǎn)頻率及位移速度快速增加，精核進一步解旋，尾部可見直徑約5～7 μm由囊泡組成的泡狀體(圖版Ⅰ, 5)。平穩(wěn)期精子精核及鞭毛舒展程度達到最大，呈長10～13 μm、直徑2～3 μm、螺旋2.5～3.5圈的“s”形，前端脊部可見染色較深、長約6～8 μm的頂脊，泡狀體隨運動而逐漸萎縮(圖版Ⅰ, 6)。衰亡期精子逐漸縮短至8～10 μm，泡狀體消失并靜止死亡(圖版Ⅰ, 7)。

2.4 精子游動的方向性及死亡

本研究在人工添加不同濃度鈣鹽(擬另文發(fā)表)后發(fā)現(xiàn)，精子具有一定的驅(qū)化性，即在一定的濃度范圍內(nèi)，精子能由低濃度向高濃度定向移動(圖版Ⅰ, 8、9)。偶有小部分精子(≤10%)在衰亡期游動過程中突然解體死亡，解體后精核螺旋打開為長度約17～22 μm的棒狀，或兩端稍有彎曲，部分解體精子鞭毛帶脫落，精核與鞭毛帶分離，僅在頂端相連(圖版Ⅰ, 10)，精核不均質(zhì)(圖版Ⅰ, 11)，鞭毛帶長8～10 μm，其上有規(guī)律地著生有32～48條基本等長、長度約9～11 μm的尾鞭型鞭毛(圖版Ⅰ, 12)。偶見鞭毛分枝為近十條纖絲、僅基部緊密相連的束狀體(圖版Ⅰ, 13)。

3 討 論

圖4 真蕨精子結(jié)構(gòu)模式圖[18]Fig.4 The idepgreph of filicinae sperm[18]

本研究綜合筆筒樹和其他真蕨類[5,7-14,18-22]的精子特征，將其模式化如圖4，即由頂脊(apical ridge)、鞭毛帶(flagellar band)、鞭毛(flagella)、精核(sperm-nucleus)和泡狀體(vesicle)等5部分組成。頂脊位于精子前部,染色較深，在以往研究中曾被稱為“無毛部”(border-brim)[18]、密集脊(dense ridge)[19]、頂端“s”型結(jié)構(gòu)[22]，在傅氏鳳尾蕨(Pterisfauriei)中被稱為頂脊[7]，本研究因其存在于精子前端脊部，認為將其稱為頂脊較為合適。很多學(xué)者認為頂脊有維持精子空間結(jié)構(gòu)的作用[7,23]。劉寧等[23]曾認為精子鞭毛數(shù)量在演化過程中有增多的趨勢，結(jié)合過去關(guān)于鞭毛數(shù)量的研究，石松屬(LycopodiumL.)[18]、水韭屬(IsoetesL.)[6]、莢果蕨(Matteucciastruthiopteris(L.) Todaro)[11]、傅氏鳳尾蕨(Pterisfauriei)[7]和蘋屬(MarsileaL.)[18]的鞭毛數(shù)分別為2條、12～20條、32～40條、70～80條和140條，本研究觀察到筆筒樹鞭毛32～48條，根據(jù)鞭毛數(shù)判斷筆筒樹的進化程度應(yīng)該與莢果蕨[Matteucciastruthiopteris(L.) Todaro]較為接近，與秦仁昌分類系統(tǒng)基本吻合。

許冰等[14]指出，極低濃度的洗衣粉便會導(dǎo)致球子蕨(OnocleasensibilisL.)精子鞭毛脫落，周云龍等[20]發(fā)現(xiàn)蕨[Pteridiumaquilinum(L.) Kuhn]精子對化學(xué)物質(zhì)刺激較為敏感，李曉東等[6]認為精子壽命短、個體微小可能是水韭(IsoetesL.)瀕危的原因，而筆筒樹精子同樣對化學(xué)物質(zhì)敏感、壽命短、個體微小，且存在精細胞無法全部逸出、鞭毛易脫落等問題，本研究認為，筆筒樹等桫欏類植物出現(xiàn)的幼苗減少等生殖障礙問題可能與其精子的特性有關(guān)，在污染條件下可能更為明顯，因此建議有必要進行污染條件下桫欏科生殖狀況的相關(guān)研究。

關(guān)于泡狀體的報道較多，綜合前人的研究并結(jié)合筆筒樹精子的觀察，似乎可以將其分為如下3種類型：球子蕨(OnocleasensibilisL.)、莢果蕨[Matteucciastruthiopteris(L.) Todaro][11]等精子泡狀體在游動過程中始終存在，即宿存型(always existence type)；綿馬鱗毛蕨(Dryopteriscrassirhizoma)[10]等的精子擺脫質(zhì)膜及泡狀體后才成為游動精子，Ceratopterisrichardii[5]精子的泡狀體會在精細胞游動一段時間后與精核分離，即脫離型(abscission type)；筆筒樹精子游動過程中泡狀體附著于尾部，隨運動時間的延長而逐漸萎縮，即萎縮型(atrophy type)。

不同蕨類釋放精細胞的方式有所不同，蕨[Pteridiumaquilinum(L.) Kuhn][20]的釋放方式為批次排出、無法排盡，對開蕨[Phyllitisscolopendrium(L.) Newm.][21]的釋放方式為逐個逸出、可全部逸出，本研究觀察到筆筒樹精細胞逐個逸出、多數(shù)無法排盡；精子運動方面，筆筒樹精子不能后退，海金沙[Lygodiumjaponicum(Thunb.) Sw.][13]精子游動行為中也發(fā)現(xiàn)了精子缺乏向后運動的能力，結(jié)合單細胞藻類的鞭毛類型[24]和靈活改變運動方向的關(guān)系，本研究推測蕨類精子不能向后運動可能與缺少絨鞭和尾鞭的分化[20]有關(guān)。真蕨類精子對游動方向的選擇存在明顯的趨化性，有學(xué)者指出部分真蕨類精子對蘋果酸、檸檬酸存在趨化性[18]，并認為精子依靠化學(xué)誘導(dǎo)而進入頸溝，也有些學(xué)者認為精子通過改變自身的形態(tài)結(jié)構(gòu)而進入頸溝[8]，本研究也觀察到筆筒樹精子對鈣鹽存在明顯的趨化性，同意精子依靠化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)完成受精的觀點[18]。

一些研究表明，蕨類精子鞭毛帶只是著生鞭毛、輔助運動的結(jié)構(gòu)，并無染色質(zhì)分布[5,7,9-10]，對于精子而言，只有精核才包含遺傳物質(zhì)，考慮到蕨類受精孔直徑僅2～3 μm[25]，與螺旋的精核直徑相當，而鞭毛方向各異、長度普遍超過8 μm[5-6,11]，不易通過受精孔，因此本研究認為在受精過程中是精核與卵結(jié)合，鞭毛帶和鞭毛不進入受精孔，并推測筆筒樹精子鞭毛帶易與精核發(fā)生分離可能有助于完成受精。此外，通常認為電子顯微鏡下才能觀察到鞭毛的組成結(jié)構(gòu)，但本研究用油鏡在分枝為束狀體的鞭毛中也初步觀察到類似“9+2”的結(jié)構(gòu)(“9+2” pattern)[26]，與真蕨類的相關(guān)研究結(jié)果相同[23]，而基部未發(fā)生分叉的現(xiàn)象正與曹建國等[7]發(fā)現(xiàn)鞭毛基部存在電子致密的塞相印證。精核不均質(zhì)現(xiàn)象可能與遺傳功能不同有關(guān)。

參考文獻:

[1] 嚴岳鴻, 張憲春, 馬克平. 中國蕨類植物多樣性與地理分布[M]. 北京: 科學(xué)出版社， 2013: 76-147.

[2] 龍文興, 楊小波, 吳慶書, 等. 五指山熱帶雨林黑桫欏種群及其所在群落特征[J]. 生物多樣性, 2008,16(1): 83-90.

LONG W X, YANG X B, WU Q S,etal. Characteristics ofAlsophilapodophyllapopulation and it's community in the tropical rainforest in Wuzhi Mountains[J].BiodiversityScience, 2008,16(1): 83-90.

[3] 鞠文彬, 高信芬, 包維楷. 畫稿溪國家級自然保護區(qū)珍稀植物桫欏種群結(jié)構(gòu)與更新[J]. 植物科學(xué)學(xué)報, 2014,32(2): 113-121.

JU W B, GAO X F, BAO W K. Population structure and regeneration of the endangered tree fernAlsophilaspinulosain Huagaoxi National Nature Reserve, Southwestern China[J].PlantSclenceJournal, 2014,32(2): 113-121.

[4] TOM A R. Biology and Evolution of Ferns and Lycophytes[M]. Cambridge: Cambridge University Press, 2008: 107-171, 201-294, 417-448.

[5] LOPEZSMITH R, RENZAGLIA K. Sperm cell architecture, insemination, and fertilization in the model fern,Ceratopterisrichardii[J].SexualPlantReproduction, 2008,21(3): 153-167.

[6] 李曉東, 譚桂娟, 李小溪, 等. 中國特產(chǎn)2種瀕危水韭雄性發(fā)育的比較研究[J]. 西北植物學(xué)報, 2015,35(6): 1 142-1 147.

LI X D, TAN G J, LI X X,etal. Comparative study about development of microgametopyte of two endangered endemic quillwort species in China[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica, 2015,35(6): 1 142-1 147.

[7] 曹建國, 代小菲, 戴錫玲, 等. 傅氏鳳尾蕨成熟精子超微結(jié)構(gòu)的研究[J]. 電子顯微學(xué)報, 2009,28(5): 420-425.

CAO J G, DAI X F, DAI X L,etal. An ultrastructural study of the mature spermatozoid of the fernPterisfauriei[J].JournalofChineseElectronMicroscopySociety, 2009,28(5): 420-425.

[8] MYLES D G. The fine structure of fertilization in the fernMarsileavestita[J].JournalofCellScience, 1978,30(30): 265-281.

[9] 曹建國, 代小菲, 王全喜. 傅氏鳳尾蕨精子發(fā)生超微結(jié)構(gòu)的研究[J]. 云南植物研究, 2010,32(4): 303-314.

CAO J G, DAI X F, WANG Q X. An ultrastructural study of the spermatogenesis of the fernPterisfauriei(Pteridaceae)[J].ActaBotanicaYunnanica, 2010,32(4): 303-314.

[10] 曹建國, 何 群, 王全喜, 等. 綿馬鱗毛蕨精母細胞和游動精子超微結(jié)構(gòu)特征的研究[J]. 西北植物學(xué)報, 2005,25(4): 761-769.

CAO J G, HE Q, WANG Q X,etal. Spermatocyte and spermatozoid ultra-structures ofDryopteriscrassirhizoma[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica, 2005,25(4): 761-769.

[11] 包文美, 敖志文, 劉保東, 等. 東北蕨類植物配子體發(fā)育的研究V·球子蕨科[J]. 植物研究, 1998,8(3): 193-208.

BAO W M, AO Z W, LIU B D,etal. Studies on the development of gametophytes of ferns from North-eastern China V.Onocleaceae[J].BullBotRes, 1998,8(3): 193-208.

[12] 戴錫玲, 王全喜, 曹建國. 水蕨精子器及精子形態(tài)的顯微觀察[J]. 生物學(xué)通報, 2007,42(2): 56-56.

DAI X L, WANG Q X, CAO J G. Microscopic observation of antheridium and spermatozoid inCeratopteristhalictroides(L.)Brongn[J].BulletinofBiology, 2007,42(2): 56-56.

[13] SAKAUSHI S, OKOSHI M, MIYAMURA,et.al. Swimming behavior and ultrastructure of the sperm ofLygodiumjaponicum(Pteridophyta)[J].SexPlantReprod, 2003,16(3): 113-122.

[14] 許 冰, 劉保東. 球子蕨精子抗逆微生態(tài)的初步研究[C] //紀念秦仁昌論文集. 北京: 中國林業(yè)出版社, 1999: 347-351.

[15] WANG T, LIANG L, XUE Y,etal. A receptor heteromer mediates the male perception of female attractants in plants[J].Nature, 2016,531(7 593): 241.

[16] FURUICHI T, MATSUURA K. Kinetic analysis on the motility of liverwort sperms using a microscopic computer-assisted sperm analyzing system[J].EnvironmentalControlinBiology, 2016,54(1): 45-49.

[17] CHUEN-HSU F, HUEI-MEI H, CHI-YU C,etal. Ophiodiaporthe cyatheae gen. et sp. nov. a diaporthalean pathogen causing a devastating wilt disease ofCyathealepiferain Taiwan[J].Mycologia, 1900,105(4): 861-872.

[18] 湯淺 明. 植物の精子[M]. 東京: 東京大學(xué)出版會, 1969: 5-149.

[19] RENZAGLIA K S, WOOD K D, RUPP G,etal. Characterization of the sleepy sperm mutant in the fernCeratopterisrichardii: A new model for the study of axonemal function[J].CanadianJournalofBotany, 2004,82(11): 1 602-1 617.

[20] 周云龍, 劉 寧, 方 瑾, 等. 蕨游動精子光鏡和掃描電鏡的觀察[J]. 北京師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 1995,31(4): 506-508.

ZHOU Y L, LIU N, FANG J,etal. Observation of the spermatozoid ofPteridiumaquilinum(L.) kuhn. var.latiusculum(Desv.) Underw. under the light microscope and sem[J].JournalofBeijingNormalUniversity(Nat. Sci. Edi.), 1995,31(4): 506-508.

[21] MUCCIFORA S, WOO S L, GORI P. Ultrastructural features of spermatocytes and spermatozoids in the fernPhyllitisscolopendrium(L.) Newm. subsp.scolopendrium[J].SexualPlantReproduction, 2000,12(6): 323-331.

[22] 劉保東, 包文美, 敖志文. 中國產(chǎn)對開蕨配子體發(fā)育的研究[J]. 植物研究, 1991,11(2): 93-100.

LIU B D, BAO W M, AO Z W. Studies on the development of gametophyte ofPhyllitisjaponicafrom China[J].BulletinofBotanicalResearch, 1991,11(2): 93-100.

[23] 劉 寧, 劉建武. 蕨類植物精細胞運動器和細胞骨架的研究[J]. 植物學(xué)報, 2004,21(2): 164-171.

LIU N, LIU J W. The studies of the locomotory apparatus and cytoskeleton in the spermatozoid of ferns[J].ChineseBulletinofBotany, 2004,21(2): 164-171.

[24] 胡鴻鈞, 李堯英, 魏印心, 等. 中國淡水藻類[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1980: 93-129, 200-263.

[25] 代小菲, 姜 楠, 曹建國, 等. 闊鱗瘤蕨頸卵器形成與卵發(fā)生的初步研究[J]. 植物研究, 2010,30(4): 411-415.

DAI X F, JIANG N, CAO J G,etal. Primary study on the archegonium form ation and oogenesis in the fernPhymatosorushainanensis[J].BulletinofBotanicalResearch, 2010,30(4): 411-415.

[26] 翟中和, 王喜忠, 丁明孝. 細胞生物學(xué)(第4版)[M]. 北京: 高等教育出版社, 2011: 217-219.

圖版Ⅰ 筆筒樹[S. lepifera (Hook.) R. M. Tryon]精子的運動及死亡形態(tài)1.精細胞；2.精細胞側(cè)面觀；3.精細胞頂面觀；4.精子開始運動；5.初游期精子；6.平穩(wěn)期精子；7.精子死亡；8～9.精子的趨化性；10.精核與鞭毛帶分離；11.精核不勻質(zhì)；12.脫落的鞭毛帶及鞭毛；13.鞭毛分枝為束狀體PlateⅠ S. lepifera (Hook.) R. M. Tryon sperm’s movement and death morphologyFig.1. Sperm cell；Fig.2. Sperm cell norma lateralis；Fig.3. Sperm cell apical view；Fig.4. Sperm start motion；Fig.5. Initial period sperm；Fig.6. Stable phase sperm；Fig.7. Sperm death；Fig.8-9. Chemotaxis of sperm；Fig.10. Separation of sperm-nucleus and flagellar band；Fig.11. Sperm-nucleus unevenness；Fig.12. Shedding flagellar band and flagella；Fig.13. Flagella branch to fasciculation