晁麗娜 許賢瑞 王旭 李琪 劉美麗 張慶
癲癇(epilepsy)是神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)病。應(yīng)用抗癲癇藥物(antiepileptic drugs,AEDs)有效控制癇性發(fā)作仍是目前癲癇治療的首選方法。癲癇患者個(gè)體化用藥及用藥安全性問(wèn)題受到廣泛關(guān)注。AEDs種類繁多,其中,拉莫三嗪(lamotrigine,LTG)與卡馬西平(carbamazepine,CBZ)、奧卡西平(oxcarbazepine,OXC),苯巴比妥(phenobarbitone,PB)、苯妥英鈉(phenytoin,PHT)在化學(xué)結(jié)構(gòu)上均具有苯環(huán)而被統(tǒng)稱為芳香族抗癲癇藥物(aromatic antiepileptic drugs,AAEDs)[1]。臨床實(shí)踐提示,AAEDs較其他AEDs更易誘發(fā)皮膚不良反應(yīng)(cutaneous adverse reactions,cADRs)[1]。cADRs已成為臨床停用或更換AAEDs的主要原因,給患者和醫(yī)生造成困擾[2]。目前,AAEDs誘發(fā)cADRs的確切發(fā)病機(jī)制尚未闡明?,F(xiàn)有的研究表明AAEDs誘發(fā)cADRs可能涉及特定的人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)分子,藥物或其代謝產(chǎn)物和特異性T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)的相互作用[3]。TCR是T細(xì)胞表面的受體分子,其作用是識(shí)別抗原和參與免疫應(yīng)答。不同的抗原刺激會(huì)引起TCR β鏈可變區(qū)(beta chain variable region,BV)基因(TCRBV基因)片段的限制性取用。對(duì)其他藥物(如青霉素、巴氨西林和對(duì)二苯胺)引起過(guò)敏反應(yīng)的研究證實(shí):不同藥物引起過(guò)敏反應(yīng)時(shí)TCRBV基因表達(dá)譜出現(xiàn)差異[4-6]。基于上述情況,本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)研究LTG激活T細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答而誘發(fā)cADRs的可能致病機(jī)制,分析在LTG誘發(fā)的cADRs(LTG-cADRs)患者與LTG耐受者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中,TCRBV基因表達(dá)的差異,以期明確LTG-cADRs與TCRBV基因表達(dá)是否存在相關(guān)性。
1.1觀察對(duì)象本研究應(yīng)用巢式病例對(duì)照研究方法。選取2014-12—2016-12寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診確診為癲癇并口服LTG治療的患者為研究隊(duì)列,收集患者的臨床資料。癲癇患者服用LTG的起始劑量及增加劑量,均按照《中國(guó)藥典2010》關(guān)于LTG的相關(guān)說(shuō)明內(nèi)容進(jìn)行,口服LTG的起始劑量均≤12.5 mg/d。依照Mockenhaupt M(2009)cADRs診斷與分型標(biāo)準(zhǔn)[7]執(zhí)行。將隊(duì)列內(nèi)cADRs已治愈達(dá)6周以上的LTG-cADRs患者作為病例組。以年齡相差±3歲、性別和民族相同為原則,按照1︰1配對(duì)設(shè)計(jì)選取該隊(duì)列內(nèi)口服LTG時(shí)間大于12周而未出現(xiàn)cADRs者作為對(duì)照組。
本次共納入癲癇患者20例,其中病例組10例,對(duì)照組10例。(1)病例組:男6例、女4例,年齡17~56歲,平均年齡(34.50±13.71)歲?;颊咧袧h族7例,回族3例,1例有花粉過(guò)敏史。10例cARDs均為輕型的斑丘疹(maculopapular eruption,MPE),無(wú)嚴(yán)重皮膚不良反應(yīng)者。10例中1例以6.25 mg/d的劑量口服LTG至第5天時(shí)發(fā)生cADRs,3例以12.5 mg/d口服LTG時(shí)發(fā)生cADRs,其余6例均以≥25 mg/d口服LTG時(shí)發(fā)生cADRs,發(fā)生cADRs距開(kāi)始服用LTG的時(shí)間最長(zhǎng)為60 d,最短為1 d,中位數(shù)為11.5 d,四分位數(shù)間距32.5 d。(2)對(duì)照組:年齡為19~53歲,平均年齡為(34.20±12.70)歲。
1.2主要試劑與儀器植物凝集素(PHA)及人外周血淋巴細(xì)胞分離液(北京Solarbio公司),F(xiàn)BS(浙江天杭生物科技有限公司),PBS(美國(guó)HyClone公司),RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基(美國(guó)gibco公司),Recombinant Human IL-2(美國(guó)Pepro Tech公司),LTG標(biāo)準(zhǔn)品(英國(guó)Glaxo Smith Kline公司),總RNA提取試劑盒(北京天根公司),F(xiàn)irst Strand cDNA Synthesis Kit及CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司),2×TransStart?Tip Green qPCR Mix(北京全式金生物有限公司),人干擾素γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素5(IL-5)及腫瘤壞死因子β(TNF-β)ELISA檢測(cè)試劑盒(北京欣博盛生物科技有限公司),高速低溫離心機(jī)(德國(guó)HERMLE公司),電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司),25號(hào)細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國(guó)Corning公司),倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司),東勝龍PCR儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司),酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃集團(tuán)),實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(iCyeler iQ5)(美國(guó)BIO-RAD公司)。
1.3方法
1.3.1實(shí)驗(yàn)標(biāo)本收集:收集病例組和對(duì)照組新鮮全血,每例抽取2 mL血常規(guī)管(含EDTA)4管(共8 mL),置于4℃冰箱保存,于4 h內(nèi)行PBMCs分離實(shí)驗(yàn)。
1.3.2PBMCs的分離:用無(wú)菌巴氏滴管從血常規(guī)管中取出8 mL新鮮全血,用PBS等體積稀釋。另取1支離心管,加入人外周血淋巴細(xì)胞分離液4 mL。吸取等體積的稀釋血液平鋪于分離液液面上方,保持兩液面界面清晰。室溫下,以1000g離心30 min,吸取出全部白膜層,移入另一空白離心管中,加入10 mL的PBS,吹吸混勻,以250g離心10 min。棄去上清,加入5 mL的PBS,吹打30次重懸細(xì)胞后以250g離心10 min(重復(fù)此步驟洗滌細(xì)胞兩次)。棄上清,加入含有15%(體積分?jǐn)?shù))FBS的RPMI1640培養(yǎng)液1 mL,吹打重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。
1.3.3PBMCs培養(yǎng)與干預(yù):培養(yǎng)條件為:嚴(yán)格無(wú)菌操作,37℃恒溫培養(yǎng),5%(體積分?jǐn)?shù))CO2,飽和濕度。用臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行PBMCs活力檢測(cè),若活細(xì)胞數(shù)達(dá)90%或以上,吸取已重懸的PBMCs加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,再加入含有15%(體積分?jǐn)?shù))FBS的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液,調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL。然后向細(xì)胞中加入已配制好的重組人IL-2溶液、PHA溶液和LTG溶液(終濃度分別為20 ng/mL、5 μg/mL和25 μg/mL)以促進(jìn)細(xì)胞增殖,吹打混勻后放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天更換細(xì)胞培養(yǎng)液1次。細(xì)胞培養(yǎng)72 h后,將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至離心管中,以250g離心10 min,取細(xì)胞上清液保存至-20℃?zhèn)溆?,以供后續(xù)ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子;取細(xì)胞沉淀后用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(RT-qPCR)的SYBR GreenⅠ熒光染料法檢測(cè)TCRBV基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。
1.3.4ELISA法檢測(cè)LTG刺激PBMCs分泌IL-5、TNF-β及IFN-γ的情況:取出于-20 ℃冰箱保存的細(xì)胞上清液,常溫下均勻充分解凍待測(cè)樣品,按照ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作,采用雙抗體一步夾心ELISA法檢測(cè)IFN-γ、IL-5及TNF-β的分泌量。測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下每孔吸光度〔D(λ)〕,記取3個(gè)復(fù)孔的平均值。用CurverExpert1.4軟件,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0、50、100、200、400、800 pg/mL)為x軸,以所測(cè)得的D(λ)值為y軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線,列出曲線方程后計(jì)算細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子的濃度值(μg/mL),以此濃度值×5(稀釋倍數(shù))計(jì)算樣本實(shí)際濃度。
1.3.5TCRBV基因檢測(cè):(1)引物設(shè)計(jì):登陸NCBI,在Genebank中查詢?nèi)薚CRBV基因(TCRBV1-TCRBV24)各序列,刪除TCRBV基因家族中的假基因,將其余18個(gè)基因序列(TCRBV2-TCRBV7、TCRBV9、TCRBV11-TCRBV20和TCRBV24)提供給上海生工公司設(shè)計(jì)合成引物,引物序列見(jiàn)下表1。
(2)總RNA的提取、cDNA第一鏈的合成:按照北京天根公司總RNA提取試劑盒的說(shuō)明提取PBMCs的總RNA,用酶標(biāo)儀測(cè)定RNA的濃度及純度測(cè)定,D(λ)260/D(λ)280比值為1.8~2.0之間說(shuō)明RNA純度高。將用于第一鏈cDNA合成時(shí)的總RNA定量為100 ng,依據(jù)每例樣本所測(cè)總RNA的濃度,計(jì)算RNA實(shí)際加樣的體積量,設(shè)置反應(yīng)體系行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,反應(yīng)體系為:總RNA 100 ng,Oligo(dT)18 primer 1 μL,5×Reaction Buffer 4 μL,RiboLock RNase Inhibitor(20 U/μL)1 μL,10 mmol/L dNTP Mix 2 μL,ReverTAid M-MuLV RT(200 U/μL) 1 μL,以無(wú)核酸酶純水(nuclease-free water)補(bǔ)齊至20 μL?;靹虿㈦x心,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:42℃ 60 min、70℃ 5 min后終止反應(yīng)。將cDNA于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
(3) RT-qPCR檢測(cè)病例組和對(duì)照組TCRBV基因的表達(dá):以制備好的cDNA為模板、選擇GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照,每樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔,行RT-PCR擴(kuò)增,用SYBR GreenⅠ熒光染料法檢測(cè)TCRBV基因的表達(dá),其反應(yīng)體系為:cDNA 1 μL,F(xiàn)orward Primer(10 μmol/L) 0.4 μL,Reverse Primer(10 μmol/L) 0.4 μL,Tip Green qPCR SuperMix 10 μL,ddH2O 8.2 μL,總體積20 μL。反應(yīng)條件為: 94 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s;56 ℃ 15 s;72 ℃ 10 s,循環(huán)42次后終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù),得到病例組與對(duì)照組TCRBV基因和GAPDH內(nèi)參的擴(kuò)增曲線和熔解曲線,每一種顏色的曲線代表一種基因。用Excel2007整理擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(即Ct值),采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算兩組TCRBV基因的相對(duì)表達(dá)量,以2-ΔΔCt值作為相對(duì)表達(dá)量指標(biāo)進(jìn)行比較。兩組TCRBV基因的ΔCt值計(jì)算如下:ΔCt病例組=Ct病例組-CtGAPDH,ΔCt對(duì)照組=Ct對(duì)照組-CtGAPDH。ΔCt對(duì)照組平均值計(jì)算方法為:對(duì)照組3個(gè)復(fù)孔ΔCt之和,再除以3。兩組TCRBV基因的ΔΔCt值計(jì)算如下:ΔΔCt病例組=ΔCt病例組-ΔCt對(duì)照組平均值,ΔΔCt對(duì)照組=ΔCt對(duì)照組-ΔCt對(duì)照組平均值。
表1 TCBBV基因引物序列
1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Excel(2007)和17.0版本的SPSS 軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布者,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;兩樣本均數(shù)比較時(shí),用t檢驗(yàn)(方差齊時(shí))或t’檢驗(yàn)(方差不齊時(shí))。計(jì)量資料不符合正態(tài)分布者,數(shù)據(jù)以中位數(shù)和四分位數(shù)間距〔M(QR)〕表示,兩樣本比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1兩組PBMCs分泌IFN-γ、IL-5及TNF-β水平比較病例組IFN-γ水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05),IL-5和TNF-β水平略高于對(duì)照組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P> 0.05),具體結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 兩組IFN-γ、IL-5及TNF-β水平比較(n=10,±s,ng/mL)
注:IFN-γ:干擾素γ;IL-5:白細(xì)胞介素5;TNF-β:腫瘤壞死因子β
2.2兩組TCRBV基因表達(dá)水平比較
2.2.1TCRBV基因的擴(kuò)增曲線和熔解曲線:病例組與對(duì)照組TCRBV基因和GAPDH內(nèi)參的擴(kuò)增曲線(圖1)和熔解曲線(圖2)顯示:TCRBV基因擴(kuò)增曲線的基線平整并到達(dá)平臺(tái)期,且每個(gè)基因的熔解曲線峰形較單一,表明所設(shè)置的反應(yīng)條件準(zhǔn)確,在TCRBV基因的擴(kuò)增過(guò)程中未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
2.2.2兩組TCRBV基因表達(dá)的差異:在兩組中差異表達(dá)的TCRBV基因有TCRBV11、TCRBV15、TCRBV17、TCRBV18、TCRBV19(P< 0.05;表3)。依據(jù)這5個(gè)差異表達(dá)的基因在病例組與對(duì)照組中的秩和值可見(jiàn):TCRBV11、TCRBV15、TCRBV17、TCRBV18、TCRBV19在病例組中的表達(dá)量高于對(duì)照組(表4)。
圖 1 TCRBV與GAPDH基因的擴(kuò)增曲線
圖 2 TCRBV與GAPDH基因的熔解曲線
TCRBV基因病例組對(duì)照組Z值P值TCRBV21.02(1.38)0.88(0.83)-0.5030.615TCRBV30.89(1.39)0.92(1.10)-0.5170.605TCRBV40.98(0.60)1.06(0.76)-1.1380.255TCRBV51.29(2.28)1.10(0.91)-0.3840.707TCRBV60.97(3.50)0.92(1.99)-0.0440.965TCRBV70.88(4.59)0.99(1.27)-0.5030.615TCRBV91.28(4.18)1.13(1.07)-0.6210.535TCRBV111.78(1.07)1.00(0.43)-4.2430.000TCRBV121.07(6.89)1.02(2.55)-0.4580.647TCRBV130.81(0.77)1.02(0.40)-1.6710.095TCRBV140.71(0.99)0.95(0.58)-1.3450.179TCRBV151.83(2.19)1.08(1.13)-2.3360.019TCRBV160.92(3.09)0.96(1.60)-0.6510.515TCRBV172.13(3.39)1.05(0.71)-2.9570.003TCRBV181.79(1.92)0.96(0.72)-2.8240.005TCRBV191.44(1.62)1.01(0.61)-2.040.041TCRBV200.63(1.08)0.78(0.54)-1.5230.128TCRBV240.77(1.48)1.41(0.44)-1.0350.301
表4 差異表達(dá)的TCRBV基因在病例組與對(duì)照組中的秩和值比較(n =10)
癲癇是一組由腦神經(jīng)元過(guò)度放電引起的,以反復(fù)發(fā)作、短暫腦功能失調(diào)為特征的臨床綜合征。當(dāng)前癲癇治療共識(shí)[8]認(rèn)為:癲癇確診后,如無(wú)針對(duì)病因治療的指征,除非發(fā)作稀疏,均需應(yīng)用AEDs控制發(fā)作。2/3以上新診斷的癲癇患者在經(jīng)過(guò)AEDs正規(guī)治療后發(fā)作可得到有效控制。約2/5的癲癇患者經(jīng)正規(guī)治療可以完全停藥。然而所有AEDs在使癲癇患者獲益的同時(shí),均可能發(fā)生不良反應(yīng),給患者帶來(lái)?yè)p害。cADRs是AEDs常見(jiàn)不良反應(yīng)之一,在接受AEDs治療的患者中,cADRs的發(fā)生率為3%左右。超過(guò)90%的AEDs誘發(fā)的cADRs發(fā)生于用藥后3個(gè)月內(nèi),少數(shù)AEDs誘發(fā)cADRs發(fā)生在使用AEDs數(shù)年之后[2]。AEDs誘發(fā)cADRs常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)為輕型的MPE,也可出現(xiàn)藥物超敏反應(yīng)綜合征(drug-induced hypersensitivity syndrome,DHS)、Stevens-Johnson綜合征(SJS)、中毒性表皮壞死松解癥(toxicepidermal necrolysis,TEN)等嚴(yán)重類型而威脅生命[1,9-10]。
本研究收集LTG-cADRs患者與LTG耐受者的新鮮全血,提取PBMCs,以終濃度為25 μg/mL的LTG體外刺激并培養(yǎng)PBMCs,72 h后檢測(cè)IFN-γ、IL-5和TNF-β的水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LTG-cADRs患者細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ的水平明顯高于LTG耐受者(P<0.05),這提示LTG可在體外激活LTG-cADRs患者PBMCs分泌的IFN-γ,T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可能參與了LTG-cADRs的致病機(jī)制。該結(jié)果和Ko等[11]的研究結(jié)果一致,Ko等的研究顯示,用CBZ體外刺激培養(yǎng)CBZ誘發(fā)SJS(CBZ-SJS)組和CBZ耐受組的PBMCs后,CBZ-SJS組IFN-γ水平高于CBZ耐受組。另外,LTG-cADRs患者細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-5和TNF-β的水平均略高于LTG耐受者,但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。分析出現(xiàn)細(xì)胞因子水平差異的原因如下:激活的T細(xì)胞分泌產(chǎn)生IFN-γ、IL-5和TNF-β,IFN-γ主要由CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生,可誘導(dǎo)和增加多種細(xì)胞表達(dá)HLA分子,增強(qiáng)免疫應(yīng)答。TNF-β主要由Th1細(xì)胞(CD4+T細(xì)胞)分泌產(chǎn)生,IL-5主要由介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的Th2細(xì)胞分泌產(chǎn)生。LTG-cADRs患者細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ的水平明顯高于LTG耐受者,提示LTG體外刺激并培養(yǎng)LTG-cADRs患者PBMCs,可能是以CD8+T細(xì)胞增殖為主,CD8+T細(xì)胞增殖分泌出了更多的IFN-γ。另外,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,為促進(jìn)PBMCs的生長(zhǎng)而加入了重組人IL-2,IL-2可能增強(qiáng)了IFN-γ基因的轉(zhuǎn)錄,使得IFN-γ水平更高。Rozieres等[12]在動(dòng)物模型中觀察到CD8+T細(xì)胞在藥物超敏反應(yīng)中的致病作用。Wu等[13]以體外培養(yǎng)的方式觀察到CD8+T細(xì)胞在藥物超敏反應(yīng)中的致病作用,關(guān)于CBZ-cADRs的研究發(fā)現(xiàn),CD8+T細(xì)胞不僅具有藥物特異性,而且在體外具有細(xì)胞毒性作用。
T細(xì)胞主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞免疫,調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答。TCR是所有T細(xì)胞表面關(guān)鍵的受體分子,其作用是識(shí)別抗原。健康人外周血中90%~95%的T細(xì)胞表達(dá)αβTCR,αβTCR由α和β兩條肽鏈組成。TCRβ鏈胞外區(qū)分為恒定區(qū)(C區(qū))及可變區(qū)(V區(qū)),TCRBV基因大部分位于人類7號(hào)染色體上,僅有小部分序列位于9號(hào)染色體上。對(duì)TCRβ鏈V區(qū)的氨基酸序列分析表明,TCR有三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)即CDR1、CDR2和CDR3,其中以CDR3變異性最大,直接決定了TCR的抗原特異性。CDR3可直接在識(shí)別HLA-抗原肽復(fù)合體時(shí)與其抗原肽發(fā)生相互作用,TCRBV基因片段依據(jù)CDR3的V基因片段核苷酸的同源性被分成24個(gè)基因家族(TCRBV1~TCRBV24),其中TCRBV5包含TCR BV5.1和TCR BV5.2兩個(gè)亞家族,TCRBV13包含有TCR BV13.1和TCR BV13.2兩個(gè)亞家族。TCRBV基因由V、D、J基因片段重排而成,由于TCRBV基因的多樣性使TCRβ鏈的CDR3區(qū)也呈現(xiàn)多樣性,這種多樣性以約107種抗原受體結(jié)構(gòu)不同的T細(xì)胞存在于人體內(nèi),即人體內(nèi)存在著至少107種能識(shí)別各種抗原的淋巴細(xì)胞克隆[14]。不同的抗原刺激機(jī)體,機(jī)體會(huì)從眾多淋巴細(xì)胞克隆中選擇出受體結(jié)構(gòu)與之互補(bǔ)的淋巴細(xì)胞克隆。對(duì)于健康人,其TCRBV基因家族譜型呈現(xiàn)正態(tài)分布,而機(jī)體在疾病狀態(tài)下,或遭受某種抗原刺激時(shí),淋巴細(xì)胞受體庫(kù)發(fā)生偏移,引起T細(xì)胞克隆增生。在不同的抗原刺激下,出現(xiàn)不同的T細(xì)胞克隆增生,引起只有少數(shù)V-(D)-J基因片段入選擴(kuò)增克隆的現(xiàn)象(即抗原對(duì)TCRBV基因片段的限制性取用),TCRBV基因各家族差異表達(dá),其呈現(xiàn)非正態(tài)分布[15]。Sieben等[6]在二苯胺引起的遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn),3組(共6組)HLA限制性克隆細(xì)胞表達(dá)TCRBV16。Pichler等[4]在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),對(duì)青霉素過(guò)敏的患者,體內(nèi)存在藥物特異性T細(xì)胞克隆,TCR庫(kù)會(huì)出現(xiàn)偏移,TCRBV基因譜型呈寡克隆或多克隆。一項(xiàng)巴氨西林引起變態(tài)反應(yīng)的體外研究發(fā)現(xiàn),克隆性增殖明顯的T淋巴細(xì)胞表達(dá)BV14、TCRBV2、BV3和BV5.1[5]。
以上研究表明,藥物可以在體外激活T細(xì)胞,引起淋巴細(xì)胞受體庫(kù)的偏移,出現(xiàn)TCRBV基因片段的限制性取用,進(jìn)而表現(xiàn)出不同的T細(xì)胞克隆增生,導(dǎo)致TCRBV基因表達(dá)的差異。并且既往研究表明,PBMCs是免疫活性細(xì)胞的集合體,其主要包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞等,參與固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)發(fā)生的過(guò)程,擔(dān)負(fù)重要的免疫功能,而用密度梯度法提取出的PBMCs,淋巴細(xì)胞可達(dá)90%以上,活細(xì)胞百分率在95%以上,可滿足檢測(cè)TCRBV基因的需要[16]。另外,PCR技術(shù)能夠檢測(cè)TCRBV基因各家族表達(dá)情況,RT-qPCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程。RT-qPCR進(jìn)行定量分析時(shí)有兩種方法,即絕對(duì)定量法和相對(duì)定量法。相對(duì)定量法無(wú)需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,可利用熔解曲線排除非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增的干擾,更容易操作。本研究中對(duì)TCRBV基因表達(dá)在LTG-cADRs患者和LTG耐受者中的差異進(jìn)行檢測(cè),因此相對(duì)定量法即可滿足實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析?;谝陨嫌^點(diǎn),本研究對(duì)10例LTG-cADRs患者和10例LTG耐受者的PBMCs,運(yùn)用RT-qPCR的SYBR GreenⅠ熒光染料法,進(jìn)行了18個(gè)TCRBV基因(TCRBV2~TCRBV7、TCRBV9、TCRBV11~TCRBV20和TCRBV24)表達(dá)差異的檢測(cè),以明確LTG-cADRs與TCRBV基因表達(dá)是否存在相關(guān)性。結(jié)果顯示,兩組中存在差異表達(dá)的TCRBV基因共有5個(gè),分別是TCRBV11、TCRBV15、TCRBV17、TCRBV18、TCRBV19。這5個(gè)差異表達(dá)的基因在兩組中的秩和值(其在LTG-cADRs患者中的表達(dá)量)較LTG耐受者高。上述結(jié)果提示LTG-cADRs可能與TCRBV11、TCRBV15、TCRBV17、TCRBV18、TCRBV19基因的表達(dá)相關(guān)。然而,本次研究結(jié)果與既往的研究結(jié)果存在差異。如Naisbitt等[17]報(bào)道,在LTG-cADRs患者的PBMCs中,檢測(cè)到以CD4+T細(xì)胞為主的克隆增殖,這些T細(xì)胞表面均表達(dá)αβ-TCR,TCR BV5.1和TCR BV9基因呈優(yōu)勢(shì)表達(dá),故認(rèn)為在LTG-cADRs發(fā)生的過(guò)程中,TCR BV5.1起關(guān)鍵作用。Hashizume等[18]在PB-cADRs患者外周血中發(fā)現(xiàn)一組顯著克隆增生的T細(xì)胞亞群,這些T細(xì)胞主要表達(dá)TCR BV5.1和TCR BV13.1,以Th2反應(yīng)為主,分泌導(dǎo)致表皮細(xì)胞甚至真皮細(xì)胞損害的細(xì)胞因子、顆粒酶、穿孔素及顆粒溶素,發(fā)生cADRs,該作者推測(cè)特異性TCR的表達(dá)與PB-cADR臨床表現(xiàn)的差異相關(guān)。存在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異的可能原因如下:(1)cADRs類型和病情嚴(yán)重程度的差異對(duì)研究結(jié)果造成的影響。如在Naisbitt等的研究中,所納入的4例LTG-cADRs,其cADRs類型包括MPE、SJS、TEN和多形性紅斑合并淋巴結(jié)腫大各1例,而本研究中所納入LTG-cADRs的皮疹類型均為MPE。(2)本研究納入研究的病例數(shù)較少,僅收集到10例LTG-cADRs患者的血標(biāo)本,尚需更多樣本量進(jìn)行研究。(3)誘發(fā)cADRs的藥物不同。如Hashizume等的研究對(duì)象是以PB誘發(fā)cADRs的患者。這提示LTG、PB雖均屬于AAEDs,具有相似的苯環(huán)結(jié)構(gòu),但仍可能出現(xiàn)TCRBV基因的表達(dá)差異。
綜上可見(jiàn),LTG可在體外激活LTG-cADRs患者的PBMCs分泌IFN-γ,這提示T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可能參與了LTG-cADRs的致病機(jī)制。LTG-cADRs可能與TCRBV11、TCRBV15、TCRBV17、TCRBV18、TCRBV19基因的表達(dá)相關(guān)。但本研究納入研究的LTG-cADRs患者較少,后續(xù)可擴(kuò)大樣本量深入研究,對(duì)LTG-cADRs患者與LTG耐受者的TCRBV基因表達(dá)差異進(jìn)行分析。
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