周海燕 歐文斌 陳盛強(qiáng) 黃月玲 葉炳飛 戴麗軍 孫衛(wèi)文

【摘要】 目的：研究腦靈湯及其萃取物對(duì)脆性X綜合征的作用。方法：選擇Fmr1基因敲除小鼠50只，其中空白組、溶媒組、揮發(fā)油組（A組）、皂甙組（B組）、水溶物質(zhì)組（C）組各10例，空白組使用健康的Fmr1基因敲除小鼠，其他四組選用抑制GSK-3建模，A、B、C組分別使用腦靈湯萃取的揮發(fā)油、皂甙和水溶物進(jìn)行頸后肌肉注射治療。比較五組小鼠的行為學(xué)結(jié)果。結(jié)果：水迷宮、AGS test及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中觀察組3組小鼠表現(xiàn)雖然比對(duì)空白組有一定的差距，但較溶媒組出現(xiàn)了較明顯的改善。結(jié)論：腦靈湯及其萃取物對(duì)小鼠抑制GSK-3模型的腦功能恢復(fù)有一定的療效。

【關(guān)鍵詞】 腦靈湯； 萃取物； 脆性X綜合征

【Abstract】 Objective：To study the effect of brain spirit soup and its extracts on fragile X syndrome.Method：50 mice were given Fmr1 gene knockout，they were divided into the control group，solvent group，volatile oil group （A group），ginsenoside group （group B），water soluble substance group （C） group，10 cases in each group.The control group was given Fmr1 gene knockout mice and the other four groups with inhibition of GSK-3 modeling.A，B，C group were respectively given Nao Ling Decoction extraction of volatile oil，soap glucoside and water soluble intramuscular injection treatment of neck.The behavioral outcomes of the five groups were compared.Result：In water maze test，AGS test and open field test，the performance of the 3 groups in the observation group had a certain difference compared with blank group， but they were better than those of the solvent group.Conclusion：Nao Ling Decoction and its extract on inhibition of GSK-3 model in mice brain function recovery has certain curative effect.

【Key words】 Nao Ling Decoction； Extract； Fragile X syndrome

First-authors address：Shaoguan Occupational Disease Prevention and Treatment Hospital，Shaoguan 512026，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.04.009

腦靈湯是由杜仲、補(bǔ)骨脂、紅景天、白參、何首烏、淫羊藿、菖蒲等藥組成的臨床經(jīng)驗(yàn)方[1-2]，具有補(bǔ)腎活血、化痰開竅之功效，可延緩癡呆的病情發(fā)展、明顯改善患者的生活質(zhì)量。遺傳性智力低下是神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的一類主要疾病，脆性X綜合征（fragile X syndrome）是最常見的遺傳性智力低下性疾病之一，其發(fā)病率男性約為1/1 250，女性為1/2 500，占非特異性智力低下的2%～6%，在X連鎖智力低下中占40%。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 觀察組選取Fmr1基因敲除小鼠30只，年齡40日，體重20～24 g，雌雄鼠各半采用隨機(jī)分組法將以上小鼠分為三組，每組10只，A組使用腦靈湯揮發(fā)油建模，B組使用腦靈湯皂甙建模，C組使用腦靈湯水溶性成分建模。參照組共20只普通健康Fmrl基因敲除小鼠，年齡40日，體重20～24 g，雌雄鼠各半，由廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將其分為2組，每組各10只，分別為空白組和溶媒組。空白組使用健康的Fmr1基因敲除小鼠，其他四組選用抑制GSK-3建模。Fmr1基因敲除方案為構(gòu)建慢病毒載體介導(dǎo)的ser-133siRNA并在腦立體定位下注射，以下調(diào)GSK-3表達(dá)。

1.2 藥物 腦靈湯選用由杜仲、補(bǔ)骨脂、紅景天、白參、何首烏、淫羊藿、菖蒲等藥組成的臨床經(jīng)驗(yàn)方，萃取前每100 mL含生片1.6 g[3-4]。采用超臨界CO2萃取法獲得腦靈湯不同萃取物即揮發(fā)油、皂甙、水溶性成分等。制劑萃取前每100 mL含生片成分1.6 g，萃取后揮發(fā)油氯仿溶液每100 mL含有效成分350 mg，皂甙酒精溶液每100 mL含有效成分310 mg，濃縮水溶液每100 mL含有效成分220 mg。最終制劑按2 mg/針，揮發(fā)油（A組）含量為3 mg，皂甙（B組）含量為3.5 mg，水溶物質(zhì)（C組）含量為3 mg。實(shí)際給藥量為每40 g體重給藥量0.5 mg（折合60 kg體重給藥量750 mg）[5]。觀察組給藥方式為頸后肌肉注射[6]。

1.3 方法 （1）morris水迷宮：使用直徑1.5 m的小鼠morris水迷宮站臺(tái)，規(guī)格：直徑8 cm，高度20～35 cm，觀察小鼠找到站臺(tái)的時(shí)間和游泳路徑[7-8]。（2）open field曠場(chǎng)：使用35×35×30 cm小鼠曠場(chǎng)測(cè)試器進(jìn)行測(cè)試，網(wǎng)高12 cm，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為120 s，觀察小鼠穿過網(wǎng)的次數(shù)、站立的次數(shù)[9-12]。（3）AGS test聽源性驚厥實(shí)驗(yàn)：0.5 m內(nèi)使用36、45、60 dB信號(hào)進(jìn)行聽源性驚厥實(shí)驗(yàn)，觀察小鼠驚厥反應(yīng)的次數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮結(jié)果 從游泳路徑上看，空白組小鼠的游泳路徑具有很強(qiáng)的目的性，選擇較為典型的一例，其幾乎直線游到岸邊，三次選擇不同地點(diǎn)試圖登上側(cè)壁未果后，選擇接近直線的距離穿過迷宮，中途接近站臺(tái)，接近90°轉(zhuǎn)向登陸平臺(tái)。而溶媒組小鼠的游泳路徑明顯缺少目的性，幾乎總是在原地轉(zhuǎn)圈。觀察組三組小鼠的游泳路徑同樣缺少目的性，特別是A組和B組，雖然其轉(zhuǎn)圈半徑比溶媒組略大，且其多次靠近岸邊試圖尋找出路，但其游泳路徑缺少目的性。C組小鼠游泳過程有了一定的目的性，其與空白組更為接近，但其繞行站臺(tái)接近一圈后才爬上站臺(tái)。觀察組3組小鼠上岸時(shí)間雖然比對(duì)空白組有一定的差距，但比溶媒組出現(xiàn)了較明顯的改善，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 open field曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 觀察組曠場(chǎng)測(cè)試效果明顯優(yōu)于溶媒組，但距離空白組有一定的差距。觀察組中效果最好的為C組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 AGS test聽源性驚厥實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 聽源性驚厥實(shí)驗(yàn)中，空白組小鼠并未發(fā)生明顯的驚厥反應(yīng)，在45 dB和60 dB時(shí)各出現(xiàn)2例次，溶媒組的驚厥反應(yīng)較為頻繁。而觀察組3組小鼠的驚厥表現(xiàn)，介于空白組和溶媒組之間，較溶媒組有了較為顯著的改善。見表3。

3 討論

腦靈湯是由杜仲、補(bǔ)骨脂、紅景天、白參、何首烏、淫羊藿、菖蒲等藥組成的臨床經(jīng)驗(yàn)方，該方是中西醫(yī)結(jié)合背景下的新中醫(yī)驗(yàn)方。《中藥大詞典》中記載，杜仲配伍補(bǔ)骨脂，可以溫補(bǔ)腎陽、兼補(bǔ)脾肝、既澀下元、又固沖任[13]，這與傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為精神疾病來自腎虛肝郁相符。而紅景天補(bǔ)肺陰，《現(xiàn)代實(shí)用本草》認(rèn)為紅景天有中樞抑制作用。白參補(bǔ)氣，對(duì)脾胃虛弱、肺氣不足有一定的療效[14]。何首烏可以溫肝補(bǔ)腎，《本草綱目》認(rèn)為此物氣溫味苦澀，苦補(bǔ)腎，溫補(bǔ)肝，能收斂精氣。淫羊藿補(bǔ)命門、益精氣、強(qiáng)筋骨、補(bǔ)腎壯陽[15]。菖蒲，《本草匯言》有記載，石菖蒲，利氣通竅，如因痰火二邪為眚，致氣不順、竅不通者，服之宜然[16]。綜上，腦靈湯實(shí)際是以宣肺法驅(qū)痰濕，內(nèi)補(bǔ)外調(diào)，安神定風(fēng)，是針對(duì)腦病的一劑良方。

本研究使用超臨界CO2萃取法獲得腦靈湯不同萃取物，并通過GC-MS分析得到腦靈湯不同萃取物的化學(xué)組分，利用Fmr1基因敲除小鼠動(dòng)物模型探討使用腦靈湯及其萃取物后AGS test，Open field test，morris水迷宮等行為是否恢復(fù)至野生鼠水平，觀察其治療作用，找出最有效劑量[17]，同時(shí)在離體和在體水平運(yùn)用免疫組織化學(xué)、組織化學(xué)、氨基酸分析、細(xì)胞培養(yǎng)、電生理等方法探討腦靈湯及其萃取物對(duì)Fmr1基因敲除小鼠治療的可能機(jī)制[18-20]。

本文使用雙盲法對(duì)腦靈湯的萃取物在Fmrl基因敲除小鼠抑制GSK-3模型上進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)腦靈湯萃取物雖然不能完全緩解脆性X綜合征的模型，但其相比較溶媒組獲得了較好的治療效果，這將為脆性X綜合征的治療提供一種新的思路，為研發(fā)新的治療脆性X綜合征的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為今后的臨床運(yùn)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)方法。

參考文獻(xiàn)

[1]郭軍英，李輝娟，王麗巧，等.腦靈湯組方聯(lián)合針灸治療對(duì)阿爾茨海默病患者腫瘤壞死因子α、淀粉樣β蛋白和MMSE評(píng)分的影響[J].河北醫(yī)藥，2014（6）：859-861.

[2]葛小平.TGF-β1和TNF-α在阿爾茨海默病大鼠海馬中的相反表達(dá)及腦靈湯的干預(yù)研究[J].中國醫(yī)藥指南，2013（14）：487-488.

[3]吳波.腦靈湯加多奈哌齊治療老年性癡呆60例臨床藥學(xué)療效[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2013，26（5）：581-582.

[4]王哲，伍明輝，鐘炳武，等.腦靈湯對(duì)阿爾茨海默病大鼠模型行為學(xué)及海馬CA3區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞和IL-6表達(dá)的影響（英文）[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2013，38（2）：114-119.

[5]何文智，李少英，王曉蔓，等.三核苷酸重復(fù)引物PCR和甲基化特異性多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)在脆性X綜合征產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用[J/OL].生殖與避孕，2017，37（7）：561-565.

[6]張晨驥，張學(xué)君，陳蘭芳，等.探討NLGN-3蛋白作為針刺治療脆性X綜合征的作用機(jī)制靶目標(biāo)的可行性[J/OL].上海針灸雜志，2017，36（1）：113-117.

[7]陸平，陳嘯龍，馮云，等.整合分析脆性X染色體綜合征患者來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在神經(jīng)元分化中的轉(zhuǎn)錄組變化[J].中國科學(xué)：生命科學(xué)，2016（12）：1400-1412.

[8]莫苗，裴亞平，曾燕.細(xì)胞間黏附分子5在樹突棘發(fā)育和突觸可塑性中的研究進(jìn)展[J/OL].生命科學(xué)，2016（11）：1308-1313.

[9]李文鵬.脆性X染色體綜合征模型小鼠Fmr1-/-中mGluR5的異常磷酸化影響其與Homer1c相互作用[D].上海：華東師范大學(xué)，2017.

[10]田帥，馬云.microRNA在脆性X綜合征發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展[J/OL].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2016（9）：880-886.

[11]沙艷偉，丁露，紀(jì)智勇，等.脆性X染色體綜合征一家系分析[J].中華男科學(xué)雜志，2016（9）：797-804.

[12]冼晶，黃高明，梁秀就，等.庫欣綜合征中FHIT、Ki-67、PCNA的表達(dá)及相關(guān)因素的研究[J/OL].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2016，26（14）：37-41.

[13]胡麗嬋，郭藝，孫祺章，等.Fmr1基因敲除小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)的觀察[J].廣州醫(yī)藥，2016，47（4）：9-12.

[14]張學(xué)君，陳蘭芳，張晨驥.針刺長(zhǎng)強(qiáng)穴對(duì)FMR1基因敲除小鼠海馬PSD-95蛋白表達(dá)的影響[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2016（6）：1533-1535.

[15]容燮峰，郭藝，孫祺章，等.加味甘麥大棗湯揮發(fā)油對(duì)Fmr1基因敲除小鼠的曠場(chǎng)行為的影響[J].解剖學(xué)研究，2016（2）：129-134.

[16]張煥煥，魏兆蓮.脫氫表雄酮治療卵巢儲(chǔ)備功能低下的不孕患者研究進(jìn)展[J].中華全科醫(yī)學(xué)，2016，14（1）：122-124.

[17]宿艷敏.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中三種小鼠的學(xué)習(xí)能力及其性別差異[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2013.

[18]王緒平，咼登俊，陳宇，等.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)血管性癡呆大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013（1）：99-100.

[19]方松，余化霖.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中海馬相關(guān)空間學(xué)習(xí)記憶的研究進(jìn)展[J].國際病理科學(xué)與臨床雜志，2010，30（4）：321-326.

[20]陳羅西，郭玲玲，李亮.Morris圓形水迷宮的應(yīng)用及其相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)分析[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，10（8）：55-57.

（收稿日期：2017-09-12） （本文編輯：周亞杰）