張知曉，澤桑梓，戶連榮，劉凌，季梅

(1.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省林業(yè)有害生物防治檢疫局，云南 昆明 650051)

脲酶是一種專一性尿素水解酶，在農(nóng)林業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中扮演關(guān)鍵角色。土壤脲酶可分解氮肥和尿素產(chǎn)生銨根離子，為植物提供營(yíng)養(yǎng)[1]，還能調(diào)節(jié)植物根際分泌物的分泌，進(jìn)而影響根際細(xì)菌和線蟲的種類和數(shù)量，具有防治根部病害的潛力[2]。我國(guó)氮肥利用率不足40%[3]，與土壤脲酶活性有很大關(guān)系。農(nóng)業(yè)上利用土壤脲酶的分解作用提高土壤肥力，但尿素氮轉(zhuǎn)化速度過快，植物來不及吸收利用，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)揮發(fā)損失[4]。因此，如何調(diào)控土壤脲酶活性以服務(wù)于農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)值得研究。

目前土壤脲酶活性的研究多集中于向土壤中施用化學(xué)類脲酶抑制劑，來控制氮肥的釋放速度，然而這多伴隨著嚴(yán)重的環(huán)境污染問題[5]。此外，土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、速效氮、速效鉀、土壤pH和重金屬離子等土壤理化性質(zhì)已被多項(xiàng)研究證明是土壤脲酶活性的影響因素[6]。土壤中還存在植物、真菌和細(xì)菌等脲酶活性生物。細(xì)菌在土壤中種類和數(shù)量最多，也具有較強(qiáng)的產(chǎn)酶能力[7]。然而目前脲酶活性細(xì)菌與土壤脲酶活性的關(guān)聯(lián)性尚不明確，脲酶活性細(xì)菌對(duì)土壤脲酶活性規(guī)律影響的研究尚屬空白。細(xì)菌在土壤的成功定殖是影響酶活性的前提。在農(nóng)業(yè)上常用沼氣渣、動(dòng)物糞便、農(nóng)家肥和淤泥作為肥料施入土壤中[8]，而這些物質(zhì)中的脲酶活性細(xì)菌也被帶入土壤中，分析這類肥料與施肥后的土壤中脲酶細(xì)菌差異，能夠了解細(xì)菌經(jīng)過長(zhǎng)期農(nóng)業(yè)施肥措施后，能否成功在土壤定殖，進(jìn)而明確外源添加脲酶活性細(xì)菌調(diào)節(jié)土壤脲酶活性的可行性，為調(diào)控土壤脲酶活性找到新途徑。此外，進(jìn)一步研究土壤脲酶細(xì)菌多樣性和其他生境的脲酶活性細(xì)菌多樣性特點(diǎn)，也能為后期研究利用微生物制劑改良和管理土壤，防治植物根部病害提供科學(xué)依據(jù)。

1 研究區(qū)域與研究方法

1.1 供試材料

(1)土壤 在云南省昆明市東川區(qū)因民鎮(zhèn)(26°19′28″N、102°53′21″E)隨機(jī)選取20塊農(nóng)田[前茬作物主要為豌豆(Lathyrussplendens)、蘿卜(Raphanussativus)以及白菜(Brassicachinensisvar.oleifera)]，每塊農(nóng)田采用十字交叉法，選取5個(gè)取樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)取樣直徑5cm處，土層深度0-20cm的土壤樣品置于塑料袋中充分混勻組成混合樣品，土樣過20 目篩后，每塊農(nóng)田獨(dú)立取1份副樣(500g)置于塑料袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)土壤關(guān)聯(lián)的脲酶活性材料 在云南省昆明市東川區(qū)因民鎮(zhèn)(26°19′28″N，102°53′21″E)取沼氣渣(5份)、動(dòng)物糞便(雞糞、豬糞、驢糞、牛糞和羊糞共計(jì)5份)、農(nóng)家肥(5份)和淤泥(5份)。

(3)土壤無關(guān)聯(lián)脲酶活性材料 來源于南海北部和印度洋沿海紅樹林的海底淤泥由云南大學(xué)微生物研究所提供，共25份；不同種類的珍稀動(dòng)物糞便[圓通山動(dòng)物園：大象(Elephasmaximus)、羊駝(Vicugnapacos)、棕熊(Ursusarctos)、馬來熊(Helarctosmalayanus)、東北虎(Pantheratigris)、孟加拉虎(Pantheratigris)、白虎(Pantheratigris)、長(zhǎng)頸鹿(Giraffacamelopardalis)、麋鹿(Elaphurusdavidianus)、梅花鹿(Cervusnippon)共計(jì)10份]。

1.2 土壤理化性質(zhì)分析

土壤脲酶活性采用靛酚比色法測(cè)定[9]；土壤總N測(cè)定先用凱氏消化，然后用NaOH進(jìn)行蒸餾，最后通過25mmol/L的H2SO4進(jìn)行滴定(硼酸指示劑)[10]；土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮用2mol/L的KCl進(jìn)行提取，后進(jìn)行蒸餾和滴定[11]；土壤有機(jī)質(zhì)含量測(cè)定用重鉻酸鉀容量法[12]；土壤pH測(cè)定采用pH計(jì)法完成[13]。

1.3 脲酶活性細(xì)菌分離及其物種多樣性分析

1.3.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基 酵母提取物10g，蛋白胨5g，NaCl 5g，水1L，pH 7。

酸性平板培養(yǎng)基 蛋白胨3g，葡萄糖20g，KH2PO42g，NaCl 5g，MgSO40.1g，Na2HPO41g，尿素10g，溴甲酚紅0.1g，瓊脂30g，pH 5.5。

中性平板培養(yǎng)基 蛋白胨2g，葡萄糖10g，KH2PO42g，NaCl 3g,MgSO40.1g，Na2HPO41g，尿素10g，中性酚紅0.1g，瓊脂30g，pH 7.0。

堿性平板 蛋白胨2g，葡萄糖10g，KH2PO42g，NaCl 3g，MgSO40.1g，Na2HPO41g，尿素10g，百里酚酞0.1g，瓊脂30g，pH 10.0。

NH4+-YE培養(yǎng)基 酵母粉3g，葡萄糖10g，KH2PO42g，NaCl 3g，MgSO40.1g，Na2HPO41g，NiCl 0.01g，尿素10g，百里酚酞0.1g，瓊脂30g，pH 6.0。

1.3.2 菌株的分離

土壤樣品中脲酶活性細(xì)菌分離采用蔗糖離心法[14]。稱取1g新鮮土壤樣品，置于10mL 70%蔗糖溶液中。30℃，180rpm震蕩培養(yǎng)30min，后取出離心(500rpm，1min)，取上清液用滅菌水稀釋至10-2，涂布酸性、中性和堿性平板，每種樣品，每種培養(yǎng)基涂布3皿。30℃黑暗條件恒溫培養(yǎng)7d后計(jì)數(shù)形成藍(lán)色或紅色暈圈的菌落數(shù)，并挑取變色菌落在LB培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，純化的菌落在NH4+-YE培養(yǎng)基上做進(jìn)一步鑒定，產(chǎn)生相同顏色變化和刺激性氨味的細(xì)菌則鑒定為脲酶活性細(xì)菌[15]。土壤脲酶活性細(xì)菌數(shù)量計(jì)算公式為，脲酶活性細(xì)菌數(shù)量(CPU)=∑菌落數(shù)×500。

1.3.3 菌株的分子鑒定

脲酶活性細(xì)菌的16S rRNA測(cè)序是用LB平板活化脲酶活性菌株，并接種至LB營(yíng)養(yǎng)液中，180rpm/min震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，取2mL菌液離心收集菌體，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒按照操作說明提取細(xì)菌總DNA。細(xì)菌總DNA用細(xì)菌通用引物(27F & 1492R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)展體系為50μL(10×PCR Buffer 5.0μL，dNTP Mix 4.0μL，Primer-L 2.0μL，Primer-R 2.0μL，模板DNA 1.0μL，rTaq酶 0.5μL，DD H2O 35.5μL)，反應(yīng)條件是95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。 PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳完成檢測(cè)，條帶清晰的PCR產(chǎn)物用DNA瓊脂糖回收。回收DNA連接至PMD18-T質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至Escherichia coli DH5α后，送北京華大基因完成測(cè)序[16-17]，測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，以鑒定脲酶活性細(xì)菌的種類。

1.4 其他生境中脲酶活性細(xì)菌分離及其物種多樣性分析

每種樣品準(zhǔn)確稱量1g置于10mL 1%的尿素溶液中，30℃，180rpm/min震蕩富集培養(yǎng)24h。取出后震蕩均勻，取1mL樣品溶液進(jìn)行離心(500 rpm/min)，取上清液1mL用滅菌水稀釋至10-2，取200μL涂布酸性、中性和堿性平板，每種樣品，每種培養(yǎng)基涂布3皿。30℃黑暗條件恒溫培養(yǎng)7d后，挑取變色菌落在LB培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，純化的菌落在NH4+-YE培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d再次鑒定，產(chǎn)生相同顏色變化和刺激氨味的細(xì)菌則鑒定為脲酶活性細(xì)菌，脲酶活性細(xì)菌用20%-30%的甘油液于-20℃進(jìn)行編號(hào)凍存?zhèn)溆谩?/p>

脲酶活性細(xì)菌的16S rRNA測(cè)序的方法按照本章1.3描述的方法完成。

1.5 數(shù)據(jù)分析

土壤的理化性質(zhì)數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)分析前進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊次性檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用log(x+1)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。采用SPSS 16.0軟件完成數(shù)據(jù)的方差分析、SNK分析、相關(guān)分析、通徑分析和主成分分析等統(tǒng)計(jì)分析。16S rRNA序列數(shù)據(jù)則利用EzTaxon和BLAST軟件進(jìn)行在線相似性分析，采用Clustal X軟件進(jìn)行多系列比較，并用MEGA 4.1軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤脲酶活性的關(guān)聯(lián)因素

土壤樣品的脲酶活性和理化性質(zhì)見表1。由表1可知，土壤的脲酶活性是4.43-45.70U，平均是16.64U；土壤的有機(jī)質(zhì)含量是21.24-73.58mg/g，平均是37.68mg/g；土壤的總氮含量是1.18-1.75mg/g，平均是1.45mg/g；土壤的C/N是14.35-42.05，平均是25.24；土壤的銨離子含量是10.69-16.44μg/g，平均是13.07μg/g；土壤的硝酸根離子含量是5.61-44.77μg/g，平均是17.75μg/g；土壤的無機(jī)氮含量是20.06-58.72μg/g，平均是30.82μg/g；土壤的脲酶活性細(xì)菌數(shù)量是3.24-18.15 × 103CFU，平均是7.82× 103CFU；土壤的pH值是5.60-6.54，平均是6.09。

由表2可知，土壤脲酶活性和土壤有機(jī)質(zhì)含量(r=0.747**)、土壤總氮含量(r=0.985**)、土壤C/N(r=0.624**)、土壤硝酸根離子濃度(r=0.914**)、土壤無機(jī)氮含量(r=0.862**)、土壤脲酶活性細(xì)菌數(shù)量(r=0.976**)具有極顯著正相關(guān)性，和土壤pH(r=-0.606)和土壤銨離子濃度(r=-0.114)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，但未達(dá)到顯著水平。

由表3可知，土壤脲酶活性影響因子的通徑系數(shù)為，土壤有機(jī)質(zhì)含量(1.755**)、總氮含量(-0.105)、C/N(-1.370**)、銨根離子濃度(-0.506)、硝酸根離子濃度(-4.324)、無機(jī)氮含量(4.071)、土壤脲酶活性細(xì)菌數(shù)量(0.835**)和土壤pH(-0.056)，其中土壤有機(jī)質(zhì)含量、C/N和土壤脲酶活性細(xì)菌數(shù)量對(duì)土壤脲酶活性的直接影響達(dá)到極顯著水平。

表1 土壤樣品的理化性質(zhì)

注：UA為土壤的脲酶活性,OM為有機(jī)質(zhì)含量,SN為總氮含量,MN為無機(jī)氮含量,Bacteria為脲酶活性細(xì)菌數(shù)量，下同。α=0.05。

表2 土壤化學(xué)性質(zhì)和土壤脲酶活性的相關(guān)性

注：斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)，**表示顯著性水平α= 0.01。

表3 土壤性質(zhì)對(duì)土壤脲酶活性的通徑系數(shù)

圖1脲酶活性關(guān)聯(lián)因子的因子載荷圖

Fig.1 Component plot in rotated space of effective factor

主成分分析結(jié)果見圖1。由圖1可知，土壤有機(jī)質(zhì)含量、總氮含量、C/N、硝酸根離子濃度、無機(jī)氮含量、土壤脲酶活性細(xì)菌數(shù)量和土壤pH在第一公因子(圖1中第一、四象限)上有較大的載荷，其中土壤有機(jī)質(zhì)含量、總氮含量、C/N、硝酸根離子濃度、無機(jī)氮含量和土壤脲酶活性細(xì)菌數(shù)量為正載荷，土壤pH為負(fù)載荷；銨根離子濃度在第二公因子(圖1中第二象限)上有較大的正載荷。結(jié)果說明可以把有機(jī)質(zhì)含量等7個(gè)土壤脲酶活性關(guān)聯(lián)因子綜合成2類因素，第1類(圖1中第一、四象限)是脲酶活性控制因素，包括土壤有機(jī)質(zhì)含量、總氮含量、C/N、硝酸根離子濃度、無機(jī)氮、土壤pH和土壤脲酶活性細(xì)菌數(shù)量等，這類因素直接影響土壤脲酶的活性；第2類(圖1中第二象限)是反饋?zhàn)饔靡蛩?，即銨離子濃度，這類因素主要影響尿素和銨離子的動(dòng)態(tài)平衡，通過反饋?zhàn)饔糜绊懲寥离迕富钚浴?/p>

2.2 土壤脲酶活性細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析

采用16S rRNA序列分析的方法對(duì)土壤脲酶活性細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定。試驗(yàn)分離出土壤脲酶活性細(xì)菌分屬于厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)2大類群。厚壁菌門發(fā)現(xiàn)桿菌屬(Bacillus)、芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina) 和芽孢桿菌屬(Lysinibacillus) 3屬，其中桿菌屬(Bacillus)有2種，分別是海濱芽胞桿菌(B.litoralis)、芽孢桿菌(B.tequilensis)；芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)有4種，分別是梭形芽孢桿菌(L.fusiformis)、L.macroides、L.parviboronicapiens、L.xylanilyticus；芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)有1種是八疊球菌(S.pasteurii)。變形菌門發(fā)現(xiàn)產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)和假單胞菌屬(Pseudomonas)2個(gè)屬，都是單屬單種，分別是糞產(chǎn)堿桿菌(A.faecalis)和綠膿假單胞菌(P.aeruginosa)(圖2)。結(jié)果顯示土壤脲酶活性細(xì)菌優(yōu)勢(shì)類群是厚壁菌門，間或分布變形菌門菌株，具有明顯的特異性。

圖2 土壤中可分離脲酶活性細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 3種材料脲酶活性細(xì)菌的特點(diǎn)

采用16S rRNA序列分析的方法對(duì)脲酶活性細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定，脲酶活性細(xì)菌菌株信息見表4。在土壤關(guān)聯(lián)的脲酶活性材料(取自土壤取樣地的沼氣渣、動(dòng)物糞便、農(nóng)家肥和淤泥)中發(fā)現(xiàn)9種脲酶活性細(xì)菌，其中放線菌門細(xì)菌1種，為谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)；厚壁菌門細(xì)菌2種，分別為科氏葡萄球菌(Staphylococcuscohnii)和木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)；變形菌門是土壤關(guān)聯(lián)材料的優(yōu)勢(shì)種群，共分離出糞產(chǎn)堿桿菌、奧斯陸莫拉菌(Moraxellaosloensis)和綠膿假單胞菌等6種。與之相比，土壤中未發(fā)現(xiàn)放線菌門細(xì)菌，厚壁菌門是土壤脲酶細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)種群，分離出細(xì)菌海濱芽胞桿菌和芽孢桿菌等7種，但活性材料中的科氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌并未發(fā)現(xiàn)，土壤中僅發(fā)現(xiàn)變形菌門的糞產(chǎn)堿桿菌和綠膿假單胞菌2種細(xì)菌。

表4 脲酶活性菌株信息統(tǒng)計(jì)表

注：“+”表示在該供試材料中分離到該菌種的菌，“-”表示未分離到該菌種的菌。

土壤無關(guān)聯(lián)脲酶活性材料(來源于南海北部和印度洋沿海紅樹林的海底淤泥及圓通山動(dòng)物園的不同種類的珍稀動(dòng)物糞便)中分離出Arthrobactercreatinolyticus、成晶節(jié)桿菌(A.crystallopoietes)和考克氏菌(Kocuriamarina)、Myroidesmarinus、科氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌、糞產(chǎn)堿桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)、摩氏摩根菌(Morganellamorganii)、奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)、羽狀變形菌(P.penneri)、普通變形桿菌(P.vulgaris)、雷氏普羅威登斯菌(Providenciarettgeri)、普羅威登斯菌(P.vermicola)和綠膿桿菌10屬15種脲酶活性細(xì)菌，分屬于放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)4個(gè)類群。

圖3純培養(yǎng)細(xì)菌16屬的系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.3 Phylogenetic tree of cultural urease-active bacteria in 16 genera

2.4 脲酶活性細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

采用16S rRNA序列分析的方法對(duì)脲酶活性細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定。發(fā)現(xiàn)脲酶活性細(xì)菌的分屬情況(圖 3)是,(1)放線菌門(Actinobacteria)分布3屬4種，分別是棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)和 考克氏菌屬(Kocuria)，其中節(jié)桿菌屬有A.creatinolyticus和成晶節(jié)桿菌(A.crystallopoietes)，棒狀桿菌屬(Corynebacterium)有谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)，考克氏菌屬(Kocuria)有考克氏菌(K.marina)；(2)擬桿菌門(Bacteroidetes)僅有1屬1種 ，是Myroidesmarinus；(3)厚壁菌門(Firmicutes)分布4屬9種，分別是芽孢桿菌屬(Bacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、芽孢八疊球菌屬 和梭桿菌屬(Lysinibacillus)4屬，其中芽孢桿菌屬有2種，是海濱芽胞桿菌(B.litoralis)、芽孢桿菌(B.tequilensis)，梭桿菌屬(Lysinibacillus)有4種，分別是L.fusiformis、L.macroides、L.parviboronicapiens、L.xylanilyticus，葡萄球菌屬(Staphylococcus)有2種，分別是科氏葡萄球菌(S.cohnii)、木糖葡萄球菌(S.xylosus)，芽孢八疊球菌屬有1種，是八疊球菌；(4)變形菌門 (Proteobacteria)有8屬11種，分別是變形桿菌屬(Proteus)、摩根氏菌屬(Morganella)、普羅維登斯菌屬(Providencia)、拉烏爾菌屬(Raoultella)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、假單胞菌屬和莫拉克斯氏菌屬(Moraxella)8屬，變形桿菌屬有奇異變形桿菌(P.mirabilis)、羽狀變形菌、普通變形桿菌3種，摩根氏菌屬(Morganella)有摩氏摩根菌(M.morganii) 1種，普羅維登斯菌屬(Providencia)有雷氏普羅威登斯菌(P.rettgeri)、普羅威登斯菌(P.vermicola)2種，拉烏爾菌屬(Raoultella)分布解鳥氨酸拉烏爾菌(R.ornithinolytica)1種，克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)有產(chǎn)酸克雷伯菌(K.oxytoca)1種，產(chǎn)堿桿菌屬有糞產(chǎn)堿桿菌1種，假單胞菌屬有綠膿假單胞菌1種。結(jié)果顯示脲酶活性細(xì)菌多數(shù)分屬變形菌門(Proteobacteria)，分布跨度巨大，分屬于4門16屬，且單屬單種現(xiàn)象明顯。

3 結(jié)論與討論

引入土壤脲酶活性細(xì)菌分析土壤脲酶活性因素發(fā)現(xiàn)，脲酶活性細(xì)菌、有機(jī)質(zhì)、總氮、C/N、硝酸根離子、無機(jī)氮含量和土壤脲酶活性間具有極顯著陽性相關(guān)性。脲酶活性細(xì)菌是產(chǎn)生脲酶的一類重要微生物，直接關(guān)系土壤脲酶的性質(zhì)和數(shù)量[18]。土壤C和N是微生物的發(fā)酵底物，影響土壤微生物的種類和數(shù)量[19]，C/N影響微生物的生長(zhǎng)速度[20]，進(jìn)而影響土壤脲酶的性質(zhì)和數(shù)量。另外，有機(jī)質(zhì)分解產(chǎn)生的腐殖質(zhì)能夠固定脲酶，增加脲酶的穩(wěn)定性[21]，也可以影響脲酶活性。主成分和通徑分析結(jié)果顯示上述土壤脲酶活性關(guān)聯(lián)因子可以分為兩類，一類是脲酶活性控制因素，另一類是反饋?zhàn)饔靡蛩?。同時(shí)通徑分析發(fā)現(xiàn)土壤有機(jī)質(zhì)、C/N和土壤脲酶活性細(xì)菌是直接作用因素，其余則是間接作用因素。

土壤脲酶活性細(xì)菌在尿素氮循環(huán)中扮演了重要角色。本研究分離和初步鑒定了20份土壤樣品的脲酶活性細(xì)菌，共發(fā)現(xiàn)5屬9種細(xì)菌具有脲酶活性，相比較文獻(xiàn)中已發(fā)現(xiàn)的土壤脲酶活性細(xì)菌[22-24]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較低的多樣性。這可能是因?yàn)檠芯咳臃秶M窄以及分離、人工培養(yǎng)的方式對(duì)于微生物具有極強(qiáng)的選擇性[19]，因此，要準(zhǔn)確地闡述土壤脲酶活性細(xì)菌的多樣性，需要在更為寬泛的尺度進(jìn)行非培養(yǎng)法(宏基因組或酶切圖譜分析)的測(cè)試。

脲酶活性細(xì)菌在自然界中是豐富多樣的，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的脲酶活性細(xì)菌有內(nèi)氏放線菌(Actinomycesnaeslundii)、產(chǎn)氣桿菌(Aerobacteraerogenes)、巨大芽胞桿菌(Bacillusmegaterium)、支氣管波氏桿菌(Bordatellabronchiseptica)、Dactylosprangiumaurantiacum、小球菌(Micrococcuscerficans)、綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)、反芻月形單胞菌(Selenomonasruminantium)、桃紅莢硫菌(Thiocapsaroseopersicina)、支氣管分枝桿菌(Mycobacteriumbronchiseptica)、耶爾森氏假結(jié)核病菌(Yersiniapseudotubercuosis)和鼠疫耶爾森菌(Y.Pestis)等43個(gè)物種[22-29]。本實(shí)驗(yàn)共計(jì)發(fā)現(xiàn)4門16屬26種細(xì)菌具有脲酶活性，其中以變形菌門為優(yōu)勢(shì)類群，有8屬11種；其次是厚壁菌門4屬9種；再次是放線菌門3屬4種；最后是擬桿菌門1屬1種。研究發(fā)現(xiàn)的脲酶細(xì)菌和已報(bào)道的脲酶活性細(xì)菌多數(shù)不一樣，結(jié)果證明脲酶活性細(xì)菌具有高度多樣性。

通過比較不同材料中的脲酶活性細(xì)菌發(fā)現(xiàn)：樣地內(nèi)土壤關(guān)聯(lián)脲酶活性材料的優(yōu)勢(shì)種群是變形菌門，而土壤脲酶細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)種群是厚壁菌門，土壤中的脲酶活性菌株和土壤關(guān)聯(lián)材料中的脲酶活性菌株具有明顯的種類差異性，僅變形菌門菌株糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)和綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)能夠在2類分離材料中發(fā)現(xiàn)。農(nóng)業(yè)上常用沼氣渣、動(dòng)物糞便、農(nóng)家肥和淤泥作為肥料施入土壤中，本實(shí)驗(yàn)樣品采集地長(zhǎng)期利用以上物質(zhì)進(jìn)行施肥，然而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)農(nóng)民長(zhǎng)期使用的這些有機(jī)肥與施加后的土壤所含脲酶細(xì)菌種類上有較大差異。這可能是由于土壤相較有機(jī)質(zhì)而言具有抑菌作用，營(yíng)養(yǎng)貧瘠的特點(diǎn)[30]，外源施加的細(xì)菌難以長(zhǎng)期定殖。而厚壁菌門菌株不光具有厚壁保護(hù)，也能形成芽孢，具有極強(qiáng)的抗逆性，在其適應(yīng)土壤生態(tài)環(huán)境中發(fā)揮極重要的作用[31]。

綜上所述，土壤脲酶活性細(xì)菌直接影響土壤脲酶活性，且脲酶細(xì)菌在自然界中多樣性豐富。然而由于土壤是一個(gè)穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)，穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)對(duì)于外來生物具有排斥性，想通過外來生物對(duì)土壤環(huán)境起到持續(xù)的干擾作用，只有創(chuàng)造新的生態(tài)系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡才能實(shí)現(xiàn)[32-33]。因此，外源施用菌劑的方式調(diào)控土壤脲酶活性，要么增加系統(tǒng)干擾能力，創(chuàng)造一個(gè)新的動(dòng)態(tài)平衡才能實(shí)現(xiàn)，要么通過保護(hù)和調(diào)控本土微生物維持一個(gè)健康的動(dòng)態(tài)才能成功。

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