張 建 薛洪富 趙振軍 向 云 徐思遠(yuǎn) 費永俊

(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

樟科 (Lauraceae) 潤楠屬 (Machilus) 植物，全世界總共約100多種，主要分布于東南亞和東亞，我國有68種，主要分布于西南、中南部至臺灣，北達(dá)山東、湖北及甘肅、陜西南部[1-3]。潤楠屬植物是我國南方主要的經(jīng)濟林木，在園林應(yīng)用、木材、香料等方面占有重要地位，同時具有一定的藥用價值[4]。目前潤楠屬植物分類學(xué)的研究主要集中在經(jīng)典形態(tài)學(xué)方面，如花被裂片外是否被毛，果實的大小及形狀等。近年來，也有少數(shù)研究人員利用葉表皮形態(tài)學(xué)[5-7]、孢粉學(xué)[8]、化學(xué)成分[9-10]、分子生物學(xué)[11-12]等方法對部分潤楠屬植物進(jìn)行研究，以尋找適用于潤楠屬屬下分類系統(tǒng)的輔助分類特征及屬內(nèi)種間的系統(tǒng)演化關(guān)系的證據(jù)。目前潤楠屬植物的分類系統(tǒng)尚不完善，本研究以長江大學(xué)楠木種質(zhì)資源評價與創(chuàng)新中心收集的潤楠屬植物為研究對象，擬通過石蠟切片法，對12種潤楠屬植物的葉柄進(jìn)行形態(tài)解剖學(xué)的比較研究，從而尋找出新的潤楠屬屬下分類特征，為進(jìn)一步解決屬內(nèi)種間系統(tǒng)關(guān)系問題以及資源利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料采集

實驗材料為12種潤楠屬植物，分別為薄葉潤楠 (Machilusleptophylla)、芳槁潤楠 (Machilussuaveolens)、粉葉潤楠 (Machilusglaucifolia)、廣東潤楠 (Machiluskwangtungensis)、紅楠 (Machilusthunbergii)、基脈潤楠 (Machilusdecursinervis)、龍眼潤楠 (Machilusoculodracontis)、木姜潤楠 (Machiluslitseifolia)、潤楠 (Machiluspingii)、塔序潤楠 (Machiluspyramidalis)、狹葉潤楠 (Machilusrehderi) 和長梗潤楠 (Machiluslongipedicellata)，均為種植在長江大學(xué)西校區(qū)盆景園的2年生植株。 2016年4月，采集12種潤楠屬植物的葉柄，并立即置于70%FAA固定液中，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 研究方法

采用石蠟切片法，用刀片將葉柄切成3 mm左右若干段，切片厚度8～10 μm，番紅-固綠對染，中性樹膠封片，然后在顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照，葉柄整體觀察采用10倍物鏡，維管束觀察采用40倍物鏡。

觀測指標(biāo)包括橫切面形狀、下表皮到維管束距離比 (下表皮到維管束距離/葉柄寬)、表皮細(xì)胞形狀、維管束長寬比 (維管束長/維管束寬)、葉柄橫切面長寬比 (葉柄橫切面長/寬) 及葉柄上表面形狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉柄中部橫切面的基本結(jié)構(gòu)分析

薄葉潤楠 (圖1-1) 外觀呈馬蹄形，表皮細(xì)胞排列緊密，染色較深，皮層細(xì)胞排列疏松，緊挨韌皮部的薄壁細(xì)胞體積明顯縮小，韌皮部細(xì)胞染色情況較深，可能與含有大量粘液物質(zhì)有關(guān)。木質(zhì)部細(xì)胞排列呈 “C” 型，下表皮與木質(zhì)部之間的薄壁細(xì)胞染色較淺，體積稍大。芳槁潤楠 (圖1-2) 表皮外面明顯觀察到蠟質(zhì)層，皮層薄壁細(xì)胞橢圓形，在韌皮部和臨近韌皮部的皮層細(xì)胞中，部分細(xì)胞呈現(xiàn)黑色，這可能是油性細(xì)胞或粘液細(xì)胞染色造成的?？傮w來看，木質(zhì)部和韌皮部所占葉柄的比例較小。粉葉潤楠 (圖1-3) 也可以觀察到明顯的蠟質(zhì)層，表皮細(xì)胞由2層構(gòu)成，韌皮部細(xì)胞中觀察到較多染成黑色的細(xì)胞，木質(zhì)部細(xì)胞中可觀察到體積明顯增大的木質(zhì)部細(xì)胞。廣東潤楠 (圖1-4) 外觀呈Ω形，在表皮和外皮層中可觀察到染色較深的細(xì)胞，中皮層中染色較深細(xì)胞較少，韌皮部細(xì)胞中染色較深細(xì)胞所占比例較大，木質(zhì)部細(xì)胞的外壁染色也較深，在維管射線中也可觀察到染色較深的細(xì)胞?？傮w來看，廣東潤楠維管束結(jié)構(gòu)不夠明顯，染色較深細(xì)胞較多，可能這與廣東潤楠含有較多油性細(xì)胞或粘液細(xì)胞有關(guān)。紅楠 (圖1-5) 外觀與廣東潤楠相似，表皮染色較深，皮層中散生染色較深細(xì)胞，韌皮部細(xì)胞染色較深，呈黑色，木質(zhì)部細(xì)胞大小不一?；}潤楠 (圖1-6) 可觀察到明顯的蠟質(zhì)層，維管束較其他潤楠屬植物有明顯伸長，韌皮部中觀察到體積較大染色較深的細(xì)胞，但數(shù)量明顯偏少，木質(zhì)部細(xì)胞多為方形。龍眼潤楠 (圖1-7) 表皮和外皮層染色普遍較深，皮層細(xì)胞排列也較為緊密，韌皮部染色情況與廣東潤楠情況相似，木質(zhì)部細(xì)胞排列整齊。木姜潤楠 (圖1-8) 染色較深細(xì)胞較少，只在皮層有少量分布，韌皮部細(xì)胞染色較深，木質(zhì)部細(xì)胞排列整齊。潤楠 (圖1-9) 整體染色較深，表皮、外皮層染色較深，皮層中也分布較多的染色較深細(xì)胞，韌皮部所占比例較小，木質(zhì)部細(xì)胞排列整齊，在下表皮和木質(zhì)部之間，可觀察到2個體積明顯偏大的粘液細(xì)胞。塔序潤楠 (圖1-10) 染色較深，在韌皮部上方分布有類似木質(zhì)部細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，韌皮部中也分布染色較深的大細(xì)胞，木質(zhì)部細(xì)胞排列整齊緊密，有厚壁細(xì)胞的存在。狹葉潤楠 (圖1-11) 呈明顯的Ω形，皮層中分布數(shù)量較多體積較大染色較深的細(xì)胞，維管束呈明顯的 “C” 形，木質(zhì)部細(xì)胞排列整齊有規(guī)則。長梗潤楠 (圖1-12) 表皮和外皮層細(xì)胞染色較深，在維管束左右兩側(cè)的皮層細(xì)胞分布較多染色較深細(xì)胞，韌皮部染色較深，韌皮部細(xì)胞大小不一。

根據(jù)上述分析結(jié)果可知，12種潤楠屬葉柄中部的橫切面形狀基本都呈半圓形態(tài)，但大致可分為馬蹄形和Ω形2種，馬蹄形潤楠屬植物包括薄葉潤楠、芳槁潤楠、粉葉潤楠、基脈潤楠、龍眼潤楠、塔序潤楠和長梗潤楠，Ω形潤楠屬植物包括廣東潤楠、紅楠、木姜潤楠、潤楠和狹葉潤楠；表皮細(xì)胞有2種形狀，分別為長方形和近似圓形2種；表皮細(xì)胞以內(nèi)區(qū)域大部分為薄壁組織，維管束部分呈 “C” 字形規(guī)則的分布于其中；以橫切面下表皮一側(cè)為判斷位置，表皮細(xì)胞到維管束距離相對比 (表皮到維管束距離/葉柄寬) 差異也有較大區(qū)別，從狹葉潤楠的0.282到木姜潤楠的0.504，相對數(shù)據(jù)之間的差異表明上表皮一側(cè)的薄壁組織的相對厚度有所不同，結(jié)合上表皮一側(cè)的薄壁組織的相對厚度和觀察結(jié)果來看，薄葉潤楠，廣東潤楠、龍眼潤楠和狹葉潤楠遠(yuǎn)軸一側(cè)薄壁組織相對最??；芳槁潤楠、粉葉潤楠、紅楠、基脈潤楠、潤楠、塔序潤楠和長梗潤楠厚度居中；木姜潤楠最厚。在橫切面上表皮一側(cè)觀察中發(fā)現(xiàn)，該側(cè)形狀不一，分內(nèi)凹和外凸2種。內(nèi)凹部分又有所區(qū)別，如薄葉潤楠，中間呈 “v” 型溝；芳槁潤楠、木姜潤楠、狹葉潤楠、長梗潤楠內(nèi)凹程度較大；粉葉潤楠和基脈潤楠內(nèi)凹程度較低。外凸部分也有所差別，如龍眼潤楠凸出程度較低，而廣東潤楠、紅楠、潤楠、塔序潤楠凸出程度較大。葉柄中部橫切面的長寬比有明顯的區(qū)別，主要分2類，第1類為葉柄橫切面中長大于寬，第2類為葉柄橫切面的長小于寬，除了潤楠和塔序潤楠為第2類外，其余10種均為第1類。

1～12依次是薄葉潤楠、芳槁潤楠、粉葉潤楠、廣東潤楠、紅楠、基脈潤楠、龍眼潤楠、木姜潤楠、潤楠、塔序潤楠、狹葉潤楠、長梗潤楠。

圖112種潤楠屬植物葉柄中部橫切面觀察(×10)
Fig.1 Observation of the middle transverse section of petioles of 12Machilus(×10)

2.2 葉柄中部橫切面的維管束結(jié)構(gòu)分析

觀察發(fā)現(xiàn)，12種潤楠屬植物葉柄部橫切面的維管束部分均呈 “C” 型居于葉柄中部偏近上表皮一側(cè)(圖2)。薄葉潤楠(圖2-1)緊鄰韌皮部的皮層細(xì)胞有體積較大染色較深的細(xì)胞，韌皮部細(xì)胞排列不整齊，木質(zhì)部部分細(xì)胞存在細(xì)胞壁加厚。芳槁潤楠(圖2-2)緊鄰韌皮部的細(xì)胞存在大量厚壁細(xì)胞，韌皮部細(xì)胞染色較深，木質(zhì)部細(xì)胞存在較多細(xì)胞壁加厚細(xì)胞。粉葉潤楠(圖2-3)韌皮部散生染色較深體積較大細(xì)胞，可觀察到形成層細(xì)胞，木質(zhì)部細(xì)胞存在大小2種類型。廣東潤楠(圖2-4)韌皮部細(xì)胞染色較深，木質(zhì)部細(xì)胞存在細(xì)胞壁加厚情況。紅楠(圖2-5)韌皮部細(xì)胞染色較深，木質(zhì)部細(xì)胞排列不整齊?；}潤楠(圖2-6)維管束較其他潤楠屬植物有明顯伸長，韌皮部中觀察到體積較大染色較深的細(xì)胞，但數(shù)量較少，木質(zhì)部細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。龍眼潤楠(圖2-7)韌皮部染色較深，木質(zhì)部細(xì)胞排列整齊。木姜潤楠(圖2-8)韌皮部細(xì)胞染色較深，木質(zhì)部細(xì)胞排列整齊。潤楠 (圖2-9) 韌皮部細(xì)胞體積較小，數(shù)量偏少，木質(zhì)部細(xì)胞排列整齊。塔序潤楠 (圖2-10) 韌皮部中有少量染色較深的大細(xì)胞，木質(zhì)部細(xì)胞排列整齊緊密，有厚壁細(xì)胞的存在。狹葉潤楠 (圖2-11) 緊鄰韌皮部的皮層細(xì)胞有染色加深的大細(xì)胞，韌皮部排列不規(guī)則，木質(zhì)部細(xì)胞排列整齊有規(guī)則。長梗潤楠 (圖2-12) 韌皮部中存在染色較深的大細(xì)胞，木質(zhì)部細(xì)胞存在細(xì)胞壁加厚現(xiàn)象。

1～12依次是薄葉潤楠、芳槁潤楠、粉葉潤楠、廣東潤楠、紅楠、基脈潤楠、龍眼潤楠、木姜潤楠、潤楠、塔序潤楠、狹葉潤楠、長梗潤楠。

圖212種潤楠屬植物葉柄中部維管束觀察(×40)
Fig.2 Observation of the middle transverse section of vascular bundle of 12Machilus(×40)

維管束長寬比主要分3種情況 (表1)：廣東潤楠、潤楠和長梗潤楠維管束長寬比在2～3之間；芳槁潤楠、粉葉潤楠、紅楠、基脈潤楠、木姜潤楠、塔序潤楠和狹葉潤楠維管束長寬比在3～4之間；薄葉潤楠和龍眼潤楠維管束長寬比為4倍以上。

表1 12種潤楠屬植物參數(shù)測定Table 1 Determination of 12 Species of Machilus

2.3 基于12種潤楠屬植物葉柄解剖特征的聚類分析

根據(jù)表1的測定結(jié)果，以下表皮到維管束的相對距離比、維管束長寬比、葉柄長寬比、葉柄形狀、葉柄表皮細(xì)胞形狀和上表皮細(xì)胞形狀6個性狀參數(shù)對12種潤楠屬材料進(jìn)行對聚類分析，定性形狀以0 (否) 或1 (是) 表示，用Ntsys軟件應(yīng)用UPGMA分析法進(jìn)行對比分析，結(jié)果見圖3。

圖3基于6個解剖參數(shù)的12種潤楠屬植物聚類分析圖
Fig.3 Clustering analysis diagram based on 6 anatomic parameters of 12Machilus

聚類結(jié)果表明:12種潤楠屬植物可分為4類：第1類分別為薄葉潤楠、芳稿潤楠、粉葉潤楠、塔序潤楠和長梗潤楠；第2類分別為紅楠、木姜潤楠和基脈潤楠；第3類為廣東潤楠、龍眼潤楠和狹葉潤楠；第4類為潤楠。研究還發(fā)現(xiàn)，第1類中的芳稿潤楠和粉葉潤楠親緣關(guān)系最為緊密，薄葉潤楠和塔序潤楠次之，長梗潤楠與其他4種潤楠屬植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但均屬于毛花組[1]，與傳統(tǒng)分類學(xué)觀點相一致；第2類的紅楠、木姜潤和基脈潤楠親緣關(guān)系較近，均屬于紅楠亞組，這也與傳統(tǒng)分類學(xué)觀點相一致；第3類中的廣東潤楠為黃心樹亞組、龍眼潤楠為枇杷葉潤楠亞組、狹葉潤楠為紅楠亞組，這3種不同的亞組歸為一類，與傳統(tǒng)的分類結(jié)果不一致，這可能是由于測定指標(biāo)較少造成的，關(guān)于這3種潤楠屬植物的系統(tǒng)分類學(xué)地位，還需要進(jìn)一步的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行確定。潤楠作為潤楠屬植物的模式種，單獨作為一類。

根據(jù)12種潤楠屬植物葉柄的解剖特征來看，12種潤楠屬植物之間確實存在著明顯的差異，此可以作為種間鑒別的重要輔助依據(jù)，對種間分類學(xué)也具有一定的參考意義。

3 結(jié)論與討論

葉片性狀受種源分布[13]、光照、營養(yǎng)[14]等外界條件影響較大，而葉柄內(nèi)部結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，可以作為植物分類的主要參考指標(biāo)。葉柄解剖的比較研究在高等植物分類中具有重要的作用，對于種間親緣關(guān)系的研究也非常有幫助[15]。王濤等[16]對11種鼠尾草屬 (Salvia) 的葉柄進(jìn)行石蠟切片觀察，發(fā)現(xiàn)葉柄內(nèi)部結(jié)構(gòu)上鼠尾草種間表現(xiàn)出了較大的差異，其中維管束數(shù)量以及木質(zhì)部、韌皮部厚度可以作為鼠尾草屬植物鑒定和分類學(xué)研究提供有力依據(jù)。宋文嬋等[17]對8種蒲公英屬 (Taraxacum) 植物的葉柄進(jìn)行解剖觀察，發(fā)現(xiàn)葉柄中部橫切面形狀、維管束類型可以作為種間分類鑒定的重要依據(jù)。Salmaki等[18]對山芝麻屬 (Helicteres) 葉形態(tài)解剖的研究結(jié)果表明葉柄的橫切面、徑軸長、極軸長以及維管束數(shù)目可以作為種間分類的主要判定依據(jù)。

通過對12種潤楠屬植物葉柄的石蠟切片觀察，表明葉柄解剖特征可作為種間鑒別特征的輔助判斷標(biāo)準(zhǔn)。潤楠屬植物分類研究多以成年株為對象，從莖、葉、花、果等特征進(jìn)行描述[1-2]，并輔以葉表皮特征[5-6]、孢粉學(xué)特征[8]以及分子手段[11-12]進(jìn)行分類驗證，但均缺乏組織形態(tài)學(xué)的證據(jù)，對于幼苗的分類鑒定存在很大難度。本研究以2年生實生苗的葉柄為研究對象，采用石蠟切片的方法，從顯微結(jié)構(gòu)上進(jìn)行觀測，本實驗研究結(jié)果表明葉柄橫截面形狀、上部葉柄形狀、葉柄表皮細(xì)胞有形狀、維管束長寬比、葉柄長寬比以及下表皮到維管束相對距離比等指標(biāo)較為穩(wěn)定，可以作為種間分類的依據(jù)，這也為其他潤楠屬植物的種間鑒別提供了參考。葉柄形態(tài)解剖的觀察呈現(xiàn)出的新特征對推斷潤楠屬下種間分類非常有幫助。此外，通過實驗觀察，發(fā)現(xiàn)部分潤楠屬植物葉柄中分布有油細(xì)胞和粘液細(xì)胞，這與楠屬 (Phoebe) 植物葉片中存在油細(xì)胞和粘液細(xì)胞[19]的結(jié)果相吻合。實驗中發(fā)現(xiàn)，油細(xì)胞和粘液細(xì)胞的數(shù)量以及分布在不同潤楠屬植物中存在一定差異，比如廣東潤楠和狹葉潤楠，存在明顯的粘液細(xì)胞，這也許可以作為屬內(nèi)分布的一個輔助標(biāo)準(zhǔn)。

石蠟切片過程中，發(fā)現(xiàn)部分潤楠屬植物葉柄切片并不完整，對于這些種的石蠟切片方法也做了部分改進(jìn)，但效果不理想，這可能與葉柄中所含特定化學(xué)成分有關(guān)，從而導(dǎo)致圖片效果不太理想。目前很多文獻(xiàn)對潤楠屬部分植物進(jìn)行了化學(xué)成分研究的報道，其主要成分包括丁內(nèi)酷類、木脂素類，黃酮類，生物堿類，倍半萜類，三萜類和其他結(jié)構(gòu)類型[20-21]，揮發(fā)油及其生物活性也有報道[22]，其中丁內(nèi)脂類和木脂素類化合物是潤楠屬植物的特征性代表成分。在石蠟切片觀察中，發(fā)現(xiàn)不同種之間存在染色差異，并且部分種存在特殊類型細(xì)胞，比如芳槁潤楠在緊鄰韌皮層的皮層中，存在數(shù)量較多的厚壁細(xì)胞，與其他種類有明顯不同。因此，在石蠟切片基礎(chǔ)上，還應(yīng)進(jìn)行組織化學(xué)方面的觀察，以完善補充種間系統(tǒng)分類學(xué)證據(jù)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志: 第31卷[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1982.

[2] 中國樹木志編輯委員會. 中國樹木志: 第1卷[M]. 北京: 中國林業(yè)出版社, 1983.

[3] 林夏珍. 浙江潤楠屬植物的數(shù)量分類[J]. 林業(yè)科學(xué), 2007, 43(11): 151-156.

[4] 卜鵬濱, 里艷茹, 姜明, 等. 粗壯潤楠中的木脂素類成分[J]. 中國中藥雜志, 2013, 38(11): 1740-1746.

[5] 莊雪影, 張粵, 孫同. 香港潤楠屬植物葉表皮形態(tài)及分類學(xué)意義[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2002, 23(1): 52-54.

[6] 鐘義, 夏念和. 國產(chǎn)潤楠屬植物的葉表皮特征及其系統(tǒng)學(xué)意義[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報, 2010, 18(2): 109-121.

[7] 沈雪梅. 17種樟科潤楠屬植物的數(shù)量分類與分子分類研究[D]. 上海: 華東師范大學(xué), 2015.

[8] 王玉國, 韋發(fā). 樟科兩個近緣屬潤楠屬和楠木屬花粉形態(tài)的比較研究[J]. 廣西植物, 2003, 23(1): 27-30, 96-99.

[9] 戴磊, 馮志堅, 李文峰. 4種潤楠屬植物精油成分分析[J]. 福建林業(yè)科技, 2013, 40(1): 49-51.

[10] 李文鋒. 廣東樟屬和潤楠屬植物精油成分分析[D]. 廣州: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

[11] 陳俊秋, 李朗, 李捷, 等. 樟科潤楠屬植物ITS序列貝葉斯分析及其系統(tǒng)學(xué)意義[J]. 云南植物研究, 2009, 31(2): 117-126.

[12] 劉玉香, 宋曉琛, 江香梅. 潤楠ISSR-PCR優(yōu)化反應(yīng)體系建立及引物篩選[J]. 林業(yè)科技開發(fā), 2013, 27(5): 24-28.

[13] 陳麗君, 劉明騫, 廖柏勇, 等. 苦楝不同種源葉片性狀變異研究[J]. 西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2016, 36(5): 16-20.

[14] 尚旭嵐, 李瓊瓊, 鄧波, 等. 光照和施肥對青錢柳幼苗葉片性狀與解剖結(jié)構(gòu)的影響[J]. 西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2014, 34(6): 9-15.

[15] Simpson M G. Plant Systematic[M]. Pittsburgh: Academic Press, 2006.

[16] 王濤, 劉世勇, 王龍, 等. 11種鼠尾草屬葉片和葉柄解剖特征及其分類學(xué)意義[J]. 中國中藥雜志, 2014, 39(14): 2629-2634.

[17] 宋文嬋, 寧偉, 趙鑫, 等. 8種蒲公英屬植物葉柄解剖學(xué)特征與分類學(xué)意義[J]. 西北植物學(xué)報, 2011, 31(3): 468-474.

[18] Salmaki Y, Zarre S, Lindqvist C, et al. Comparative leaf anatomy of Stachys (Lamiaceae: Lamioideae) in Iran with a discussion on its subgeneric classification[J]. Plant Systematics and Evolution, 2011, 294(1): 109-125.

[19] 周存宇, 萬小麗, 張建, 等. 五種楠屬植物葉片油細(xì)胞和黏液細(xì)胞的比較[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015(18): 4506-4508, 4518.

[20] Cheng W, Zhu C, Xu W, et al. Chemical constituents of the bark ofMachiluswangchianaand their biological activities[J].J Nat Prod,2009,72(12):2145-2152.

[21] Li Y, Cheng W, Zhu C, et al. Bioactive neolignans and lignans from the bark ofMachilusrobusta[J]. J Nat Prod, 2011, 74(6): 1444-1452.

[22] Ho C, Liao P, Su Y. Composition and antimicrobial activities of the leaf essential oil of Maehilus zuihoensis from Taiwan[J]. Brazilian Journal of Pharmacognosy, 2012, 22(2): 277-283.