賈鵬暉，黃 琪，許鳳清，金傳山，2，王 培，馬 凱，穆鳳揚，吳德玲，2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012； 2.安徽省現(xiàn)代中藥重點實驗室， 安徽 合肥 230012；3.亳州市永剛飲片廠有限公司，安徽 亳州 236800)

知母為百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)的干燥根莖，具有清熱瀉火、滋陰潤燥等功效[1]。知母主產(chǎn)于河北、安徽等地，其中河北為知母的道地產(chǎn)區(qū)，安徽知母栽培面積每年維持在5萬畝左右，是知母主產(chǎn)地之一。知母須根較為發(fā)達(dá)，占根莖總量的20%～30%，而在知母產(chǎn)地加工過程中，須根作為非藥用部位予以去除，大量的須根被丟棄，造成了巨大的資源浪費和環(huán)境污染。有研究表明，知母須根的主要化學(xué)成分與主根基本相同，且與主根在抗炎、抗菌解熱及降血糖方面具有相當(dāng)作用[2-3]。新芒果苷、芒果苷、異芒果苷為知母中主要酮類成分，其中新芒果苷與芒果苷均具有抗炎抗哮喘作用[4]，芒果苷還具有降血糖[5-6]，抗菌[7]及抗氧化[8]的作用，異芒果苷可以通過調(diào)節(jié)在游離脂肪酸吸收和脂質(zhì)氧化上的基因表達(dá)水平，從而改善非酒精性脂肪肝[9]。知母酮類成分的含量測定一般選用紫外檢測法，宋澤璧等[10]用高效液相紫外檢測法測定鹽炙前后知母中新芒果苷、芒果苷和異芒果苷的成分差異，劉敏等[11]用相同的分析方法考察炮制前后知母中新芒果苷與芒果苷的含量變化。本研究以知母須根為研究對象，采用高效液相二極管陳列檢測法(high-performance liquid chromatography-diode array detection，HPLC-DAD)測定知母須根中新芒果苷、芒果苷及異芒果苷的含量，為知母須根的后續(xù)研究及其綜合開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SHIMADZU LC-15C高效液相色譜儀；SHIMADZU LC-15C二元泵；SHIMADZUS SPD-15C檢測器；Lab Solutions色譜工作站；萬分之一電子天平(FA2004型，上海精科)；超聲清洗儀(AS5150A型，Autoscience公司)；A10一體式超純水機(jī)(美國Milipore公司)。

1.2 試藥 新芒果苷(批號 64809-67-2)、芒果苷 (批號 111607-200402)、異芒果苷(批號 24699-16-9)均購于上海海燦生物科技有限公司，純度均大于98%；乙腈(色譜純)：Fisher；冰醋酸(分析純)：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；超純水為實驗室自制。知母須根采自安徽省亳州市，河北省安國市、易縣等地區(qū)，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)劉守金教授鑒定為百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)的須根。

2 方法和結(jié)果

2.1 3個黃酮苷的含量測定

2.1.1 色譜條件 Shim-pack 色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.4%冰醋酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～5 min，10% A；5～15 min，10%～12% A；15～25 min，12%～20% A；25～30 min，20%～10% A；30～35 min，10% A)，流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長為258 nm。

2.1.2 對照品溶液的制備 取新芒果苷、芒果苷及異芒果苷對照品適量置容量瓶中，用50%甲醇溶解，制成新芒果苷0.53 mg/mL，芒果苷0.44 mg/mL，異芒果苷0.093 mg/mL的混合對照品溶液，于4 ℃冰箱儲存，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取知母須根粉末(60目)0.1 g，精密加入50%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲(功率400 W，頻率40 kHz)提取30 min，放冷后用提取溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量。過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密移取上述混合對照品溶液 5 mL，加50%甲醇定容至10 mL量瓶中作為母液。并將母液分別按2、4、5、8、20倍依次稀釋，得到系列混合對照品。分別吸取按不同倍數(shù)稀釋的對照品溶液20 μL，注入高效液相色譜儀，依“2.1.1”項下色譜條件測定。以各對照品進(jìn)樣質(zhì)量(X)為橫坐標(biāo)，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到新芒果苷、芒果苷和異芒果苷的回歸方程。新芒果苷：Y=2 984 605.79X-113 272.73，r=0.999 9(n=6)；芒果苷：Y=3 939 885.24X-267 336.7，r=0.999 8(n=6)；異芒果苷：Y=3 590 453.43X-30 891.17，r=0.999 9(n=6)，結(jié)果表明新芒果苷、芒果苷、異芒果苷分別在0.26～5.25 μg、0.22～4.35 μg、0.046～0.930 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，高效液相色譜圖見圖1。

注：1．新芒果苷；2．芒果苷；3．異芒果苷圖1 混合對照品(A)和知母須根(B)高效液相色譜圖譜

2.1.5 精密度試驗 取混合對照品溶液，精密吸取對照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6 次，測定新芒果苷、芒果苷、異芒果苷峰面積，計算得其RSD值分別為2.45%、2.64%、2.89%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，進(jìn)樣量20 μL，按上述色譜條件測定新芒果苷、芒果苷、異芒果苷峰面積，計算得其RSD 值分別為0.63%、0.84%、1.27%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗 取同一批樣品(S-1)的須根粉末6份，按“2.1.3”方法制備6份供試品溶液，精確吸取20 μL，按上述色譜條件測定芒果苷、新芒果苷、異芒果苷含量，新芒果苷、芒果苷、異芒果苷的平均含量分別為1.84%、1.53%、0.56%，RSD分別為1.74%、1.39%、2.89%(n=6)，說明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱量樣品(S-1)的須根粉末6份，每份約0.05 g，分別精密加入等量新芒果苷、芒果苷、異芒果苷對照品，按“2.2.3”方法制備供試液，在上述色譜條件下依次進(jìn)樣測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗

2.2 樣品含量測定 實驗收集了11批知母須根樣品，樣品來源于知母主產(chǎn)區(qū)安徽亳州，河北安國、易縣，并在相同的條件下處理，取知母須根藥材粉末(60目)，采用上述條件及方法對樣品中新芒果苷、芒果苷及異芒果苷進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表2。

表2 不同產(chǎn)地知母須根中3種酮類成分含量測定

表2 不同產(chǎn)地知母須根中3種酮類成分含量測定

編號 產(chǎn)地樣品水分/%新芒果苷/%芒果苷/%異芒果苷/%S?1亳州十九里鎮(zhèn)馬寨村6．241．841．530．56S?2亳州十九里鎮(zhèn)陳小廟村7．831．801．280．39S?3亳州十九里鎮(zhèn)馬小樓村7．341．430．990．43S?4亳州十九里鎮(zhèn)沈營村7．491．911．000．42S?5亳州十九里鎮(zhèn)柳莊7．431．751．080．47S?6亳州十九里鎮(zhèn)高莊村8．071．671．380．47S?7亳州十九里鎮(zhèn)權(quán)莊7．661．361．230．40S?8安國焦莊8．571．561．500．60S?9安國樊莊7．691．561．190．46S?10易縣西陵鎮(zhèn)太平峪村8．371．711．550．65S?11易縣西陵鎮(zhèn)三尖峪村9．451．261．410．58

3 討論

由上述結(jié)果可知，不同產(chǎn)地知母須根中新芒果苷的含量為1.2%～1.9%，芒果苷的含量為1.0%～1.6%，異芒果苷的含量為0.4%～0.6%。3種酮苷的平均含量大小依次為新芒果苷、芒果苷、異芒果苷。其中河北產(chǎn)的知母須根中芒果苷及異芒果苷含量平均值高于亳州地區(qū)，而新芒果苷的含量低于亳州地區(qū)，可能是知母的不同生長環(huán)境所致。

不同產(chǎn)地知母須根中芒果苷的含量均達(dá)到藥典對知母主根的要求(0.7%)，說明知母須根中也含有豐富的酮類等有效成分，具有一定的綜合開發(fā)利用價值。本研究可為提高知母資源的綜合利用率提供依據(jù)。

實驗考察了不同供試品處理方法、不同流動相及不同檢測波長對實驗結(jié)果的影響，最終確定以50%甲醇為溶劑，超聲提取30 min，以乙腈-0.4%冰醋酸水溶液梯度洗脫，在258 nm條件下進(jìn)行測定，形成較為穩(wěn)定的含量測定方法，為知母須根的質(zhì)量評價提供參考。

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