王 剛,田應(yīng)彪,蔣永梅,何 群,袁仕夢,魏 瑋

(遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,貴州遵義 563000)

石上柏(SelaginelladoederleiniiHieron.)屬于蕨類卷柏科卷柏屬植物,多年生草本,也叫深綠卷柏,多分布在我國貴州、四川、重慶、廣西等地。該植物具有食用、藥用、保健價值,具有抗氧化[1-2]、抗炎[3]、抗腫瘤、抗誘變和抗突變的作用[4-8]。該植物含有雙黃酮、生物堿、木質(zhì)素、有機酸等化合物,其中雙黃酮是該植物主要的有效成分[9]。

穗花杉雙黃酮(amentoflavone)是石上柏中的雙黃酮化合物之一,是控制石上柏質(zhì)量的指標成分(結(jié)構(gòu)式如圖1所示),在藥材中含量約為0.3%～0.7%[10]。如前面所述,穗花杉雙黃酮具有較強的抗氧化、降血脂、抗菌及抗腫瘤等作用[11-14]。目前未見石上柏穗花杉雙黃酮提取工藝的研究報道,本文為了節(jié)約溶劑,同時改善提取效率,重點考察微波輔助提取穗花杉雙黃酮的效果,并結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化工藝參數(shù)。

圖1 穗花杉雙黃酮的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of amentoflavone

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石上柏 采自貴州赤水,編號:SD20130916,存放于遵義醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)實驗室;穗花杉雙黃酮標準品 生產(chǎn)批號:160622,成都瑞芬恩生物有限公司;甲醇、乙腈 均為色譜純,成都科龍試劑公司。

1100高效液相色譜儀、1100二極管陣列檢測器 美國安捷倫公司;C18Symmetry?色譜柱 美國Waters公司;SECURA124-1CN電子分析天平 德國賽多利斯公司;KQ118超聲波清洗器 北京佳源興業(yè)科技有限公司;DZ-2A型電熱真空干燥箱 北京北空興源濤科貿(mào)有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 西安太康生物科技有限公司;Xinyi-1A微波提取儀 杭州艾普儀器設(shè)備有限公司;FW80型高速萬能粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 穗花杉雙黃酮溶液的提取 取干燥好的石上柏藥材10 g粉碎,過40目篩,置250 mL圓底燒瓶中,加入一定體積的95%乙醇,設(shè)置一定微波功率,在一定的時間和溫度下進行微波提取,提取完成后過濾,將濾液減壓濃縮,轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中,用乙醇定容作為穗花杉雙黃酮溶液。通過液相分析,測定穗花杉雙黃酮的峰面積,利用線性回歸方程計算穗花杉雙黃酮的含量,從而得到石上柏中穗花杉雙黃酮的得率。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 固液比對得率的影響 固定溫度為50 ℃,提取功率為400 W,時間40 min,研究固液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30 g/mL對穗花杉雙黃酮得率的影響。

1.2.2.2 提取溫度對得率的影響 固液比1∶20 g/mL,提取功率為400 W,時間40 min,研究提取溫度30、40、50、60、70 ℃對穗花衫雙黃酮得率的影響。

1.2.2.3 微波功率的影響 固液比1∶20 g/mL,提取功率為400 W,提取時間40 min,提取溫度50 ℃,研究微波功率100、300、500、700、900 W對石上柏穗花衫雙黃酮得率的影響。

1.2.2.4 提取時間的影響 固液比1∶20 g/mL,提取功率為400 W,提取溫度50 ℃,研究提取時間為10、20、30、40、50、60 min對石上柏穗花衫雙黃酮得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面實驗設(shè)計 以提取溫度、微波功率、提取時間為自變量,以石上柏提取物中穗花杉雙黃酮得率為響應(yīng)值Y,根據(jù)Box-Behnken的中心組合原理進行實驗設(shè)計,實驗因素和水平見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels table

1.2.4 標準品溶液的制備 精密稱取穗花杉雙黃酮標準品19.5 mg,加甲醇適量同置25 mL容量瓶中,200 W超聲溶解,室溫靜置,并用甲醇定容,搖勻,配制成0.78 mg/mL的穗花杉雙黃酮的溶液。

1.2.5 標準曲線的制作 精密吸取穗花杉雙黃酮標準品溶液1、2、3、4、5、6 mL,分別置于 10 mL 容量瓶中,加甲醇定容,搖勻,得系列對照品溶液,分別注入高效液相色譜儀中測定峰面積。以對照品峰面積為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制標準曲線,得到穗花杉雙黃酮回歸方程為:Y=5293X-2881.8,相關(guān)系數(shù)R2=0.9995。結(jié)果表明穗花杉雙黃酮的濃度在78.0～468.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

1.2.6 HPLC檢測波長的選擇 實驗中對穗花杉雙黃酮溶液進行紫外全波長掃描,綜合最大吸收情況,實驗結(jié)果提示,檢測波長為330 nm時的色譜峰靈敏度高,峰面積較好,所以確定330 nm為檢測波長。

1.2.7 HPLC流動相的選擇 色譜柱:DikmaDiamons C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈-0.1%甲酸水,采用梯度洗脫程序(表2);檢測波長:330 nm;柱溫:25 ℃;流速:0.6 mL/min;進樣量:10 μL;進樣前樣品用0.45 μm微孔濾膜過濾。在上述條件下,穗花杉雙黃酮與其它色譜峰達到了基線分離。

表2 HPLC梯度洗脫程序Table 2 HPLC gradient elution program

1.2.8 微波提取法與其他提取方法的比較 本文將微波輔助提取法與傳統(tǒng)的2種提取方法相比較,以穗花杉雙黃酮的得率為考察指標,比較三種提取方法之間的差異。

1.2.8.1 乙醇回流提取法 取10.0 g石上柏于燒瓶中,加120 mL 95%乙醇(固液比1∶12 g/mL),置于80 ℃恒溫水浴鍋,提取2 h,過濾,取濾液于1000 mL容量瓶中,加95%乙醇定容至刻度。平行實驗3次[15]。

1.2.8.2 索氏提取法 取10.0 g石上柏用濾紙包裹放入索式提取器內(nèi),并加入200 mL 95%乙醇,加熱回流,虹吸 2 h。將提取液倒入1000 mL容量瓶中,加95% 乙醇定容至刻度。平行實驗3次[15]。

1.2.9 穗花杉雙黃酮得率的計算 穗花杉雙黃酮得率(%)=(c×100 mL)/m×100,式中,m為石上柏藥材總質(zhì)量(g);c為石上柏中穗花杉雙黃酮的濃度(g/mL)[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 固液比對得率的影響 由圖2可知，隨著固液比例的增大,產(chǎn)品得率隨之增加,當(dāng)固液比在1∶15～1∶25 g/mL時,得率基本沒有明顯變化。這可能是由于藥材中雙黃酮的量是一定的,繼續(xù)增加溶劑,很難得到更多的目標產(chǎn)物,但得率較高?？紤]到固液比的增加會造成后處理的困難以及溶劑的浪費。因此,固液比選擇1∶15 g/mL。

圖2 固液比對穗花杉雙黃酮得率的影響 Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on yield of amentoflavone

2.1.2 提取溫度對得率的影響 由圖3可知，隨著溫度的增加,產(chǎn)品得率隨之增加,當(dāng)溫度高于50 ℃后,產(chǎn)品得率隨之下降,這可能是由于溫度增高、氧化加快等原因,使得具有一定熱不穩(wěn)定性的黃酮類成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,轉(zhuǎn)變成非黃酮類成分,因而產(chǎn)品得率會減少。因此,在響應(yīng)面分析中,選擇在40～60 ℃的范圍內(nèi)進行優(yōu)化。

圖3 提取溫度對穗花杉雙黃酮得率的影響 Fig.3 Effect of temperature on yield of amentoflavone

2.1.3 微波功率的影響 由圖4可知，隨著微波功率上升,產(chǎn)品的得率隨之增加,當(dāng)微波功率超過500 W,產(chǎn)品的得率開始減少,經(jīng)過反復(fù)實驗,可能是當(dāng)微波功率過高時,溫度不易控制,同時反應(yīng)體系溫度開始上升,使受熱不穩(wěn)定的黃酮類成分氧化轉(zhuǎn)變成非黃酮類成分,因而產(chǎn)率下降。因此,在響應(yīng)面分析中,選擇在300～700 W的范圍內(nèi)進行優(yōu)化。

圖4 微波功率對穗花杉雙黃酮得率的影響 Fig.4 Effect of microwave power on yield of amentoflavone

2.1.4 提取時間的影響 由圖5可知，當(dāng)提取時間小于40 min時,隨著提取時間的增加,得率增加。當(dāng)超過40 min時,隨著提取時間的增加,得率則反而呈現(xiàn)出下降的趨勢,這可能是由于穗花杉雙黃酮含有多個酚羥基,時間過長,在高溫下容易被氧化。因此,在響應(yīng)面分析中,選擇在30～50 min的范圍內(nèi)進行優(yōu)化。

圖5 提取時間對穗花杉雙黃酮得率的影響 Fig.5 Effect of extraction time on yield of amentoflavone

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果分析

2.2.1 提取工藝參數(shù)的優(yōu)化 通過Design-Expert軟件進行二次響應(yīng)面回歸分析(結(jié)果見表3和表4),得到如下多元二次響應(yīng)面回歸模型:Y(%)=-1.48169+0.052A+5.125×10-4B+0.0264C+2.5×10-6AB-1.92554×10-18AC+6.25×10-6BC-5.675×10-4A2-9.8125×10-7B2-3.925×10-4C2。

表3 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 The results of experiment design

表4 響應(yīng)面法分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance(ANOVA)of the response surface quadratic mode

由表4可知,F=79.81,p<0.0001,表明模型極顯著;失擬項F=3.61,p>0.05,不顯著,證明回歸方程無失擬因素存在,同時,模型R2=0.9903,表明該模型的擬合能夠較好地反映實際情況。一次項A、B、C,交互項BC和二次項A2、B2、C2都有顯著影響,其中一次項各因素對穗花杉雙黃酮得率的影響依次為A>B>C,并且三個二次項A2、B2、C2都為p<0.0001,有極顯著影響,說明各因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系,而是存在一定交互作用。模型的變異系數(shù)(C.V.)僅為3.04%,在可接受的范圍內(nèi)。另外,調(diào)整擬合優(yōu)度R2=0.9779,“預(yù)測擬合度”為0.8831,兩者的差值在0.20的可接受范圍內(nèi)。“信噪比”為24.488,表明模型精確;方差分析(ANOVA)與統(tǒng)計學(xué)分析的結(jié)果表明,該模型完全可用于響應(yīng)值的預(yù)測。

2.2.2 各因素的交互影響分析 根據(jù)回歸方程得出不同因素之間相互影響結(jié)果見圖6～圖8,從該組圖可以分析出多個自變量對響應(yīng)值的影響。據(jù)圖6所示為溫度與微波功率的交互影響效應(yīng),由三維曲線和等高線圖可以看出,微波功率較低時,得率隨功率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;提取溫度較高時,得率隨微波功率呈下降趨勢,溫度越高,下降幅度越大。雖然提取溫度和微波功率對響應(yīng)值而言都具有顯著影響,但二者交互對響應(yīng)值的影響不顯著(p>0.05)。

圖6 Y=f(A,B)的響應(yīng)面立體分析及其等高線圖 Fig.6 Response surface plots of variable parameters A and B on the yield of amentoflavone

圖7 Y=f(A,C)的響應(yīng)面立體分析及其等高線圖 Fig.7 Response surface plots of variable parameters A and C on the yield of amentoflavone

圖8 Y=f(B,C)的響應(yīng)面立體分析及其等高線圖 Fig.8 Response surface plots of variable parameters B and C on the yield of amentoflavone

圖7顯示了微波功率為零水平,提取時間與提取溫度對穗花杉雙黃酮得率的影響和兩者之間的交互作用。提取溫度較低時,得率隨提取時間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;提取溫度較高時,得率隨提取時間呈下降趨勢,時間越長,下降幅度越大。雖然提取溫度和提取時間對響應(yīng)值而言都具有顯著影響,但二者交互對響應(yīng)值的影響不顯著(p>0.05)。

圖8給出溫度為零水平時,微波功率與時間之間的交互效應(yīng)的關(guān)系。在前50 min,得率隨著時間的延長而增加,之后趨于減少。由于雙黃酮類化合物含有酚羥基,可能在長時間受熱的情況下發(fā)生氧化等反應(yīng),而使產(chǎn)率減小。在300～500 W范圍內(nèi),得率隨著時間延長而增加,當(dāng)超過500 W后,得率逐漸減少。并且微波功率和提取時間的交互對響應(yīng)值的影響顯著(p<0.05)。

2.2.3 驗證結(jié)果 優(yōu)化得到的最佳提取條件為:微波功率為438.92 W,提取時間為37.13 min,提取溫度為46.78 ℃,穗花杉雙黃酮得率預(yù)測值為0.34%。實際調(diào)整微波功率400 W,提取時間為37 min,提取溫度為47 ℃,穗花杉雙黃酮得率為0.33%±0.08%,與預(yù)測值相比較無顯著性差異(p>0.05)。

2.3 穗花杉雙黃酮含量測定

2.3.1 精密度實驗 精密吸取同一供試品溶液,按“1.2.7”項下色譜條件測定,連續(xù)進樣6次,計算峰面積的RSD為0.32%,表明方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一供試品溶液,在室溫下分別于0、2、4、8、12 h,按“1.2.7”項下色譜條件測定,計算峰面積的RSD為1.32%,供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性實驗 精密稱取同批石上柏藥材5份,每份樣品精密稱定8.0 g,按“1.2.4”方法制備及“1.2.7”色譜條件測定峰面積,并計算其含量及相對標準偏差,計算峰面積的RSD為1.35%,表明方法重現(xiàn)性良好。

2.3.4 加樣回收率實驗 取已知含量的同一批石上柏樣品3.5 g(穗花杉雙黃酮濃度為2.345 mg/g藥材),精密稱定,精密加穗花杉雙黃酮溶液10.0 mL(濃度為0.78 mg/mL),待溶劑揮干后,依法制成樣品溶液,測定,計算回收率。計算穗花杉雙黃酮平均回收率為99.03%,RSD為2.03%。實驗結(jié)果表明方法回收率較好。

2.4 與傳統(tǒng)提取方法相比

本研究將微波輔助提取法與傳統(tǒng)2種提取方法以穗花杉雙黃酮的含量為考察指標進行了對比。如表5所示,微波輔助提取法與其它2種提取方法對比不僅增加了提取效率(穗花杉雙黃酮的含量提高了近2倍),還顯著地降低了提取時間(從120 min降低到37 min)。通過對3種提取方法進行比較,證明了微波輔助提取法具有巨大的潛力,有望成為一種從石上柏中快速、高效、綠色的提取穗花杉雙黃酮的方法。這3種方法的重復(fù)性在97.71%～99.62%之間,RSD低于1.00%。

圖9 高效液相色譜圖Fig.9 HPLC spectra of amentoflavone and the extract from Selaginella doederleinii注：A:穗花杉雙黃酮對照品;B:石上柏乙醇提取物;1-穗花杉雙黃酮。

表5 不同提取方法提取效果的影響(n=3)Table 5 Effect of different extraction methods on the extraction yield of amentoflavone(n=3)

3 結(jié)論

本實驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法對穗花杉雙黃酮的提取工藝進行優(yōu)化,通過Box-Behnken設(shè)計實驗,建立了石上柏中穗花杉雙黃酮提取工藝參數(shù)的二次多項式回歸模型。方差分析結(jié)果表明,該模型準確可靠,可用于石上柏穗花杉雙黃酮得率的預(yù)測和分析。優(yōu)化得到的最佳工藝條件為:固液比為1∶15 g/mL,實際調(diào)整微波功率400 W,提取時間為37 min,提取溫度為47 ℃,穗花杉雙黃酮得率預(yù)測值為0.34%,實際得率為0.33%±0.08%,與預(yù)測值相比較無顯著性差異(p>0.05)。對3種提取方法進行比較,表明了微波輔助提取適合石上柏穗花杉雙黃酮的提取,在穗花杉雙黃酮得率和提取時間均優(yōu)于索式提取和乙醇回流提取,對貴州赤水石上柏資源的研究開發(fā)提供了一定的參考價值。

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