譚淑娜，馮津萍，馮超，田翠燕，陳樹濤

心力衰竭（心衰）是心臟各種疾病的終末階段，5年生存率只有50%左右，尋找新的治療方案成為亟待解決的問題［1］。自噬是依賴溶酶體途徑對體內(nèi)受損細(xì)胞器及大分子物質(zhì)進(jìn)行降解的過程，受多個自噬相關(guān)基因（Atg）如 Beclin-1、Atg7、Atg5、Atg14 等的調(diào)控。自噬相關(guān)蛋白LC3BⅡ與P62的表達(dá)水平反映自噬水平的高低，其中自噬底物蛋白P62與自噬活性呈負(fù)相關(guān)［2］。最近研究表明，自噬亦存在于心衰心肌細(xì)胞中，但其對心臟的影響尚不明確［3］。曲美他嗪為長鏈3-酮酰輔酶A硫解酶（3-KAT）抑制劑，可用于心力衰竭的治療［4］，但其與自噬關(guān)系的研究較少。本研究通過檢測心衰及應(yīng)用曲美他嗪后大鼠心功能、心肌組織病理及自噬指標(biāo)等的變化，探討自噬對心肌細(xì)胞的作用及曲美他嗪對心肌自噬水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SPF級成年雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量210～250 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。曲美他嗪（天津施維雅制藥有限公司）；水合氯醛（索萊寶化學(xué)試劑公司）；超聲系統(tǒng)氣體麻醉裝置、Vevo2100小動物超聲儀（加拿大VisualSonics公司）；PV-Loop壓力-容積系統(tǒng)（上海然哲儀器設(shè)備有限公司）；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（武漢優(yōu)爾生科技股份公司）；兔抗鼠LC3B、GAPDH、P62一抗（Abcam公司），山羊抗兔LC3B、GAPDH、P62二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；TUNEL試劑盒、Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（羅氏公司）；DAPI染料、Trizol（Invitrogen公司）；PCR引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］。

1.2 方法

1.2.1 心衰模型的制作及動物分組 取雄性Wistar大鼠，依照傳統(tǒng)方法［5］建立由心肌梗死（MI）誘發(fā)的大鼠心衰模型，術(shù)后24 h超聲評價左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）小于0.50即MI模型制備成功，4周后超聲檢查LVEF小于0.35即心衰造模成功。簡單隨機抽樣法從中抽取20只分為模型組（M組）、曲美他嗪組（Q組），每組各10只。另設(shè)假手術(shù)組（S組）10只，除未結(jié)扎冠狀動脈外，余步驟與M組相同。Q組給予曲美他嗪15 mg·kg-1·d-1灌胃4周，其余2組給予等量生理鹽水灌胃4周。

1.2.2 左室超聲評價左心室功能 大鼠用異氟烷麻醉成功后，用Vevo2100小動物超聲儀于胸骨旁左室長軸和短軸采集左心室圖像，并在二維引導(dǎo)下獲得M型超聲心動圖，測量LVEF、左室短軸縮短率（FS）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）以及收縮末期左室后壁厚度（LPWS）、舒張末期左室后壁厚度（LPWD）。

1.2.3 有創(chuàng)血液動力學(xué)測定評價左心室功能 大鼠用5%水合氯醛按6 mL/kg腹腔注射麻醉后，于右側(cè)頸總動脈用PE10導(dǎo)管向近心端緩慢插入左心室，通過PV-Loop壓力-容積系統(tǒng)記錄大鼠心輸出量（CO）、左室收縮壓（LVSP）、左室舒張壓（LVDP）、左室舒張末壓（LVEDP）、等容收縮期左室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dtmax）以及等容舒張期左室內(nèi)壓最大下降速率（-dp/dtmax）。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測血清N-末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）和超敏肌鈣蛋白T（hs-TnT）水平 血液動力學(xué)測定結(jié)束后，在大鼠腹主動脈處取血，獲取血清標(biāo)本，按ELISA試劑盒說明書操作，檢測血清NT-proBNP和hs-TnT水平。

1.2.5 HE染色和Masson染色觀察心肌病理學(xué)改變 經(jīng)腹主動脈用磷酸鹽緩沖液（PBS）灌流，留取心臟組織，部分用于制備石蠟切片，行HE染色和Masson染色，觀察心肌組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)及膠原纖維的變化。

1.2.6 TUNEL染色觀察心肌凋亡情況 應(yīng)用石蠟切片進(jìn)行TUNEL熒光染色，實驗步驟參照試劑盒說明書。染色后應(yīng)用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核復(fù)染，觀察心肌細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7 Western blot法測定LC3B、P62的蛋白表達(dá) 剪取大鼠部分心肌組織包裹于錫箔紙中，液氮速凍30 min后，放入-80℃冰箱保存，后剪取30 mg心肌組織，剪碎，加入組織裂解液，使用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行組織破碎。4℃以12 000 r/min離心15 min提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，10%SDSPAGE電泳分離，上樣30μg/孔，恒壓120 V，3 h轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉 2 h，一抗 LC3B、p62、GAPDH（稀釋濃度均為 1∶1 000）4℃孵育過夜，二抗（稀釋濃度為1∶10 000）室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，用凝膠成像儀對膠片進(jìn)行掃描，用VersaDoc凝膠成像分析系統(tǒng)對目標(biāo)帶的灰度值進(jìn)行分析，計算LC3及P62與GAPDH灰度值比值即為LC3及P62蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.8 RT-PCR 檢測 Beclin-1、Atg7、Atg5、Atg14 的 mRNA表達(dá) 將超低溫保存的上述組織樣本50 mg采用Trizol一步法提取總RNA，用紫外分光光度計定量，取少量進(jìn)行RNA含量及純度測定，要求其OD260/OD280值處在1.7～2.0范圍。應(yīng)用Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)cDNA產(chǎn)物，條件：25℃10 min，48℃30 min，95℃5 min。應(yīng)用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)，各基因上、下游引物見表1。擴增條件：95℃10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。應(yīng)用 Bio-Rad實時定量PCR儀分析軟件調(diào)整閾值后，查看并分析數(shù)據(jù)，得到每個樣品反應(yīng)的Ct值，計算得到ΔCt，ΔCt=待測基因Ct值-內(nèi)參照基因（GAPDH）Ct值，并與對照組比較，取 2-ΔΔCt值進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

Tab.1 The sequence of detected gene primers表1 各檢測基因及內(nèi)參照引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間多重比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 曲美他嗪對心衰大鼠心臟超聲相關(guān)指標(biāo)的影響 M型超聲心動圖檢測結(jié)果顯示，與S組相比，M組 LVEF、FS、LPWD、LPWS 下降，LVEDD、LVESD 增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），大鼠心室腔擴張，左室室壁運動減弱，心功能下降。經(jīng)曲美他嗪治療4周后，與 M 組相比，Q 組 LVEF、FS、LPWD、LPWS升高，LVEDD、LVESD降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），大鼠心室腔擴張及左室室壁運動狀態(tài)得到改善，心功能有所提高，見圖1、表2。

2.2 曲美他嗪對心衰大鼠血流動力學(xué)的影響 PVLoop左室插管檢測大鼠左室壓力容積變化結(jié)果顯示，與 S組相比，M 組 CO、LVSP、LVDP 及±dp/dtmax降低，LVEDP升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），大鼠心功能降低。與M組相比，Q組CO、LVSP、LVDP及±dp/dtmax升高，LVEDP降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），大鼠心功能改善，見表3。

Fig.1 M type echocardiography of ventricular wall motion in three groups of rats圖1 各組大鼠室壁運動M型超聲心動圖

Tab.2 Comparison of ultrasound related indexes of left ventricle in rats of each group表2 各組大鼠左室超聲相關(guān)指標(biāo)比較 （n=10，±s）

Tab.2 Comparison of ultrasound related indexes of left ventricle in rats of each group表2 各組大鼠左室超聲相關(guān)指標(biāo)比較 （n=10，±s）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01；a與 S 組比較，b與 M 組比較，P＜0.05；表 3～5 同

?

Tab.3 Hemodynamic indexes in three groups of rats表3 各組大鼠血液動力學(xué)相關(guān)指標(biāo) （n=10，±s）

Tab.3 Hemodynamic indexes in three groups of rats表3 各組大鼠血液動力學(xué)相關(guān)指標(biāo) （n=10，±s）

?

2.3 曲美他嗪對心衰大鼠心肌組織的影響 HE染色結(jié)果（心臟橫切圖）顯示，與S組相比，M組大鼠左室擴張，左室前壁變薄，梗死區(qū)較大；與M組相比，Q組此病理情況得到改善。高倍鏡下，S組心肌細(xì)胞大小、結(jié)構(gòu)正常，排列整齊；M組左室梗死區(qū)心肌細(xì)胞排列紊亂，界限不清，呈現(xiàn)明顯水腫和壞死，且大量炎性細(xì)胞浸潤，心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重；與M組相比，Q組明顯改善，細(xì)胞排列略不整齊，略腫脹，部分壞死，有少量炎性細(xì)胞浸潤，見圖2。Masson染色結(jié)果顯示，與S組相比，M組大鼠左室梗死區(qū)存在大片藍(lán)色膠原沉積；與M組相比，Q組梗死區(qū)藍(lán)色膠原沉積明顯減少，曲美他嗪可減少心肌梗死后的膠原沉積，改善左室病理性重構(gòu)，見圖3。

Fig.2 Results of HE staining in myocardial tissues of three groups of rats圖2 各組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果

Fig.3 Results of Masson staining in myocardial tissues of three groups of rats(×40)圖3 各組大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果（×40）

Fig.4 Results of TUNEL/DAPI staining in myocardial tissues of three groups of rats(TUNEL/DAPI,×50)圖4 各組大鼠心肌組織TUNEL/DAPI染色結(jié)果（TUNEL/DAPI，×50）

2.4 曲美他嗪對心力衰竭大鼠NT-proBNP、hs-TnT的影響 ELISA法檢測結(jié)果顯示，與S組相比，M組血清NT-proBNP、hs-TnT水平明顯升高，與M相比，Q組NT-proBNP和hs-TnT水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），曲美他嗪可減輕心衰心肌細(xì)胞損傷，見表4。

Tab.4 Indexes of NT-proBNP and hs-TnT in three groups of rats表4 各組大鼠NT-proBNP、hs-TnT指標(biāo) （ng/L，±s）

Tab.4 Indexes of NT-proBNP and hs-TnT in three groups of rats表4 各組大鼠NT-proBNP、hs-TnT指標(biāo) （ng/L，±s）

組別S組M組Q組F n 10 10 10 NT-proBNP 134.88±24.21 357.08±29.79a 235.12±15.49b 130.100＊＊hs-TnT 58.27±19.23 199.71±74.57a 102.53±36.34b 10.830＊＊

2.5 曲美他嗪對心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL/DAPI染色結(jié)果顯示，與S組相比，M組中綠色熒光所指示的凋亡小體數(shù)量較多，MI后心衰大量心肌細(xì)胞凋亡。與M組相比，Q組綠色熒光明顯減少，經(jīng)曲美他嗪治療后心肌細(xì)胞凋亡明顯減少，見圖4。

2.6 曲美他嗪對LC3B、P62蛋白和Beclin-1、Atg7、Atg5、Atg14的mRNA表達(dá)的影響 Western blot及RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與S組相比，M組LC3B蛋白和Beclin-1、Atg5、Atg7及Atg14的mRNA表達(dá)水平降低，P62蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與M組相比，Q組LC3B蛋白和Beclin-1、Atg5、Atg7及Atg14的mRNA表達(dá)水平升高，P62蛋白的表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），曲美他嗪可以抑制心肌梗死后心衰引起的自噬體合成量減少，并且增加自噬流的暢通性，見表5。

Tab.5 Comparison of autophagy related protein and autophagy related gene expressions between three groups表5 各組大鼠自噬相關(guān)蛋白及自噬相關(guān)基因相對表達(dá)水平的比較 （n=10，±s）

Tab.5 Comparison of autophagy related protein and autophagy related gene expressions between three groups表5 各組大鼠自噬相關(guān)蛋白及自噬相關(guān)基因相對表達(dá)水平的比較 （n=10，±s）

組別LC3B P62Beclin-1 S組M組Q組F 3.78±0.38 1.03±0.07a 2.21±0.49b 29.730＊＊1.94±0.22 3.97±0.56a 2.48±0.51b 10.980＊＊1.02±0.06 0.38±0.04a 0.69±0.06b 64.900＊＊組別S組M組Q組F Atg5 0.95±0.07 0.54±0.07a 0.70±0.03b 24.220＊＊Atg7 1.09±0.10 0.40±0.12a 0.77±0.08b 21.760＊＊Atg14 0.90±0.04 0.53±0.04a 0.62±0.04b 49.570＊＊

3 討論

心力衰竭是多種病因引起心肌損害的最終結(jié)果，隨著發(fā)病率增加，雖然出現(xiàn)了干細(xì)胞移植、左室輔助裝置（LVAD）等新的治療方法，其死亡率仍逐年增加［6-7］，是否有除神經(jīng)內(nèi)分泌、細(xì)胞因子外的其他機制參與其發(fā)生發(fā)展成為當(dāng)前研究的新方向［8］。在心衰心肌細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)自噬后，對其研究成為熱點，但自噬是作為一種保護(hù)性機制抑或損傷性機制尚不明確。Lu等［9］在阿霉素誘導(dǎo)的心衰大鼠中，應(yīng)用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤后，發(fā)現(xiàn)大鼠Beclin-1表達(dá)降低，伴隨心肺血流動力學(xué)改善，線粒體膜通透性降低，Na+-K+-ATP酶活性增高，推測自噬在阿霉素誘導(dǎo)的心力衰竭中發(fā)揮致病作用，可能通過損傷線粒體實現(xiàn)。Kassiotis等［10］檢測了待移植擴張型心肌病患者植入LVAD后心功能及自噬相關(guān)基因、相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)植入LVAD后自噬水平下降，心功能改善，推測自噬為心力衰竭的適應(yīng)性機制，植入LVAD后可減弱該現(xiàn)象。上述兩項實驗僅研究阿霉素誘導(dǎo)的心力衰竭及擴張型心肌病的心功能與自噬水平之間的關(guān)系，未涉及心肌梗死后心衰自噬水平的變化、曲美他嗪干預(yù)實驗及對心肌組織病理方面的研究。本研究通過觀察梗死后心衰及應(yīng)用曲美他嗪后心肌自噬水平及心功能、病理等指標(biāo)變化，探討自噬對心肌細(xì)胞的作用及曲美他嗪對心肌自噬水平的影響。

本研究結(jié)果顯示，大鼠心肌梗死后心功能惡化、間質(zhì)纖維化加重、心肌細(xì)胞大量凋亡、損傷加重、炎性細(xì)胞浸潤并伴隨自噬水平下降、自噬流被阻斷；應(yīng)用曲美他嗪后，自噬水平升高、自噬流恢復(fù)暢通，伴隨心肌細(xì)胞凋亡減少，損傷減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少，間質(zhì)纖維化減弱，心功能改善，提示自噬對心肌細(xì)胞有保護(hù)作用，可能與其抑制心肌細(xì)胞凋亡及間質(zhì)纖維化、減輕心肌細(xì)胞損傷、減少炎性細(xì)胞浸潤，進(jìn)而抑制心肌重構(gòu)有關(guān)；應(yīng)用曲美他嗪后，心功能改善，與其上調(diào)自噬水平，增加自噬流暢通有關(guān)。

本研究為心衰的治療提供了新思路，但由于樣本量較小，僅限于動物研究，未對自噬改善心功能的機制進(jìn)行基因水平的分析，有待進(jìn)一步深入探討。

［1］WRITING COMMITTEE MEMBERS，Yancy CW，Jessup M，et al.2016 ACC/AHA/HFSA Focused update on new pharmacological therapy for heart failure：An updateof the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure：A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical practice Guidelines and the Heart Failure Society of America［J］.Circulation，2016，134（13）：e282-e293.doi：10.1161/CIR.0000000000000435.

［2］Orogo AM，Gustafsson AB.Therapeutic targeting of autophagy：potentialandconcernsintreatingcardiovasculardisease［J］.CircRes，2015，116（3）：489-503.doi：10.1161/CIRCRESAHA.116.303791.

［3］Delbridge LMD，Mellor KM，Taylor DJ，et al.Myocardial stress and autophagy：mechanisms and potential therapies［J］.Nat Rev Cardiol，2017，14（7）：412-425.doi：10.1038/nrcardio.2017.35.

［4］McCarthy CP，Mullins KV，Kerins DM.The role of trimetazidine in cardiovascular disease：beyond an anti-anginal agent［J］.Eur Heart J Cardiovasc Pharmacother，2016，2（4）：266-272.doi：10.1093/ehjcvp/pw051.

［5］Xu K，George I，Klotz S，et al.Erythropoietin derivate improves left ventricular systolic performance and attenuates left ventricular remodeling in rats with myocardial infarct-induced heart failure［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2010，56（5）：506-512.doi：10.1097/FJC.0b013e3181f4f05a.

［6］Fisher SA，Doree C，Mathur A，et al.Meta-analysis of cell therapy trials for patients with heart failure［J］.Circ Res，2015，116（8）：1361-1377.doi：10.1161/CIRCRESAHA.116.304386.

［7］Vernooy K，van Deursen CJ，Strik M，et al.Strategies to improve cardiac resynchronization therapy［J］.Nat Rev Cardiol，2014，11（8）：481-493.doi：10.1038/nrcardio.2014.67.

［8］Dick SA，Epelman S.Chronic heart failure and inflammation：what do we really know?［J］.Circ Res，2016，119（1）：159-176.doi：10.1161/CIRCRESAHA.116.308030.

［9］Lu L，Wu W，Yan J，et al.Adriamycin-induced autophagic cardiomyocyte death plays a pathogenicrole in a rat model of heart failure［J］.Int J Cardiol，2009，134（1）：82-90.doi：10.1016/j.ijcard.2008.01.043.

［10］Kassiotis C，BallalK，Wellnitz K，et al.Markers of autophagy are downregulated in failing human heart［J］.Circulation，2009，120（11）：191-197.doi：10.1161/CIRCULATIONAHA.108.842252.