李 雙，李 澎，張 昱△，楊 斌，李劉生，許勇鋼，郝 偉，趙晉寧

(1. 中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院腎病科，北京 100091； 2. 中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實驗研究中心，北京 100091)

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是各種慢性腎臟疾病的總稱，隨著CKD病情進(jìn)展，患者的腎功能將進(jìn)一步下降進(jìn)而發(fā)展為慢性腎衰竭，最終進(jìn)入終末期腎臟病，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。張路霞等[1]對47204名中國成年人(18～95歲)進(jìn)行橫斷面研究，其中CKD患者約占10.8%，相當(dāng)于全國有1.2億左右成年人患有不同程度的CKD。蛋白尿尤其是長期持續(xù)的大量蛋白尿是加速CKD進(jìn)展的獨(dú)立危險因素，在CKD早期積極干預(yù)治療，對延緩CKD的進(jìn)展至關(guān)重要。足細(xì)胞是構(gòu)成腎小球濾過膜的最后屏障，其損傷是導(dǎo)致蛋白尿的重要原因，在CKD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。近年來，足細(xì)胞病變在腎小球疾病進(jìn)展中的作用日益成為人們關(guān)注的焦點。加味黃芪赤風(fēng)湯是張昱教授經(jīng)過多年臨床實踐，衷中參西，不斷增減變化而形成的治療CKD蛋白尿行之有效的方劑。我們前期研究證實，加味黃芪赤風(fēng)湯能夠顯著減少阿霉素大鼠尿蛋白，改善腎臟纖維化[2-4],并能夠緩解脂多糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞惡性表型[5-6]。本研究立足于加味黃芪赤風(fēng)湯對阿霉素(adriamycin，ADR)誘導(dǎo)腎小球足細(xì)胞凋亡(apoptosis)的影響，以探討該方對足細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料

1.1 實驗動物

健康VAF/SPF 級SD雄性大鼠63只，體質(zhì)量(250±10)g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(合格證編號SCXK(京)2012-0001)。實驗期間飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院SPF級動物房，溫度在 24 ℃～28 ℃，濕度75%左右，以標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，自由飲水及攝食，適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d。

1.2 實驗細(xì)胞

小鼠腎小球足細(xì)胞(mouse podocyte，資源編號3111C0001CCC000230)由國家實驗細(xì)胞資源共享平臺提供。

1.3 實驗藥品

加味黃芪赤風(fēng)湯組成：生黃芪30 g，赤芍20 g，防風(fēng)10 g，芡實10 g，金櫻子10 g，穿山龍20 g，白花蛇舌草10 g，飲片來自于中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院草藥房，分別煎煮濃縮至1.140、0.570和0.285 g(生藥)/ml。 替米沙坦片(80 mg/片，勃林格殷格翰(德國)生產(chǎn)，批號D1420006572)160 mg研制成粉溶于384 mL純凈水，按0.417 mg/mL配制成混懸液，4 ℃冰箱密封保存。

1.4 主要試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)基、優(yōu)級胎牛血清、胰酶(GIBCO公司)；阿霉素、鏈霉素、青霉素、重組小鼠γ-干擾素(Sigma公司)；RIPA裂解液、PMSF(北京艾德生物科技有限公司提供)；AnnexinV/FITC試劑盒(BD公司)；透射電子顯微鏡(FEI TECNAI G2 SPIRIT)；紫外分光光度計(德國Biophotometer公司)；轉(zhuǎn)移脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造公司)等。

2 方法

2.1 含藥血清制備

63只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，其中空白組15只大鼠每次灌服等量純凈水，替米沙坦組12只大鼠每次按0.417 mg/ml灌服，加味黃芪赤風(fēng)湯分別按高、中、低劑量組每組12只每次按1.140、0.570、0.285 g(生藥)/ml灌服，每日灌胃1次，持續(xù)給藥1周。于末次灌胃2 h后以4%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，通過腹主動脈取血，血液于37 ℃環(huán)境靜置2 h，待血液充分凝固后3000 r/min，10 min離心，將同組大鼠血清上清液收集到一起置于新的離心管，經(jīng)56 ℃水浴30 min滅活，一次性無菌過濾器將血清過濾除菌，并分裝于1.5 mL的凍存管中，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

足細(xì)胞增殖階段培養(yǎng)：DMEM培養(yǎng)液中+10%胎牛血清+鏈霉素100μg/mL+青霉素100 U/mL+20U/ml(重組小鼠γ-干擾素)，置于33 ℃5%CO2培養(yǎng)箱，每2～3 d換液1次，待細(xì)胞呈鵝卵石樣、密度至85%左右用0.25%胰酶消化，后換成分化階段培養(yǎng)液，足細(xì)胞進(jìn)入分化階段。

足細(xì)胞分化階段培養(yǎng)：DMEM培養(yǎng)液中+10%胎牛血清+鏈霉素100μg/mL+青霉素100 U/mL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，每2～3 d換液1次,10～14 d后分化成熟可用于實驗。

2.3 細(xì)胞分組

空白組：10%空白對照血清+DMEM培養(yǎng)基+鏈霉素100μg/mL+青霉素100 U/mL；替米沙坦組：10%替米沙坦血清+DMEM培養(yǎng)基+鏈霉素100 μg/mL+青霉素100 U/mL；加味黃芪赤風(fēng)湯高、中、低劑量組(以下均簡稱中藥高、中、低劑量組)：分別以10%高、中、低劑量中藥血清+DMEM培養(yǎng)基+鏈霉素100 μg/mL+青霉素100 U/mL。取本次實驗前期所測ADR 2 μg/mL作為最佳損傷濃度用于實驗。阿霉素與治療藥物同時加入，作用24 h后檢測相關(guān)指標(biāo)。

2.4 CCK-8法檢測各處理組足細(xì)胞存活率

取96孔板培養(yǎng)的分化成熟的足細(xì)胞，按上述細(xì)胞分組方法，每組6個復(fù)孔，每孔加入100 μl孵育液，孵育24 h(參考相關(guān)文獻(xiàn)，檢測時間點選擇24 h[7])用CCK-8法檢測各組足細(xì)胞存活率，經(jīng)酶標(biāo)儀記錄各組450 nm吸光度值。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測各處理組足細(xì)胞凋亡率

取6孔板培養(yǎng)的分化成熟足細(xì)胞，分組后用0.25%胰酶消化細(xì)胞收集細(xì)胞到EP管；將收集到的細(xì)胞重懸于1×Annexin Binding Buffer，使細(xì)胞密度不少于每100 μl有1×105個；加入5 μL AnnexinV-FITC及5 μL Propidium Iodide(PI)混勻、避光，25 ℃放置15 min；加入400 μl的1×Annexin Binding Buffer混勻，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，F(xiàn)L1通道檢測AnnexinV，F(xiàn)L3通道檢測PI，以PI陰性、AnnexinV陽性為細(xì)胞凋亡判定標(biāo)準(zhǔn)。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點圖上，左下象限代表正常細(xì)胞，右下象限代表早期凋亡細(xì)胞，右上象限代表晚期凋亡及壞死的細(xì)胞，本次實驗統(tǒng)計的是右下象限早期凋亡細(xì)胞。

2.6 透射電鏡下觀察各處理組足細(xì)胞凋亡超微結(jié)構(gòu)

具體操作方法：細(xì)胞固定：5%戊二醛固定1～2 h后，0.1 mol/L PBS洗2次，每次15 min；1%餓酸固定1～2 h后用0.1 mol/L PBS洗2次，每次15 min，4℃；細(xì)胞脫水：用50%、70%、90%乙醇各脫水1次，每次20 min 4℃；100%乙醇與100%環(huán)氧丙烷(1∶1)脫水20 min 4℃；100%環(huán)氧丙烷脫水20 min 4℃；100%環(huán)氧丙烷脫水2次，每次20 min，室溫；細(xì)胞包埋：100%環(huán)氧丙烷與包埋液(2∶1)室溫處理4 h，100%乙醇與100%環(huán)氧丙烷(1∶1)室溫處理過夜，純包埋液37 ℃處理3 h；細(xì)胞固化：40 ℃ 2 h，60 ℃ 4 h，80 ℃ 10 h；超薄切片：鈾、鉛染色，分別15 min、10 min，鏡下觀察。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

圖2 流式細(xì)胞儀檢測各組足細(xì)胞早期凋亡率變化

3 結(jié)果

3.1 各處理組對ADR誘導(dǎo)足細(xì)胞存活率的影響

表1圖1顯示，模型組與空白組比較，足細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.01)，表明ADR能夠造成足細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷；中藥高、中劑量組及替米沙坦組與模型組比較，足細(xì)胞存活率均明顯上升(P<0.01)，3組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明加味黃芪赤風(fēng)湯高、中劑量及替米沙坦均能夠拮抗ADR誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷；中藥低劑量組與模型組比較，足細(xì)胞存活率升高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與中藥高、中劑量組比較，低劑量組足細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.01)，表明加味黃芪赤風(fēng)湯在拮抗ADR誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中，可能具有一定的量效關(guān)系。

圖1 各處理組對ADR誘導(dǎo)的足細(xì)胞存活率比較注：與空白組比較:*P<0.01；與模型組比較:#P<0.01，##P>0.05

組別例數(shù)吸光度值空白組61.44±0.07模型組60.75±0.10*替米沙坦組61.19±0.02#中藥高劑量組61.20±0.02#中藥中劑量組61.18±0.03#中藥低劑量組60.84±0.05##

注：與空白組比較:*P<0.01；與模型組比較:#P<0.01，##P>0.05

3.2 各處理組足細(xì)胞凋亡情況比較

表2圖2顯示，EXPO32 v1.2軟件分析數(shù)據(jù)顯示，模型組與空白組比較足細(xì)胞早期凋亡率明顯上升(P<0.01)；中藥各組及替米沙坦組與模型組比較，足細(xì)胞早期凋亡率均明顯下降(P<0.01)；與替米沙坦組比較，中藥高、中劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與中藥高、中劑量組比較，低劑量組足細(xì)胞早期凋亡率明顯升高(P<0.01)。

表2 各處理組對ADR誘導(dǎo)足細(xì)胞早期凋亡的影響

注：與空白組比較:*P<0.01；與模型組比較:#P<0.01；與替米沙坦組比較:**P>0.05；與中藥高、中劑量比較:▲P<0.01

圖3 透射電鏡下各組足細(xì)胞凋亡超微結(jié)構(gòu)(20000×)

3.3 透射電鏡下各組足細(xì)胞凋亡超微結(jié)構(gòu)變化

圖3顯示，透射電鏡顯示，空白組足細(xì)胞胞體如常，細(xì)胞器較多，核仁清晰，核膜邊緣光滑、完整，核染色質(zhì)細(xì)膩、均勻地分布在核內(nèi)，未見凋亡小體、染色體邊集等凋亡結(jié)構(gòu)。模型組足細(xì)胞明顯皺縮，胞漿內(nèi)細(xì)胞器減少，染色質(zhì)邊集、凝聚成塊、核碎裂，形成凋亡小體。經(jīng)藥物干預(yù)后，各組足細(xì)胞凋亡改變可見不同程度的緩解。如替米沙坦組細(xì)胞皺縮，胞漿內(nèi)細(xì)胞器略減少，核仁清晰可見，核膜較厚、染色質(zhì)邊集；中藥高劑量組細(xì)胞略皺縮呈圓形，包漿內(nèi)細(xì)胞器略減少，核膜厚，染色質(zhì)固縮略有邊集；中藥中劑量組細(xì)胞皺縮呈圓形,胞漿內(nèi)細(xì)胞器減少,核膜厚，染色質(zhì)固縮邊集可見；中藥低劑量組細(xì)胞明顯皺縮呈圓形,核碎裂，染色質(zhì)凝聚成塊。

4 討論

張昱臨證診治CKD非常重視“氣虛證”“血瘀證”“風(fēng)(邪)證”的辨識，認(rèn)為氣虛、血瘀、風(fēng)擾三者是CKD的基本病機(jī)，并確立了“益氣活血祛風(fēng)”治法。據(jù)此法立方遣藥，研制出代表方加味黃芪赤風(fēng)湯。黃芪赤風(fēng)湯出自清代醫(yī)家王清任《醫(yī)林改錯》，其組方之旨與CKD的基本病機(jī)相合，故張昱將該方引入CKD的治療，在多年臨床研究基礎(chǔ)上，對其反復(fù)嘗試改進(jìn)，形成目前行之有效的加味黃芪赤風(fēng)湯。該方由生黃芪、防風(fēng)、赤芍、穿山龍、芡實、金櫻子、白花蛇舌草組成。方中生黃芪、芡實、金櫻子益腎補(bǔ)脾、固攝精微，赤芍活血化瘀，穿山龍防風(fēng)祛風(fēng)、化濕、通絡(luò)兼有活血祛瘀之功，白花蛇舌草清熱解毒，全方共奏益氣活血、祛風(fēng)解毒之功效。

足細(xì)胞損傷在蛋白尿的形成以及CKD進(jìn)展中起重要作用。足細(xì)胞是構(gòu)成腎小球濾過膜的重要組成成分，具有生物合成、維持腎小球毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)以及參與腎小球選擇性濾過等多種功能，其損傷是導(dǎo)致蛋白尿的重要原因。近年來，足細(xì)胞病變在腎小球疾病進(jìn)展中的作用日益成為關(guān)注的焦點。近期研究發(fā)現(xiàn)，腎小球足細(xì)胞的損傷程度與CKD病情進(jìn)展有密切關(guān)系，足細(xì)胞減少的程度與腎小球硬化及腎小球濾過率的下降密切相關(guān)，足細(xì)胞減少是CKD活動性的重要標(biāo)志[8-9]。本研究表明，加味黃芪赤風(fēng)湯可以拮抗ADR誘導(dǎo)足細(xì)胞存活率的下降，從而保護(hù)足細(xì)胞，減輕足細(xì)胞損傷。

凋亡是指細(xì)胞受到某些信號或刺激后，由特定基因調(diào)控而發(fā)生的一種主動性消亡過程。在正常情況下可以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，當(dāng)有害物質(zhì)存在時則作為一種防御機(jī)制發(fā)揮作用。但是過度的凋亡則會引起細(xì)胞的Ⅰ型程序性死亡，從而破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。研究表明，凋亡在腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，對于腎臟疾病而言是一把“雙刃劍”。一方面，細(xì)胞凋亡可以清除浸潤的炎癥細(xì)胞和異常增殖的腎臟細(xì)胞，從而促進(jìn)腎臟組織結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)[10-11]。另一方面，細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致腎臟細(xì)胞的減少，加速腎小管萎縮和腎小球進(jìn)行性硬化，從而加劇了腎臟病進(jìn)程。本研究結(jié)果表明，在ADR誘導(dǎo)的腎小球足細(xì)胞損傷中，細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)出高水平表達(dá)，表現(xiàn)為過度凋亡的狀態(tài)，從而加劇腎小球足細(xì)胞損傷[12]。而采用加味黃芪赤風(fēng)湯干預(yù)后，足細(xì)胞凋亡水平下降，電鏡下足細(xì)胞損傷超微結(jié)構(gòu)也隨之改善。該研究提示，抑制足細(xì)胞過度凋亡可能是加味黃芪赤風(fēng)湯發(fā)揮足細(xì)胞保護(hù)作用的一種內(nèi)在機(jī)制。

本研究僅檢測了加味黃芪赤風(fēng)湯含藥血清對阿霉素誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡中早期凋亡的影響，而對其晚期凋亡及總凋亡的影響還有待于進(jìn)一步的研究。

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