胡文斌，張少飛，孫 娜

(隴南師范高等?？茖W(xué)校，甘肅 成縣 742500)

葡萄(Vitisvinifera)是葡萄科(Vitacvae )葡萄屬(Vitis)多年生木質(zhì)藤本植物[1]，品種多、營養(yǎng)豐富，廣泛用于鮮食、釀酒或制葡萄干、罐頭等食品，在全國各地廣泛栽培。目前，葡萄主要采用扦插的方式進(jìn)行繁殖，但長期依此繁殖容易導(dǎo)致品種退化，尤其是在南方地區(qū)，氣候濕潤，容易感染病蟲，且需大量扦插材料[2-3]。植物織培養(yǎng)[4]是將植物體的組織、器宮、細(xì)胞，在人工條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使其生長、分化發(fā)育成一完整的植物的過程，可以有效保持親本的優(yōu)良性狀，是目前快繁育苗，防止苗木退化的主要方法之一。近年來，關(guān)于葡萄組織培養(yǎng)的研究已日趨成熟，賓宇波等[5]通過比較不同消毒方法、生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度配比、生根培養(yǎng)基類型,建立了百花山葡萄組織培養(yǎng)快繁體系。徐美隆等[6]以釀酒葡萄“赤霞珠”為材料,研究了不同基本培養(yǎng)基與不同IBA濃度的組合及不同培養(yǎng)容器對試管苗生長的影響,優(yōu)化了試管苗培養(yǎng)體系。

紅提葡萄又名紅提子、紅地球等,是鮮食葡萄中最珍貴和最具有商業(yè)價值的品種之一[7]。截至目前，紅提葡萄組織培養(yǎng)研究報道不多，且研究方法各異，未形成一套完整的能夠工廠化育苗的體系，本試驗(yàn)選擇隴南市本地最為常見的紅提葡萄莖段為供試材料，從紅提葡萄組織培養(yǎng)的外植體選擇、初代培養(yǎng)、繼代壯苗、莖葉分化、生根移栽等過程，對葡萄組培苗的誘導(dǎo)繁育進(jìn)行研究，為隴南本地葡萄組培苗快速繁殖和大規(guī)模工廠化育苗體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究材料 紅提葡萄 (采自隴南師專農(nóng)林技術(shù)學(xué)院智能溫室)。取當(dāng)年生嫩枝，用單芽莖段作實(shí)驗(yàn)材料。

1.1.2 儀器試劑 主要儀器有：超凈工作臺、滅菌鍋、光照培養(yǎng)箱及培養(yǎng)架等。試劑有6-卞氨基嘌呤(6-BA)，吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 各培養(yǎng)階段，根據(jù)外植體生長狀況，在改良DKW培養(yǎng)基中附加6-BA、IAA、IBA和NAA等植物生長調(diào)節(jié)劑?；九囵B(yǎng)基為:改良DKW+蔗糖30 g·L-1+瓊脂8 g·L-1，用0.1 mol·L-1的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至5.8～6.0，分裝于250 ml三角瓶中，每瓶20～35 ml，用封口膜封好，在高壓鍋內(nèi)滅菌，生長調(diào)節(jié)劑均在高壓滅菌前加入。高壓滅菌條件為：壓力1.1 kg·cm-2，121℃保持20 min。

1.2.2 材料消毒和接種 采集當(dāng)年生葡萄嫩莖，剪掉葉子，在洗潔精下用軟毛刷刷洗后，流水沖洗過夜。將材料置于超凈工作臺上，剪成長3～4 cm的單芽莖段，用75%乙醇消毒60 s，然后用無菌水沖洗2～3次。取出材料后用0.1%氯化汞溶液消毒，試驗(yàn)設(shè)3個處理，氯化汞消毒時間分別為6 min、8 min和10 min，滅菌結(jié)束后再用無菌水反復(fù)沖洗5次。在無菌條件下切去下部褐化的傷口，晾干材料表面水分后將其正插于培養(yǎng)基上，每瓶接種1個莖段，每處理組接種20瓶。培養(yǎng)室保持恒溫(26±1)℃，相對濕度為50%～60%，以熒光燈為光源進(jìn)行光照處理(光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，每日光照16 h)[8]，14 d后，統(tǒng)計(jì)接種材料的污染率和成活率，確定氯化汞消毒的最佳時間。

1.2.3 初代培養(yǎng) 分別以MS、改良DKW為基本培養(yǎng)基，附加6-BA0.2 mg·L-1+IAA0.2 mg·L-1，統(tǒng)計(jì)其萌發(fā)率，以確定基本培養(yǎng)基。以篩選出的培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g·L-1+瓊脂8 g·L-1，pH值5.8～6.0，附加不同濃度的6-BA和IAA，將單芽莖段接種于培養(yǎng)基，研究激素配比對葡萄萌芽的影響。試驗(yàn)設(shè)附加6-BA0.1 mg·L-1+IAA0.1 mg·L-1、6-BA0.1 mg·L-1+IAA0.2 mg·L-1、6-BA0.1 mg·L-1+IAA0.5 mg·L-1、6-BA0.2 mg·L-1+IAA0.1 mg·L-1、6-BA0.2 mg·L-1+IAA0.2 mg·L-1、6-BA0.2 mg·L-1+IAA0.5 mg·L-1g共6個處理，3次重復(fù)。接種14 d后，觀察芽的分化、增殖與生長情況，確定初代培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑最佳添加量。

1.2.4 繼代培養(yǎng) 待初代培養(yǎng)萌發(fā)的腋芽生長至2 cm左右，在無菌環(huán)境中將其小心取下，接種于篩選出的生長狀態(tài)最好的初代培養(yǎng)基中，對其進(jìn)行壯苗增殖培養(yǎng)。

1.2.5 生根培養(yǎng) 繼代培養(yǎng)無菌芽苗生長至5 cm左右時，接種于不同生長素的1/2改良DKW培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度(25±1)℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照14 h·d-1[9]。

1.2.6 組培苗煉苗及馴化移栽 當(dāng)組培苗根生長到5 cm左右長、植株長至10 cm左右時,將瓶塞去掉，置于溫室內(nèi)煉苗,3 d后將組培苗取出,用流水沖洗掉根部瓊脂,植于溫室苗床進(jìn)行沙培煉苗,使組培苗逐漸適應(yīng)溫室環(huán)境,同時注意保濕,以防組培苗萎蔫[10]。待組培苗成活，并且長出1～2片新葉時,移入營養(yǎng)缽進(jìn)行培養(yǎng)，營養(yǎng)土為蛭石∶土=1∶2 ,組培苗長出3～5片新葉時方可下田移栽[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體最佳消毒時間的確定

外植體成活率以消毒8 min處理最高，為80%，且均顯著高于其他處理(表1),10 min處理組雖然污染率為0%，但是由于消毒時間過長，外植體遭受破壞，導(dǎo)致成活率下降。表明外植體氯化汞最佳消毒時間為8 min。因此，葡萄外植體的消毒方法采用75%乙醇消毒60 s、0.1%氯化汞消毒8 min。

表1 不同氯化汞消毒時間下的外植體污染率和成活率

2.2 初代培養(yǎng)

2.2.1 基本培養(yǎng)基的確定 基本培養(yǎng)基種類對葡萄腋芽萌發(fā)有較大影響(表2)。其中，MS培養(yǎng)基處理，愈傷組織較多，萌芽率較低，外植體萌芽率為55%；改良DKW培養(yǎng)基處理，萌芽率較高，外植體的萌芽率達(dá)到了75%，是MS培養(yǎng)基處理的1.37倍。表明基本培養(yǎng)基為改良DKW培養(yǎng)基時，葡萄發(fā)芽效果較好。因此，確定基本培養(yǎng)基種類為改良DKW培養(yǎng)基，以后進(jìn)一步試驗(yàn)將在改良DKW培養(yǎng)基中進(jìn)行。

表2 不同培養(yǎng)基種類的莖段萌芽狀況

2.2.2 激素附加濃度的確定 培養(yǎng)基附加不同的激素濃度，經(jīng)過20 d的培養(yǎng)，外植體生長狀態(tài)良好(圖版A)，研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基附加激素濃度不同，萌芽率也不同，外植體以附加6-BA0.2 mg·L-1+IAA0.2 mg·L-1萌芽率最高，達(dá)到80%(表3)。表明附加6-BA0.2 mg·L-1+IAA0.2 mg·L-1對葡萄萌芽效果最好。綜上分析確定，最佳初代培養(yǎng)基為改良DKW培養(yǎng)基+6-BA0.2 mg·L-1+IAA0.2 mg·L-1。

表3 不同激素配比的葡萄外植體萌芽狀況

2.3 繼代培養(yǎng)

待初代培養(yǎng)萌發(fā)的腋芽生長至2 cm左右時，將其在無菌環(huán)境中用剪刀小心取下，接種于改良DKW培養(yǎng)基+6-BA0.2 mg·L-1+IAA0.2 mg·L-1中，對其進(jìn)行壯苗增殖培養(yǎng)，經(jīng)過28 d培養(yǎng)，無菌芽苗生長良好(圖版B)。

2.4 生根培養(yǎng)

以1/2改良DKW為基本培養(yǎng)基,附加IBA(0.5、1.0 mg·L-1)和NAA(0.5、1.0 mg·L-1), 分A、B、C、D等4組培養(yǎng)基,每組20瓶,共80瓶[7]。將無菌芽苗接種在上述培養(yǎng)基中,進(jìn)行不定根誘導(dǎo)，接種28 d后統(tǒng)計(jì)生根情況(表4)。

分析表4可知，A處理組根系生長狀態(tài)最好(圖版C)，生根數(shù)量和平均根長均高于其他處理組。因此，當(dāng)IBA和NAA濃度均為0.5 mg·L-1時，根系生長狀態(tài)最好，今后實(shí)驗(yàn)可以在IBA和NAA濃度為0.5 mg·L-1左右進(jìn)行調(diào)整，以確定最佳生根培養(yǎng)配比。

表4 不同濃度配比IBA和NAA誘導(dǎo)不定根的效果

2.5 組培苗煉苗及馴化移栽

分析圖版D和表5可知，在沙培煉苗過程中，組培苗大量死亡，成活率極低，可能由于組培苗不適應(yīng)苗床環(huán)境而引起了大量的死亡;在由苗床向營養(yǎng)缽移栽過程中也出現(xiàn)了幼苗死亡，可能是由于組培苗不適應(yīng)營養(yǎng)缽環(huán)境，同時在轉(zhuǎn)移過程中損傷了幼苗的根部，引起了組培苗的不適應(yīng)。A處理組成活率最高(33.3%)，可能是因?yàn)锳處理組生長狀態(tài)好于其他組，平均根長高于其他組的緣故。因此，仍需要不斷的實(shí)驗(yàn)探索，進(jìn)一步改善培養(yǎng)條件，以提高移栽成活率。

表5 各處理組煉苗及移栽情況

圖版說明：A:初代培養(yǎng)莖段萌發(fā)；B:繼代培養(yǎng)試管苗增殖；C：生根培養(yǎng)；D：移栽成活

3 結(jié)論與討論

本紅提葡萄莖段組織培養(yǎng)研究結(jié)論為：(1)用75%乙醇60 s，0.1%氯化汞消毒8 min為最佳消毒時間；(2)本次實(shí)驗(yàn)選擇改良DKW為基本培養(yǎng)基，最佳初代培養(yǎng)基配比為：改良DKW培養(yǎng)基+6-BA0.2 mg·L-1+IAA0.2 mg·L-1，同時在用改良DKW培養(yǎng)基+6-BA0.2 mg·L-1+IAA 0. 2 mg·L-1對無菌芽苗進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，無菌芽苗生長狀況良好；(3)獲得最佳生根培養(yǎng)基的配比為1/2改良DKW+IBA0.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1，在此培養(yǎng)條件下，組培苗根系生長良好；(4)沙培煉苗過程中組培苗大量死亡，最高成活率為33.3%，可能是由于組培苗不適應(yīng)苗床環(huán)境，同時組培苗由苗床向營養(yǎng)缽移栽過程中也出現(xiàn)了幼苗的死亡，這可能是因?yàn)榻M培苗對營養(yǎng)缽環(huán)境的不適應(yīng)，且幼苗根部或受到了一定的損傷。

目前，在葡萄組織培養(yǎng)過程中，有利用葉片、莖尖、花藥等為材料誘導(dǎo)形成愈傷組織并獲得組培苗的相關(guān)報道[10]，但是目前普遍采用的仍然是利用單芽莖段進(jìn)行組織培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成無菌芽苗，進(jìn)而獲得組培苗。煉苗及馴化移栽是葡萄組培苗能否應(yīng)用到大田生產(chǎn)的“瓶頸”，煉苗時要待葉片從瓶口長出，莖稈由綠色轉(zhuǎn)為紅色后方可進(jìn)行沙培煉苗[5]。本研究選用當(dāng)?shù)刈顬槌Ｒ姷募t提葡萄進(jìn)行組織培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)過程基本順利，由于地理、環(huán)境、氣候的差異，在煉苗及馴化移栽過程中成活率并不高，以后在實(shí)驗(yàn)過程中可適當(dāng)延長開瓶煉苗時間，同時在沙培煉苗過程中注意保濕、控溫、遮陽等，不斷探索煉苗及馴化移栽的條件，以提高移栽成活率。因此，今后仍需進(jìn)一步研究探索，才能逐漸完善紅提葡萄組培體系。

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