張程程，季 青，楊 越，欽敬茹，謝 瑜，王中奇△

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院(上海 200032)，2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院(上海 201203)

肺癌是最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]，骨轉(zhuǎn)移是肺癌常見的轉(zhuǎn)移部位，約30%～40%的進展期肺癌出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移[2]，其發(fā)生發(fā)展與溶骨性骨質(zhì)破壞有關(guān)。中醫(yī)認為，肺腎兩虛,絡(luò)脈痹阻是肺癌骨轉(zhuǎn)移的主要病機[3]。益氣養(yǎng)精,通絡(luò)解毒的肺巖寧方在臨床抗骨轉(zhuǎn)移治療中取得了較好療效[4]，其作用機制可能與RANK/RANKL途徑有關(guān)。本文采用人肺腺癌A549細胞懸液骨髓腔注射建立肺癌骨轉(zhuǎn)移模型，檢測肺巖寧方干預(yù)治療對肺癌骨轉(zhuǎn)移過程中骨破壞情況及骨組織TRAP陽性細胞的表達情況，探討肺癌骨轉(zhuǎn)移過程中RANK/RANKL途徑與溶骨性骨質(zhì)破壞的關(guān)系。

材料與方法

1 動物和瘤株 BALB/c裸鼠40只，雌性，6周齡，體重(20±2) g，SPF級，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，動物許可證號為：SYXK(滬) 2014-0008。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物房，室溫(25±2)℃，自由攝食和飲水；人肺腺癌A549細胞株，購自中科院上海細胞庫。

2 實驗藥物 肺巖寧方組成：生黃芪、仙靈脾、黃精、靈芝各30 g，女貞子、七葉一枝花、山萸肉各15 g，白術(shù)、蜂房、干蟾皮各9 g，以上藥物均由龍華醫(yī)院中藥房提供。水煎濃縮至生藥含量為2.0 g/ml，4℃保存?zhèn)溆?；唑來膦酸注射液? mg/支，國藥準(zhǔn)字H20041346，正大天晴藥業(yè)。

3 試劑及耗材 雙抗、胎牛血清，美國GIBCO公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；戊巴比妥鈉，美國Sigma公司；TRAP染色液，南京森貝伽生物科技有限公司；蘇木素染液、中性樹膠，南京建成有限公司；二甲苯、切片石蠟，4%多聚甲醛，國藥集團化學(xué)試劑有限公司； Leica一次性刀片，德國Leica公司。

4 實驗儀器 CO2培養(yǎng)箱，臺式低速離心機，美國Thermo 公司；熒光倒置顯微鏡，日本OLMYPUS 公司；垂直流超凈工作臺，新加坡ESCO公司；高通量組織研磨儀，上海必橫生物有限公司；石蠟切片機，湖北徠克醫(yī)療儀器有限公司；攤片烤片機、石蠟包埋機，金華市益迪醫(yī)療器械有限公司；微量X射線斷層掃描儀(Micro-CT)，上海鈺森生物技術(shù)有限公司。

5 實驗方法

5.1 A549細胞株培養(yǎng)：人肺腺癌A549細胞株，將其培養(yǎng)于含10%胎牛血清及青霉素、鏈霉素各100 μg/ml的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境條件下連續(xù)培養(yǎng)，按1∶3比例傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的A549細胞，經(jīng)消化并計數(shù)細胞數(shù)目后，用無血清1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至1×108個/ml。

5.2 肺癌骨轉(zhuǎn)移動物模型構(gòu)建：參照趙凌燕等[5]造模方法，腹腔注射濃度為1%的戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉小鼠后，將小鼠右腿膝關(guān)節(jié)彎曲成90度角，手術(shù)刀片切開右側(cè)脛骨上部的皮膚和肌肉，行膝內(nèi)側(cè)縱切口約4 mm，顯露脛骨上端；于脛骨結(jié)節(jié)內(nèi)上方用26G針頭穿刺，延脛骨髓腔縱軸進針約3～4 mm，遇到阻力后即停止進針，改用依次吸有2 μl明膠海綿、1 μl空氣和10 μl上述1×108個/ml濃度腫瘤細胞懸液的25 μl微量注射器注入脛骨骨髓腔內(nèi)并縫合皮膚，上述過程于1 h內(nèi)完成。

5.3 動物分組及給藥：小鼠按體重分層隨機分成模型組，唑來膦酸組，肺巖寧組，每組10只?？瞻捉M10只，不予造模，其余各組均以前述造模方法予以造模。造模當(dāng)天開始給藥，給藥劑量按人鼠體表面積折算法計算[6]?？瞻捉M及模型組給予生理鹽水灌胃(15 ml/kg)，1次/d，連續(xù)灌胃28 d；唑來膦酸組于造模后每5日1次尾靜脈注射濃度為0.1 g/ml的唑來膦酸(0.6 mg/kg)，共5次；肺巖寧組予濃度為2 g/ml的肺巖寧方灌胃(15 ml/kg)，1次/d，連續(xù)灌胃28 d。

6 觀察指標(biāo)和檢測方法

6.1 小鼠體重和生存狀態(tài)：造模及用藥前后，每7 d觀察記錄小鼠體重及生存狀態(tài)。

6.2 小鼠骨組織Mirco-CT表現(xiàn)：治療結(jié)束后，分別取各組小鼠右側(cè)脛骨及少許軟組織，用4%多聚甲醛液固定，采用Mirco-CT骨骼二維平面掃描及三維重建，對掃描好的樣品中局部骨密度(BMD)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨表面體積比(BS/BV)等數(shù)據(jù)進行分析。

6.3 蘇木素-伊紅(Hematoxylin and eosin，HE)染色：治療結(jié)束后，取各組小鼠右側(cè)脛骨及少許軟組織，先用4%多聚甲醛液固定48 h后，清水浸泡，流水洗凈，在4 ℃條件下浸入10%EDTA脫鈣液中脫鈣2周，常規(guī)石蠟包埋，取包埋后的小鼠右脛骨組織，進行H&E染色,顯微鏡下選取合適視野，觀察骨組織形態(tài)。

6.4 抗酒石酸的酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色：治療結(jié)束后，取經(jīng)固定、清洗、脫鈣、常規(guī)石蠟包埋后的小鼠右脛骨組織，進行TRAP染色，計算TRAP(+)細胞數(shù)及體積，觀察和鑒定生成的破骨細胞。

結(jié) 果

1 肺巖寧方對小鼠體重及生存狀態(tài)的影響 造模后，與空白組小鼠相比，其余各組小鼠體重均有不同程度的降低，模型組下降較為明顯(P<0.05)，唑來膦酸組、肺巖寧組體重下降程度明顯減輕，但唑來膦酸組、肺巖寧組小鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1；第2周時，除空白組外各組小鼠均出現(xiàn)活動度下降；第3周時，唑來膦酸組、肺巖寧組小鼠活動度較前下降明顯，但仍高于模型組；第4周時，模型組小鼠出現(xiàn)明顯跛行及惡病質(zhì)，而唑來膦酸組、肺巖寧組小鼠僅見輕微跛行。

2 各組小鼠脛骨Mirco-CT掃描平面表現(xiàn) 模型組存在明顯的骨質(zhì)破壞，骨皮質(zhì)模糊、變薄，在脛骨平臺尤為明顯，部分骨小梁消失，呈蟲蝕樣表現(xiàn),與臨床上肺癌骨轉(zhuǎn)移的表現(xiàn)是一致的；唑來膦酸組可見骨皮質(zhì)輕度破壞，脛骨上端穿鑿狀小斑點破壞區(qū)，骨小梁厚度減少，平臺輕微破壞塌陷；肺巖寧組骨破壞程度明顯減輕，原有骨組織結(jié)構(gòu)基本保持，僅在局部有少量的骨質(zhì)破壞，見圖2。

3 各組小鼠脛骨Mirco-CT掃描3D重建表現(xiàn) 空白組小鼠骨密度正常，骨小梁走向一致，粗細均勻，形狀規(guī)則，排列密集，有一定的厚度；模型組小鼠的骨質(zhì)特征為骨密度降低，骨量丟失，骨小梁結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，骨強度下降，表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松樣改變；唑來膦酸組及肺巖寧組較模型組相比，骨密度增高，骨小梁間距變小，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)保留，排列相對規(guī)則，見圖3。

圖1 肺巖寧對各組小鼠體重的影響 圖2 小鼠右側(cè)脛骨Micro-CT平面結(jié)果

圖3 小鼠脛骨端Micro-CT 3D重建圖像

4 各組小鼠脛骨Mirco-CT掃描數(shù)據(jù)分析 與空白組相比，模型組小鼠骨密度(BMD)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)均降低，骨表面體積比(BS/BV)增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，唑來膦酸組及肺巖寧組小鼠骨密度、骨小梁厚度、骨體積分?jǐn)?shù)升高(P<0.05)，骨表面體積比下降(P<0.01)，但唑來膦酸組與肺巖寧組小鼠比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

5 各組小鼠骨組織HE染色結(jié)果 與空白組相比，模型組小鼠有明顯的骨腫瘤灶，腫瘤細胞密集，在腫瘤組織與骨組織交界面的位置可見多個“梭形”多核細胞，細胞體積巨大，胞漿顏色相對較深，多個藍染的胞核分布于胞漿內(nèi)；唑來膦酸組、肺巖寧組小鼠骨組織腫瘤細胞密度明顯降低，見圖5。

注：與空白組比較，# P<0.05；## P<0.01；與模型組比較，* P<0.05;** P<0.01

6 各組小鼠骨組織TRAP染色結(jié)果 模型組TRAP(+)細胞數(shù)及體積顯著高于空白組，且生成體積巨大的多核破骨細胞(TRAP陽性多核細胞為破骨細胞)；唑來膦酸組及肺巖寧組TRAP(+)細胞數(shù)及體積顯著低于模型組，且未見多核破骨細胞形成，見圖6。

注：A為空白組；B為模型組；C為唑來膦酸組；D、E為肺巖寧組

注：A為空白組；B為模型組；C為唑來膦酸組；D、E為肺巖寧組

討 論

肺癌骨轉(zhuǎn)移是目前臨床治療的難點之一，骨轉(zhuǎn)移的類型包括溶骨性、成骨性和混合性骨轉(zhuǎn)移，大多數(shù)表現(xiàn)為溶骨性骨轉(zhuǎn)移[7]。80%骨轉(zhuǎn)移患者以骨質(zhì)破壞引起的疼痛為首發(fā)癥狀[8]。腫瘤細胞實現(xiàn)局部骨吸收，是通過刺激破骨細胞活化實現(xiàn)的[9]。在溶骨性骨破壞過程中，NF-κB受體激活劑(RANK)/RANK配體(RANKL)的調(diào)節(jié)起主要作用,RANKL綁定其特異性受體RANK之后可以促進破骨細胞前體成熟，形成破骨細胞，發(fā)揮骨質(zhì)溶解作用[10]。分化成熟的破骨細胞形態(tài)上表現(xiàn)為多核聚集，并且分泌TRAP。因此破骨細胞的成熟由骨微環(huán)境中的RANK和RANKL調(diào)節(jié)，決定著局部骨溶解的平衡，RANKL過多可增加骨吸收，RANKL減少則抑制骨吸收。

中醫(yī)藥在治療肺癌骨轉(zhuǎn)移方面有一定的作用，中醫(yī)學(xué)認為肺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生是多種因素作用的結(jié)果，內(nèi)因臟腑虧損，腎氣不足，筋骨失養(yǎng)，脈絡(luò)不暢，外因癌毒聚結(jié)、痰凝瘀阻筋骨，腐蝕骨骼，聚結(jié)成瘤。因此治療應(yīng)補腎養(yǎng)精，解毒散結(jié)通絡(luò)[11]。肺巖寧方為來源于臨床的經(jīng)驗方藥，以補腎抗癌為基本原則，有研究表明補腎抗癌的中藥能夠抑制骨轉(zhuǎn)移灶生長，緩解患者骨性疼痛，改善患者骨轉(zhuǎn)移相關(guān)癥狀[12]；基礎(chǔ)研究也顯示肺巖寧方具有減少腫瘤微環(huán)境血管新生，抑制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用[13]。

本實驗研究也提示肺巖寧方對改善肺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠體重及生存狀態(tài)有一定作用，本研究通過骨組織HE染色和micro-CT攝片分析，檢測各組小鼠骨質(zhì)破壞程度，發(fā)現(xiàn)模型組腫瘤細胞活性強，骨組織破壞嚴(yán)重；而唑來膦酸組、肺巖寧組腫瘤細胞活性較低，骨組織破壞程度亦相應(yīng)較輕。且唑來膦酸組和肺巖寧組骨組織破壞程度基本一致，提示唑來膦酸與肺巖寧方均有抗肺癌骨轉(zhuǎn)移及減輕骨質(zhì)破壞作用，其作用機制可能是通過抑制腫瘤細胞增殖，從而抑制溶骨性骨吸收實現(xiàn)的。

此外，骨組織TRAP染色發(fā)現(xiàn)，唑來膦酸組、肺巖寧組小鼠骨腫瘤的TRAP(+)細胞數(shù)均顯著降低，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，TRAP染色提示中藥復(fù)方肺巖寧方有抑制RANKL表達，減少TRAP分泌的作用，通過由骨微環(huán)境中的RANKL調(diào)節(jié)破骨細胞的成熟，促進局部骨溶解的平衡。

綜上所述，RANK-RANKL途徑是肺癌骨轉(zhuǎn)移過程中介導(dǎo)溶骨性骨質(zhì)破壞的重要環(huán)節(jié)。因此，我們推論，肺巖寧方可能通過調(diào)控RANK/RANKL信號的表達抑制肺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展，進一步研究肺巖寧與抑制破骨細胞生成及溶骨性骨破壞的關(guān)系，有望為臨床防治肺癌骨轉(zhuǎn)移提供新的治療思路及靶點。

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