孫志鵬，呂偉華，匡友誼，鄭先虎，佟廣香，孫效文，程磊，何立川，曹頂臣，吳學(xué)農(nóng)

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070）

玻璃缺鰭鯰（玻璃貓魚）Kryptopterus vitreolus屬鯰科、缺鰭鯰屬，主要分布于泰國、馬來西亞和印度尼西亞，體長一般12～18cm，是一種常見的觀賞魚。玻璃缺鰭鯰全身無鱗，缺乏色素，游泳時看上去像一副魚類骨骼在飄動，因此又稱為“幽靈魚”。魚類線粒體基因組（Mitochondrial DNA，mtDNA）與其他脊椎動物相似，是閉合雙鏈環(huán)狀DNA，長度一般在15.7～19.5kb，由37個編碼基因、輕鏈復(fù)制起始區(qū)（OL）、主要的控制區(qū)（CR）及散布于不同基因間的非編碼序列組成。mtDNA作為細(xì)胞核外具有自主復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯能力的遺傳因子，相比于核DNA，其結(jié)構(gòu)簡單、拷貝數(shù)多、母系遺傳、進(jìn)化速度快、不同區(qū)域進(jìn)化速率不同，而且易于擴增測序?；谶@些優(yōu)點，線粒體基因已作為分子標(biāo)記應(yīng)用到魚類的物種鑒別、分類及系統(tǒng)發(fā)育等研究領(lǐng)域中[1-6]。

缺鰭鲇屬分類較為混亂，相關(guān)研究較少，直至2013年玻璃缺鰭鯰才被正式定種。路斌等[7]在西雙版納羅梭江魚類資源調(diào)查中發(fā)現(xiàn)了湄南缺鰭鲇Kryptopterus moorei；楊光等[8]對8種鯰科魚類的ITS序列與18s序列的研究中報道，雙須缺鰭鲇Kryptopterus bicirrhis18s序列為 1 833bp，ITS1序列為408bp，ITS2序列為339bp。本研究測定了玻璃缺鰭鯰全線粒體基因組，對豐富缺鰭鲇屬基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和系統(tǒng)進(jìn)化研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

30尾玻璃缺鰭鯰購自哈爾濱四平觀賞魚公司，現(xiàn)有24尾養(yǎng)殖于黑龍江水產(chǎn)研究所斑馬魚生態(tài)實驗室。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

取玻璃缺鰭鯰尾部肌肉，采用Sambrook等[9]的方法和酚-氯仿提取總DNA，用Nanodrop 8000及1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA核酸含量和質(zhì)量。

1.2.2 引物設(shè)計與PCR的擴增

利用已發(fā)表的瓦氏黃顙魚Pelteobagrus vachelli[6]16對線粒體基因組擴增引物對玻璃缺鰭鯰線粒體基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，其中6對（P.V3、P.V5、P.V8、P.V9、P.V13和 P.V15本實驗中分別編號為KV.2、KV.4、KV.6、KV.7、KV.11 和 KV.13）可以擴增得到目的片段。利用NCBI比對測序得到的序列與南方鲇Silurus meridionalis相似度最高。根據(jù)比對結(jié)果，利用Primer 3再設(shè)計9對引物（KV.1、KV.3、KV.5、KV.8、KV.9、KV.10、KV.12、KV.14 和 KV.15）。15對引物見表1。

表1 玻璃缺鰭鯰線粒體基因組擴增引物Tab.1 Mitochondrial genome amplification primers of catfish Kryptopterus vitreolus

PCR反應(yīng)體系為50μL，包括10mmol/L Tris-Cl（pH8.0），50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，上下游引物（10μmol/L）各 2μL，Taq DNA 聚合酶 3U，DNA 模板（50ng/μL）6μL，補無菌水到50μL。反應(yīng)程序為 94℃預(yù)變性 3min；94℃變性30s，52～62℃復(fù)性 30s，72℃延伸 30s，35 個循環(huán)；最后72℃延伸5min，4℃保存。

1.2.3 測序與序列拼接

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒（康為世紀(jì)）純化，純化產(chǎn)物連接到pMD18-T（TaKaRa）載體（反應(yīng)體系及反應(yīng)時間按照說明書進(jìn)行），轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行克隆，選擇陽性克隆進(jìn)行測序。由DNAMAN分析測序結(jié)果，用Staden（1.7）進(jìn)行序列拼接。

1.2.4 序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化分析

表2 玻璃缺鰭鯰線粒體基因組結(jié)構(gòu)Tab.2 Organization of the mitochondrial genome of catfish K.vitreolus

拼接得到線粒體全基因組序列，DNAMAN統(tǒng)計序列全長、堿基百分比等信息，利用GenBank數(shù)據(jù)庫在線工具 Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析序列同源性，結(jié)合 tRNA Scan-SE 1.21（http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/）定位tRNA基因、蛋白質(zhì)編碼基因、rRNA基因和D-loop區(qū)，以確定玻璃缺鰭鯰線粒體基因組的基因結(jié)構(gòu)。

查找GenBank中脊椎動物線粒體核苷酸序列，使用Clustal W軟件對5種魚類全序列及13個編碼蛋白基因的核苷酸序列分別進(jìn)行比對分析?；?個科12種魚與2個外群的線粒體D-loop區(qū)核苷酸序列，由Modeltes選擇最適模型，使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootsrap值1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組結(jié)構(gòu)

玻璃缺鰭鯰線粒體基因組全長16 662bp（Genbank accession number，KY710750），包括 2 個 rRNA基因、22個tRNA基因、13個編碼蛋白質(zhì)基因和一個非編碼控制區(qū)。玻璃缺鰭鯰線粒體基因組結(jié)構(gòu)和基因排列順序與已公布的鲇形目魚類完全一致。其中 ND6、tRNA-Pro、tRNA-Glu、tRNA-Ser、tRNA-Alu、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr和 tRNA-Gln 在 L鏈外其他大多數(shù)基因在H鏈編碼（表2）。

A、T、C和 G四種堿基組成分別為：30.54%、26.34%、27.76%和15.36%，其中A+T含量（56.88%）明顯高于G+C含量（43.12%）?；蚪M共包含9個基因間隔區(qū)，間隔長度1～34bp，最大間隔在tRNA-Asn和tRNA-Cys基因之間；基因間共存在12處重疊，重疊堿基數(shù)1～10bp，最長的重疊區(qū)位于ATP6和COX3基因。玻璃缺鰭鯰線粒體全基因組中除COX1以GTG為起始密碼子外，其余12個編碼蛋白的基因都以ATG開頭。7個編碼蛋白基因（ND1、Cox1、ATP8、ATP6、ND4L、ND5 和 ND6） 以TAA終止，其余6個編碼蛋白的基因沒有完整的終止密碼子，包括Cox2、ND3和ND4以T終止，ND2、Cox3和CYTB以TA終止。

2.2 控制區(qū)（D-LOOP）結(jié)構(gòu)

魚類mtDNA D-loop區(qū)一般分為三個部分：終止序列區(qū)（termination associated sequences，TAS）、中央保守區(qū)（central conserved sequence block，CSB）和保守序列區(qū)（conserved sequence block，CSB）。參考其他魚類控制區(qū)分析結(jié)果[10]推測出，本實驗得到的玻璃缺鰭鯰的線粒體控制區(qū)結(jié)構(gòu)包括：潛在終止區(qū)域（ETAS）位于 15 712～15 733bp，5個保守區(qū)域分別為CSB-1（16269～16288bp）、CBS-2（16377～16394bp）、CBS-3（16 402～16 420）、CBS-D（16 023～16 050bp）和 CBS-E（15 982～16 007 bp）。保守區(qū)域以 CSB-E開始，CSB1為中央保守區(qū)域和保守區(qū)域的分界線。

2.3 核苷酸序列比對分析

使用ClustalW軟件對玻璃缺鰭鯰、南方鲇、鲇Silurus asotus、黑翅反游貓魚Synodontis schoutedeni及斑馬魚Danio rerio的線粒體基因組全序列及13個編碼蛋白基因的核苷酸序列分別進(jìn)行比對分析（表3）。序列分析表明，玻璃缺鰭鯰與鲇科其他種屬間具有較高的同源性（序列一致性介于76.23%～86.7%之間），其中與南方鲇最高（86.7%）。5種魚之間線粒體基因組中COX1基因相對最保守，相似度為78.98%～92.78%。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

基于12種魚類與人Homo sapiens和小鼠Mus musculus（外群）線粒體基因組D-loop區(qū)核苷酸序列，使用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。所選擇的12種魚類包括：玻璃缺鰭鯰、南方鲇、鲇、黑翅反游貓魚、荷馬條鰍Homatula variegatus、虎頭鯊Pangasianodon hypophthalmus、鳙 Hypophthalmichthys nobilis、新疆高原鰍Triplophysa strauchii、蒙古鲌Chanodichthysmongolicus、虹鱒 Oncorhynchusmykiss、斑點叉尾Ictalurus punctatus、大西洋鮭 Salmo salar。從圖1中可以看出，玻璃缺鰭鯰獨自為一支，但與鲇和南方鲇親緣關(guān)系最近。

圖1 玻璃缺鰭鯰D-loop核酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of catfish Kryptopterus vitreolus based on sequences of D-loop

表3 5種魚類線粒體基因組比較Tab.3 Similarity of 13 pairs of homolog gene between 5 fish species

續(xù)表3

3 討論

3.1 線粒體基因組全序列分析

玻璃缺鰭鯰線粒體基因組的基因排列順序與已公布的鲇形目魚類線粒體基因組完全一致，各基因長度也基本一致，證明了線粒體基因組在進(jìn)化上的高度保守型。玻璃缺鰭鯰mtDNA的tRNATrp-tRNAAla-tRNAAsn-tRNACys-tRNATyr區(qū)包含一個典型的“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)[11]，tRNAAsn與tRNACys之間有一段34bp區(qū)域，這段區(qū)域可能是L鏈復(fù)制起點（OL）的“Stemloop”結(jié)構(gòu)[12]。在其他脊椎動物中，如兩棲類[13]、魚類[14]及哺乳類[15]等也有類似結(jié)構(gòu)，但在鳥類[16]和鱷類[17]中尚未發(fā)現(xiàn)。蒲友光等[18]認(rèn)為該結(jié)構(gòu)可能具有種屬特異性，推測它為脊椎動物線粒體基因組的進(jìn)化特征。

在13個編碼蛋白的基因中有6個沒有完整的終止密碼子，包括Cox2、ND3和ND4以T終止，ND2、Cox3和CYTB以TA終止，這種現(xiàn)象普遍存在于線粒體基因組中。雖然沒有終止密碼子，但其DNA序列表明其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3'末端為T或TA，加上線粒體mRNA 3'末端含有PloyA尾，因此轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在加工過程中加接上多腺苷酸后可以形成TAA終止密碼子。

3.2 控制區(qū)（D-loop）結(jié)構(gòu)分析

終止區(qū)域（ETAS）是D-loop區(qū)變異最大的部分，存在不同程度的串聯(lián)重復(fù)序列。一般認(rèn)為，每個重復(fù)序列中都含有一個保守的終止相關(guān)序列（termination associated sequences，TAS），由于 TAS 序列均存在著TACATATGTA這一個穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，它可能是與H鏈復(fù)制終止有關(guān)的信號。本實驗參照TAS發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列，在玻璃缺鰭鯰D-loop區(qū)僅識別到一個潛在終止序列E-TAS，沙鰍亞科（Botiinae）[19]、鱖屬Siniperca[20]和白魚Anabarilius grahami[21]也僅含有一個終止區(qū)域。而朱世華等[22]在大部分鲹科（Carangidae）魚類中識別到了2個終止相關(guān)序列。對于這種多終止相關(guān)序列的現(xiàn)象，劉煥章[23]認(rèn)為只有1個TAS行使功能，其他的都是復(fù)制的沒有終止功能。但具體該區(qū)含有幾個終止相關(guān)序列及其功能問題研究的較少，有待進(jìn)一步研究。

中央保守區(qū)CSB是整個控制區(qū)最為保守的區(qū)域，幾乎在所有的種類中都十分保守。曾青蘭等[24]識別了大口胭脂魚Ictiobus cyprinellus的CSB-D序列；Lee等[25]對眾多魚類的序列進(jìn)行比較時，也僅識別了CSB-D的存在，而在大部分魚類的研究中都已識別出CSB-F、CSB-E和CSB-D，并確定了其關(guān)鍵序列。其中CSB-D序列較穩(wěn)定，很容易識別，CSB-E含有GTGGG-box特殊結(jié)構(gòu)[19-23]。本實驗對照其他魚類的中央保守區(qū)序列，成功識別了玻璃缺鰭鯰的CSB-D和CSB-E序列，但未找到CSB-F。

魚類中一般都存在保守序列區(qū)CSB的3個保守序列區(qū)。有學(xué)者認(rèn)為，CSB1一般與將近完成H鏈替代合成的終止信號有關(guān)；而CSB2和CSB3可能與H鏈的復(fù)制起始有關(guān)[26]。其中CSB1在魚類中的變異較大，不易識別。雖然Broughton等[27]和劉煥章[23]認(rèn)為GACATA最為保守，可以幫助識別CSB1的存在，但在很多魚類卻并非如此。赫崇波等[28]在圓斑星鰈Verasper variegatus識別出的CSB1并未存在該段保守序列。張燕等[29]在科識別出的CSB1與之描述也不同，但本實驗測得的玻璃缺鰭鯰CSB1序列（TCTATTGACATAACTGGTCC）的特征與大多數(shù)魚類的CSB1一致。

3.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

線粒體DNA的D-loop區(qū)長度和進(jìn)化速率適中,以及富含系統(tǒng)發(fā)育信息等特點,被作為DNA通用標(biāo)簽廣泛應(yīng)用于種質(zhì)鑒定、物種分類和系統(tǒng)進(jìn)化研究。彭士明等[30]利用銀鯧Pampus argenteus的線粒體D-loop區(qū)序列比較分析了養(yǎng)殖與野生銀鯧Pampus argenteus群體的遺傳多樣性。董志國等[31]利用三疣梭子蟹Portunus trituberculatus的線粒體D-loop區(qū)序列分析了中國海三疣梭子蟹的遺傳多樣性。姬南京等[32]利用仿刺參Apostichopus japonicas Selenka的線粒體D-loop區(qū)序列分析了大連、朝鮮羅津和俄羅斯海參崴3個仿刺參群體的遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)生。本研究應(yīng)用玻璃缺鰭鯰線粒體DNA D-loop區(qū)序列與其他鲇形目魚類進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析和物種鑒定分析。結(jié)果表明，以D-loop區(qū)序列為標(biāo)記可有效分析鲇形目魚類的系統(tǒng)進(jìn)化與分類關(guān)系。目前關(guān)于缺鰭鯰屬的研究有限，線粒體相關(guān)數(shù)據(jù)更是甚微，本實驗通過對玻璃缺鰭鯰線粒體全基因組序列的測定，遺傳控制區(qū)的分析，以及系統(tǒng)進(jìn)化的討論，為豐富缺鰭鯰屬基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)和促進(jìn)鯰屬系統(tǒng)進(jìn)化研究具有重要意義。

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