劉學(xué)威，王靈靈，薛 娟，李貴文，王留國，秦寶福

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 西安 712100；2.天方藥業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463000)

鹽酸林可霉素是一種高效的抗革蘭陽性菌的抗生素，在體內(nèi)分布廣。可進(jìn)入骨髓和骨組織，臨床廣泛用于呼吸系統(tǒng)骨髓炎及軟組織感染等病癥的治療,尤其適用于對(duì)青霉素和紅霉素過敏的病人[1]。本研究采用極限試驗(yàn)法加快鹽酸林可霉素中組分的分解變化，以高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定其含量變化，考察鹽酸林可霉素產(chǎn)品在運(yùn)輸過程中產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

1 儀器和材料

1.1 儀器

HWS-250智能型恒溫恒濕箱(寧波海曙賽福試驗(yàn)儀器廠)，儀器CP225D天平(北京賽多利斯有限公司)，DK-S22型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)，KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，DL31卡爾菲休氏水分滴定儀(瑞士梅特列公司),Agilent1200高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)。

1.2 試劑

乙腈，甲醇，氨水，超純水，鹽酸林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品批號(hào)n○3，雜質(zhì)鑒別標(biāo)準(zhǔn)品n○1(來源EDQM)，鹽酸林可霉素樣品批號(hào)A1、A2、A3(天方藥業(yè)有限公司)。

2 方法和結(jié)果

2.1 穩(wěn)定性考察指標(biāo)

2.1.1 色譜條件

色譜柱：250 mm×4.6 mm×5μm，SUPELCOSIL LC-8-DB，頂端封尾堿基去活的辛烷基甲硅烷基硅膠為填充劑；柱溫：50℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20μL；

pH值6.1緩沖液：(取34g的濃磷酸溶解于900mL的色譜級(jí)純化水中，用濃氨水調(diào)pH值至6.1，再用色譜級(jí)純化水稀釋至1000 mL)；

流動(dòng)相∶甲醇∶乙腈∶緩沖液=8∶17∶75(V∶V∶V)，混勻后用微孔濾膜(φ0.45μm)過濾備用。

2.1.2 對(duì)照品制備

取25.0 mg的鹽酸林可霉素對(duì)照品，精密稱定，置于10.0 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度。

2.1.3 供試品溶液制備

取25.0 mg的鹽酸林可霉素樣品，精密稱定，置于10.0 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度。

2.1.4 線性關(guān)系考察

取對(duì)照品100 mg，精密稱定，置于20 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解定容搖勻，制成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)濃度200%的對(duì)照品貯備液，然后用流動(dòng)相分別配制成0.1、0.4、0.8、1.0、1.2倍對(duì)照品溶液，每個(gè)樣進(jìn)樣3次，記錄峰面積。取每個(gè)樣品平均值，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=7.0×10-5X-0.0199，相關(guān)系數(shù)R2=0.99983，r=0.9991。結(jié)果表明鹽酸林可霉素在0.0003～3.0 mg/mL的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn)

取上述1.0倍濃度鹽酸林可霉素對(duì)照液，連續(xù)進(jìn)樣6針，峰面積RSD值為0.07%，進(jìn)樣精密度高，重復(fù)性好

2.1.6 定量限與檢測(cè)限試驗(yàn)

將對(duì)照液逐步稀釋，信噪比約大于等于10的濃度為定量限濃度，信噪比約大于等于3的濃度為檢測(cè)限濃度。定量限要低于忽略限度。經(jīng)過確認(rèn)該方法的定量限濃度為0.0003 mg/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)濃度0.03%；檢測(cè)限濃度為0.00009 mg/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)濃度0.009%。

2.1.7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

將供試樣品溶液每小時(shí)進(jìn)樣一次，考察24h內(nèi)溶液的穩(wěn)定性，主成分鹽酸林可霉素的峰面積以RSD值計(jì)算(RSD不得大于0.85%)，林可霉素B和其他有關(guān)物質(zhì)的含量的絕對(duì)值在±0.1%，并不得檢查出新的雜質(zhì)，否則認(rèn)為溶液不穩(wěn)定，需要在溶液變化發(fā)生之前進(jìn)樣。對(duì)24次進(jìn)樣結(jié)果分析后，主成分鹽酸林可霉素RSD為0.23%，雜質(zhì)A絕對(duì)值0.0%，雜質(zhì)B絕對(duì)值0.0%，總雜質(zhì)絕對(duì)值0.0%，林可霉素B絕對(duì)值0.0%。說明鹽酸林可霉素供試液在24 h內(nèi)是穩(wěn)定的。液相色譜圖如圖1。

圖1 液相色譜圖

方法學(xué)考察結(jié)果表明，該方法專屬性強(qiáng)，精密度高，定量限與檢測(cè)限低于忽略限度，線性關(guān)系良好，濃度范圍寬，溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，適合本試驗(yàn)對(duì)鹽酸林可霉素含量與有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)。

2.1.8 樣品的測(cè)定

分別將對(duì)照品溶液與供試品溶液按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量與有關(guān)物質(zhì)。

2.2 方法

極限試驗(yàn)：取市售批號(hào)A1、A2、A3三批，按照模擬市售包裝成小桶狀，將樣品在60℃±2℃，RH75±5%的條件下放置2個(gè)月，分別于第一個(gè)月末和第二個(gè)月末取樣檢測(cè)，如果檢測(cè)結(jié)果不合格停止試驗(yàn)，如果試驗(yàn)正常放入25℃±2℃，RH60±5%智能恒溫恒濕箱中繼續(xù)考察。

長(zhǎng)期試驗(yàn)：將樣品放在25℃±2℃，RH60±5%智能恒溫恒濕箱中，以極限試驗(yàn)結(jié)束時(shí)間為0個(gè)月，每年檢測(cè)一次至48個(gè)月，按時(shí)取樣考察。如果不合格停止試驗(yàn)。

3 結(jié)果與討論

3.1 極限試驗(yàn)結(jié)果

在進(jìn)行兩個(gè)月極限試驗(yàn)后，鹽酸林可霉素的性狀與外觀均未發(fā)生變化，把水分和液相的檢測(cè)結(jié)果輸入Minitab處理后如圖2。

圖2 水分、林可霉素B、含量、總雜質(zhì)與時(shí)間的散點(diǎn)圖

通過統(tǒng)計(jì)表可知在極限試驗(yàn)2個(gè)月后，水分有輕微的升高。鹽酸林可霉素主成分RSD值變化分別為0.27%、0.35%、0.25%；林可霉素B和有關(guān)物質(zhì)變化均在±0.1%以內(nèi)。在目前使用的包裝樣式下，鹽酸林可霉素具有較好的穩(wěn)定性。把水分和總含量結(jié)果分別用Minitabe穩(wěn)定性考察工具進(jìn)行處理，結(jié)果如圖3和圖4。

圖3 所有批次的穩(wěn)定性(水分)

圖4 所有批次的穩(wěn)定性(含量)

根據(jù)結(jié)果分析，鹽酸林可霉素在極限試驗(yàn)中水分合格方程為：水分=0.0407+0.000833月，在極限條件下推測(cè)約3.8月水分將不合格。

Minitab計(jì)算含量回歸方程如下：

批次

A1 含量 = 0.99317 - 0.002167 月

A2 含量 = 0.99317 - 0.002167 月

A3 含量 = 0.99750 - 0.002167 月

估計(jì)穩(wěn)定期

規(guī)格下限 = 0.96 規(guī)格上限 = 1.02

穩(wěn)定期 = 以 95% 確信至少 50% 的響應(yīng)在規(guī)格限內(nèi)的時(shí)間期間

批次 穩(wěn)定期(月)

A1 8.8686

A2 8.8686

A3 9.9833

整體 8.8686

經(jīng)過分析，在極限條件下約8.9月鹽酸林可霉素含量能夠符合質(zhì)量要求。

鹽酸林可霉素的極限穩(wěn)定性結(jié)果說明本包裝在高溫高濕復(fù)雜環(huán)境中2個(gè)月能夠保證產(chǎn)品質(zhì)量。經(jīng)過極限試驗(yàn)后對(duì)鹽酸林可霉素長(zhǎng)期穩(wěn)定性是否影響，需要進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)。

3.2 長(zhǎng)期試驗(yàn)結(jié)果

以極限試驗(yàn)結(jié)束時(shí)間為0個(gè)月，把上述樣品置于25℃±2℃、RH60±5%智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，分別于第12、24、36、48個(gè)月取樣分析，并與0月結(jié)果比較，判斷本品的穩(wěn)定性。

把所有批次試驗(yàn)結(jié)果輸入Minitab后進(jìn)行處理分析結(jié)果如圖5和圖6。

圖5 水分、林可霉素B、含量、總雜質(zhì)與月的散點(diǎn)圖

在長(zhǎng)期試驗(yàn)中，水分有較好的穩(wěn)定性無顯著變化(P>0.05)；林可霉素B呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，降解趨勢(shì)方程 林可霉素B = 0.0236 - 0.000042 月，含量有下降趨勢(shì)，總雜質(zhì)變化不大。

圖6 雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、任一雜質(zhì)、總雜質(zhì)與月的散點(diǎn)圖

在雜質(zhì)檢測(cè)中，特定雜質(zhì)與非特定雜質(zhì)變化不大，體現(xiàn)出鹽酸林可霉素當(dāng)前包裝在常溫中具有較好的穩(wěn)定性。

圖7 所有批次的穩(wěn)定性

使用Minitabe穩(wěn)定性試驗(yàn)工具分析含量結(jié)果后(圖7)，得出含量擬合線方程：含量=0.989-0.000147月，穩(wěn)定期=141.41月。

鹽酸林可霉素原料藥經(jīng)模擬包裝穩(wěn)定性試驗(yàn)考察，其試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)數(shù)理統(tǒng)計(jì)表明：水分和含量在極限條件下2個(gè)月能夠保證產(chǎn)品質(zhì)量，在極限條件下有關(guān)物質(zhì)也變化甚微。在長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)48個(gè)月中，鹽酸林可霉素的各項(xiàng)指標(biāo)均變化不大，說明該品種在當(dāng)前包裝條件下性質(zhì)較為穩(wěn)定。在試驗(yàn)中空氣中濕度對(duì)水分測(cè)定有直接影響，因此在檢定過程中，應(yīng)注意容器的密封，操作時(shí)應(yīng)盡量減少樣品、容器在空氣中暴露的時(shí)間，以免吸潮影響樣品真實(shí)值測(cè)定。

[1]童 婷.林可霉素發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究[J].江西化工,2006,12(4):173.

[2]劉雅華,史 蕙,黃 蓓,等鹽酸林可霉素膠囊穩(wěn)定性考察[J].貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，25(1):47.

[3]國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典(二部)[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

(本文文獻(xiàn)格式：劉學(xué)威，王靈靈，薛娟，等.鹽酸林可霉素原料藥穩(wěn)定性研究[J].山東化工,2018,47(7):22-25.)