班騫，謝彩云，范國華，黃琳凱，張新全*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，貴州 貴陽 550006；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，四川 成都611130)

物種種質(zhì)資源及其遺傳多樣性是遺傳改良和新品種育種的基礎(chǔ)[1]，而保證品種身份真實可有效遏制我國種業(yè)市場上套牌、冒牌、派生品種等惡性現(xiàn)象，同時為保障農(nóng)民權(quán)益提供了有力依據(jù)。隨著DNA分子標記技術(shù)的快速發(fā)展，其研究領(lǐng)域已涉及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建[2]、功能基因表達[3]、親緣關(guān)系分析[4]、指紋圖譜構(gòu)建[5]等多個方面，目前應(yīng)用DNA指紋標記鑒定植物品種[6]已成為一項快捷、準確的有效技術(shù)。

簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats, SSR)，具有重復(fù)性好、共顯性、多態(tài)豐富等優(yōu)點[7]，近年來ESTs發(fā)展迅速，已有不少研究利用EST-SSR構(gòu)建蘆筍[8](Asparagusofficinalis)、白菜[9](Brassicarapa)、紫花苜蓿[10](Medicagosativa)等品種DNA指紋圖譜；而SRAP標記主要針對基因閱讀框區(qū)域(ORFs)，即對物種特異擴增內(nèi)含子和啟動子區(qū)域進行特異擴增，常用于種質(zhì)資源評價、重要性狀標記、基因定位、指紋圖譜構(gòu)建等研究領(lǐng)域[11]，已有不少報道利用此標記技術(shù)在菜薹[12](Brassicacampestris)、 國蘭[13](Orchidaceaecymbidium)、假儉草[14](Eremochloaophiuroides)等品種上構(gòu)建DNA指紋圖譜，可關(guān)于苦荬菜品種DNA指紋圖譜的構(gòu)建尚未見到報道。

苦荬菜(Ixerispolycephala)屬一年生菊科青飼牧草，異花授粉植物，是穩(wěn)定的二倍體物種。因其適口性好，草質(zhì)鮮嫩常被用于家禽飼喂，在我國具有一定的市場潛力。截至目前，我國審定苦荬菜品種僅為3個，且國內(nèi)市場以次充優(yōu)，品種混亂，為解決目前現(xiàn)狀，本研究首次利用EST-SSR和SRAP標記對14個苦荬菜品種(系)進行指紋圖譜構(gòu)建，研究結(jié)果可為苦荬菜品種快速區(qū)分、鑒定和知識產(chǎn)權(quán)保護的貢獻依據(jù)，對重要性狀基因挖掘提供參考資料，同時為逐步完善我國苦荬菜種質(zhì)資源DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試14個苦荬菜品種(系)來源如表1所示，CF編號材料由國家草種質(zhì)資源基因庫提供，其余由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草學(xué)系牧草育種課題組、黑龍江畜牧所提供。2015年7月，種子經(jīng)4 ℃低溫處理，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)芽，溫室盆栽后取幼嫩葉片。

1.2 樣品DNA的提取

每份材料選取30個單株混合，選取苦荬菜材料的健康幼嫩新鮮葉片，用蒸餾水沖洗干凈后烘干葉片，剪碎后裝入2 mL離心管內(nèi)，把離心管放入液氮中浸泡5～10 min，離心管加入鋼珠置于高通量組織研磨器內(nèi)進行研磨，頻率50 Hz，時間60 s。研磨成粉狀后，使用植物基因組提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取基因組DNA。采用瓊脂糖電泳檢測DNA的純度。瓊脂糖電泳檢測：將DNA樣品和已知濃度的標準梯度DNA作為對照，在0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)對比樣品和對照的亮度估算樣品DNA的濃度。將DNA樣品稀釋至10 ng·μL-1，4 ℃保存。

1.3 SSR-PCR引物篩選和擴增

所用引物參考近緣種菊苣EST-SSR引物序列信息[15]，選取152對引物進行篩選，最終獲得24對條帶清晰且多態(tài)性好的引物。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成(表2)。

EST-SSR PCR 反應(yīng)體系為15 μL，包括1 μL(10 ng·μL-1)DNA，上下引物各1 μL (10 pmol·μL-1)，0.3 μL (2.5 U·μL-1)Taq DNA 聚合酶，Mix混合液7.5 μL，4.1 μL ddH2O。PCR所用Mix混合液(含有10×PCR buffer、Mg2+、dNTPs)，Taq酶和50 bp DNA ladder Marker均購自天根科技生化公司。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，56～64 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用銀染顯色后拍照。

表1 供試苦荬菜品種(系)DNA指紋圖譜材料信息 Table 1 Information of Ixeris polycephala varieties (lines) for DNA fingerprint

表2 苦荬菜EST-SSR標記引物序列Table 2 EST-SSR markers primer sequences for I. polycephala varieties (lines)

1.4 SRAP-PCR引物篩選和擴增

參考文獻[16-17]中SRAP標記的上游引物和下游引物產(chǎn)生的引物組合，篩選供試材料，得到多態(tài)性好的引物進行后續(xù)擴增，SRAP引物及PCR Mix混合液(含有10×PCR buffer、Mg2+、dNTPs)，Taq酶均購于天根科技生化公司。SRAP-PCR擴增反應(yīng)體系總體積為15 μL，反應(yīng)最終濃度：包括1 μL(10 ng·μL-1)DNA，引物各0.8 μL (10 pmol·μL-1)，0.3 μL (2.5 U·μL-1)Taq DNA 聚合酶，Mix混合液7.5 μL，4.6 μL ddH2O。PCR擴增反應(yīng)在Biometra PCR儀上進行，擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃變性1 min，35 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，5個循環(huán)；94 ℃變性1 min，50 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，點樣6 μL，采用銀染顯色后拍照保存。緩沖體系為1×TBE，電壓200 V，時間約1.5 h。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每對引物重復(fù)試驗3次，依據(jù)擴增后的電泳結(jié)果，統(tǒng)計清晰可重復(fù)的擴增條帶，在相同遷移位點上，有帶記為1，無帶記為0，建立由0，1組成的原始數(shù)據(jù)矩陣。據(jù)表征矩陣，利用POPGENE 1.31[18]軟件計算I值和H值，并觀察等位基因數(shù)(Na)和有效等位基因數(shù)(Ne)等群體遺傳參數(shù)。PIC參考Nei[19]的方法計算，PIC=1-∑Pi2。其中，Pi為基因座位上第i等位基因的頻率。利用Gelpro Analysis軟件對凝膠電泳圖像進行擴增片段分子量的計算，參考陳昌文等[20]的方法構(gòu)建苦荬菜主栽品種(系)的DNA指紋編碼，利用Excel對0，1矩陣進行轉(zhuǎn)制，構(gòu)建與指紋編碼相對應(yīng)的苦荬菜品種(系)的DNA指紋圖譜標準模式圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 EST-SSR和SRAP標記多態(tài)性分析

篩選出24對ESR-SSR引物對部分苦荬菜品種(系)進行后續(xù)擴增(圖1)，由表3得知24對引物一共擴增270個條帶，多態(tài)性條帶223個，平均每對引物擴增出11.3個條帶，9.3個多態(tài)性條帶，PPB變幅為55.56%～100.00%，平均81.61%。PIC變幅為0.765～0.894，基因多樣性指數(shù)變幅為0.2464～0.4288，均值0.3382，Shannon指數(shù)變幅為0.3597～0.6148，均值0.4989，表明供試苦荬菜品種(系)遺傳變異較為豐富，EST-SSR引物可以適用于苦荬菜品種(系)相關(guān)遺傳研究和DNA指紋圖譜構(gòu)建。

篩選出的32對SRAP引物組合對14個苦荬菜品種(系)進行擴增(圖1)，由表4可知，SRAP標記共擴增出428個條帶，其中多態(tài)性條帶367個，平均每個引物組合擴增出13.4個條帶，11.5個多態(tài)性條帶，PPB變幅在54.54%～100.00%，均值84.42%，PIC均值0.826，基因多樣性指數(shù)變幅在0.2006～0.3898，均值0.2855，Shannon指數(shù)在0.3167～0.5716，均值0.4283，說明苦荬菜品種(系)存在豐富的遺傳變異，SRAP標記可以用于苦荬菜遺傳多樣性研究和DNA指紋圖譜構(gòu)建。

2.2 EST-SSR和SRAP標記核心引物分析

兩種標記對苦荬菜擴增出的多態(tài)性條帶有所不同，且能夠區(qū)分的苦荬菜品種數(shù)量也不同，24 對 EST-SSR引物中可以區(qū)分的苦荬菜品種數(shù)量為3～14個，平均7.7個(表3)，SRAP引物組合能夠區(qū)分的苦荬菜品種數(shù)量在2～12個，平均6.6個(表4)。EST-SSR引物IpSSR19能夠擴增出9條多態(tài)性條帶，引物IpSSR91能夠擴增出11條多態(tài)性條帶，均能一次性區(qū)分14個供試苦荬菜品種(系)，而引物IpSSR118僅能擴增出5條多態(tài)性條帶，可鑒定3個苦荬菜品種；SRAP引物組合Me9+Em17能夠擴增出14條多態(tài)性條帶，引物組合Me10+Em5能夠擴增出15條多態(tài)性條帶，最多可以區(qū)分12個供試苦荬菜品種(系)，而引物組合Me4+Em6能夠擴增出6條多態(tài)性條帶，可以鑒定2個苦荬菜品種；SRAP引物組合雖沒有單獨引物能夠一次性區(qū)分全部品種(系)，但通過不同的引物有效組合，可以提高對苦荬菜品種的甄別能力，而且運用兩種標記的不同引物組合，更能大幅度提高鑒別苦荬菜品種數(shù)量，這將對構(gòu)建準確、高效苦荬菜品種DNA指紋圖譜提供重要依據(jù)。

采用以上EST-SSR和SRAP引物對14個苦荬菜品種(系)進行分析，利用Gelpro Analysis軟件對凝膠電泳圖像擴增片段進行定位，并計算分子量大小，9個品種(系)在7個引物擴增條帶上具有特征譜帶(表5)，即只用1個特征引物就能與其他品種區(qū)分開。如引物IpSSR91和引物組合Me9+Em17均在品種‘Longmu’上具有特征譜帶(圖1，圖2)，其中，品種(系)‘Lvyuan’、‘Treasure’、‘CF6042’、‘川選1號’、‘L6-2’、‘CF023568’、‘CF023569’均有一個特征引物，品種(系)‘Longmu’和‘L5-4’具有兩個特征引物；此外Me9+Em17在‘L5-4’、‘川選 1 號’和‘CF023568’上同時具有特征譜帶(圖2)。表明EST-SSR和SRAP多態(tài)性引物能夠產(chǎn)生較多的特征譜帶，可以有效地應(yīng)用于構(gòu)建苦荬菜品種DNA指紋圖譜。

表3 EST-SSR引物擴增結(jié)果及多態(tài)性信息Table 3 Results and the polymorphism information of EST-SSR primers

TNB：Total number of amplified bands；NPB：The number of polymorphic bands；PPB：The percentage of polymorphic bands；PIC：Polymorphic information content；I：Shannon’s information index；H：Nei’s gene diversity；DV：Distinguished varieties；下同The same below.

圖1 EST-SSR對部分苦荬菜品種(系)擴增Fig.1 EST-SSR amplified of I. polycephala varieties (lines) a:引物IpSSR91擴增 “Longmu”、“川選1號”的特異帶Special band of Longmu and Chuanxuan No.1 varieties amplified with primer IpSSR91; b:引物IpSSR102擴增“Treasure”的特異帶Special band of Treasure variety amplified with primer IpSSR102.

圖2 引物組合Me9+Em17對苦荬菜品種(系)擴增結(jié)果Fig.2 Me9+Em17 primer amplified results of I. polycephala varieties (lines)

品種(系)Variety(Line)特征引物Specificprimer品種特征帶條帶大小Variety-specificbandsize(bp)品種(系)Variety(Line)特征引物Specificprimer品種特征帶條帶大小Variety-specificbandsize(bp)LvyuanIpSSR80172L5-4Me9+Em17844TreasureIpSSR102262Me11+Em5631CF6042IpSSR50198L6-2IpSSR80164LongmuIpSSR91294CF023568Me9+Em171220Me9+Em17321IpSSR91108川選1號ChuanxuanNo.1IpSSR91337CF023569IpSSR19155

2.3 構(gòu)建苦荬菜品種(系)DNA指紋圖譜

構(gòu)建指紋圖譜盡可能以較少數(shù)量的引物組合和高效的甄別方法為準則，最終可獲得能夠鑒別較多的品種數(shù)量。綜合考慮24對EST-SSR引物和32對SRAP引物的擴增條帶數(shù)、條帶統(tǒng)計難易程度、PIC值和鑒定品種時效性等多種因素，最終篩選出3個較為高效的EST-SSR引物和2個SRAP引物，分別為IpSSR80、IpSSR91、IpSSR102、Me9+Em17和Me10+Em5。借鑒陳昌文等[20]對中國主要桃品種ID身份指紋圖譜編碼構(gòu)建方法，對選擇的5個引物的多態(tài)性條帶進行1～9的整數(shù)賦值，根據(jù)Gelpro Analysis軟件估算出每個引物多態(tài)性條帶的分子量大小，從小到大依次賦值，最大賦值數(shù)為9，不同引物所選擇的多態(tài)性條帶不同，對于多態(tài)性條帶超過9的，只考慮其中更加高效的9條條帶對其編碼賦值(表6)。對最終確定的5個引物選擇了40個多肽條帶供于賦值，其中8個特征譜帶可直接用于鑒定當(dāng)中的某一品種。

表6 特征譜帶選擇和條帶賦值標準 Table 6 Specific bands selection and encoded standard for I. polycephala varieties (lines) (bp)

*引物特征譜帶Primer-specific band.

根據(jù)表6引物多態(tài)性條帶的賦值標準對參試苦荬菜品種(系)進行DNA指紋編碼(表7)，為真實高效地鑒別苦荬菜品種(系)，構(gòu)建的DNA指紋圖譜編碼數(shù)應(yīng)盡可能少，避免指紋數(shù)據(jù)過于繁雜，那么每對引物多態(tài)性條帶的選擇重復(fù)性好，甄別能力強的多態(tài)譜帶，引物排列順序按照擴增條帶分子量大小排列，即IpSSR102—IpSSR80—IpSSR91—Me10+Em5—Me9+Em17，其中IpSSR102提供一個多態(tài)譜帶，IpSSR80、IpSSR91、Me10+Em5、Me9+Em17均提供兩個多態(tài)性條帶，以‘川選1號’為例，表現(xiàn)在引物IpSSR102的248 bp，IpSSR80的145和280 bp，IpSSR91的260和337 bp，Me10+Em5的373和870 bp，Me9+Em17的484和677 bp出現(xiàn)了多態(tài)性譜帶(表6，表7，圖3)，能夠與其他品種(系)區(qū)分開。結(jié)果表明，在構(gòu)建苦荬川選1號: Chuanxuan No.1

表7 苦荬菜品種(系)的指紋數(shù)據(jù)庫編碼 Table 7 Fingerprint code of I. polycephala varieties (lines)

菜DNA指紋圖譜中，每個品種(系)最終確定指紋編碼數(shù)為9個，即1～9的整數(shù)賦值，每份苦荬菜品種(系)具有特異指紋編碼，便于快速直觀地區(qū)分不同品種。

圖3 苦荬菜新品系‘川選1號’指紋圖譜標準模式圖Fig.3 The DNA fingerprinting standard model pattern of I. polycephala new lines of ‘Chuanxuan No.1’

以DNA指紋數(shù)據(jù)庫(表7)構(gòu)建苦荬菜品種(系)指紋圖譜，圖4所示，橫坐標表示不同苦荬菜品種(系)，縱坐標表示引物擴增譜帶位點，黑色條帶代表在相應(yīng)引物擴增位點有譜帶出現(xiàn)，且每個苦荬菜品種(系)的指紋圖譜均與指紋數(shù)據(jù)庫編碼信息相對應(yīng)，詳見表6。每個苦荬菜品種(系)均有不同擴增帶，能夠快速鑒別其他品種(系)。

3 討論

EST-SSR標記是基于表達序列標簽開發(fā)的新型標記，利用已有的ESTs數(shù)據(jù)庫，篩選鑒別SSR，其序列來源于基因轉(zhuǎn)錄區(qū)[21]，其保守性好，在不同物種間通用性強，除去了SSR引物開發(fā)過程中的測序、克隆步驟。目前已有不少應(yīng)用EST-SSR分析不同物種遺傳多樣性[22]，構(gòu)建品種指紋圖譜[23]，比較作圖等[24]研究。本研究應(yīng)用24對EST-SSR多態(tài)性引物對收集的14份苦荬菜品種(系)一共擴增出270個清晰條帶，多態(tài)性條帶223個， PPB平均81.61%。PIC變幅為0.765～0.894，基因多樣性指數(shù)變幅為0.2464～0.4288，Shannon指數(shù)變幅為0.3597～0.6148，說明供試來源不同的苦荬菜品種(系)在遺傳背景中發(fā)生了基因水平的豐富變異，同時EST-SSR引物可以適用于苦荬菜品種(系)相關(guān)遺傳研究和DNA指紋圖譜構(gòu)建。

圖4 14份苦荬菜品種(系)指紋圖譜Fig.4 Fingerprinting diagram of 14 I. polycephala varieties (lines)

SRAP標記可以通過其獨特的引物設(shè)計，對植物基因組外顯子與內(nèi)含子之間的序列進行擴增，不同品種(系)之間的序列差異最終導(dǎo)致擴增片段有所差異[25]，從而產(chǎn)生多態(tài)性。近年來在作物上已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、多樣性研究、種子真實性鑒定等多個方面。本研究從209個引物組合種篩選出32對SRAP引物，對14份苦荬菜品種(系)進行擴增，其中多態(tài)性條帶367個，PPB變幅為54.54%～100.00%，PIC均值0.826，基因多樣性指數(shù)變幅為0.2006～0.3898，Shannon指數(shù)為0.3167～0.5716，表明了SRAP標記在苦荬菜品種(系)鑒別能力上有著較大的應(yīng)用潛力，存在豐富的遺傳變異，SRAP標記可以適用于DNA指紋圖譜構(gòu)建，獲得的基因位點很大可能是某部分相關(guān)性狀的功能基因，這將為以后的功能基因組學(xué)研究及分子輔助育種提供技術(shù)支撐。

現(xiàn)在我國草牧業(yè)快速發(fā)展，家禽養(yǎng)殖業(yè)對苦荬菜的需求量日益增多，但目前國內(nèi)苦荬菜品種資源相對較少，加之市場管理極其混亂，許多產(chǎn)品之間互相摻雜，嚴重限制了苦荬菜的生產(chǎn)利用，極大程度上地損害了消費者的權(quán)益，嚴重妨礙我國十三五規(guī)劃的優(yōu)質(zhì)牧草推廣應(yīng)用。因此快速地鑒定苦荬菜品種資源顯得相當(dāng)重要，傳統(tǒng)的植物學(xué)表型鑒定受地理環(huán)境影響和人為觀測所帶來的誤差較大，相較于DNA水平上的變異不易受環(huán)境和人為的干擾，而開展DNA指紋標記技術(shù)日漸成為目前鑒定植物品種的主流方法，目前構(gòu)建植物品種指紋圖譜的主要方法有特征譜帶法[26]、單引物法[27]和引物組合法[28-29]。本研究采用3個EST-SSR引物和兩個SRAP引物有效組合鑒別14個苦荬菜品種(系)，結(jié)果顯示所有品種(系)能夠完全區(qū)分，每個品種(系)有一套與指紋圖譜上相對應(yīng)的指紋編碼，可以視作其分子水平上的ID身份證，其ID編碼差異較小的品種(系)，遺傳背景也比較相近，反之亦然，如品種‘Prado’和‘Treasure’指紋編碼分別是345342646和356243547，兩個品種在遺傳差異上有一定相似性，可見，構(gòu)建苦荬菜品種(系)指紋數(shù)據(jù)庫可為苦荬菜選育提供重要依據(jù)。

DNA指紋編碼相關(guān)研究中有著不同的報道，劉紅艷等[30]直接采用特征譜帶0,1矩陣建立區(qū)域試驗新品系指紋圖譜數(shù)據(jù)庫編碼，結(jié)果生成的指紋編碼過于繁多，不能直觀地快速區(qū)分品種，王靜毅等[31]采用字母代表引物順序和數(shù)字代表擴增的特征譜帶順序號，兩者相結(jié)合建立品種資源分子身份的DNA指紋圖譜，導(dǎo)致指紋編碼字符串?dāng)?shù)值過多，不能更加快捷地區(qū)分品種數(shù)量。本實驗對核心引物譜帶進行復(fù)制編碼，使得第N對引物的擴增譜帶與指紋編碼數(shù)值相對應(yīng)，選擇譜帶不超過9個擴增片段進行指紋編碼賦值，與前兩種統(tǒng)計方法相對比顯得更加直觀簡潔，利于快速準確區(qū)分苦荬菜品種(系)。不過本研究因篩選的引物數(shù)量有限，用于鑒別品種的特征譜帶有一定的材料范圍限制[32]，即隨著品種數(shù)量的增加，特征條帶很有可能在品種中出現(xiàn)。從理論上，指紋圖譜在鑒定物種時有一定的技術(shù)優(yōu)勢，但其實在生產(chǎn)使用上還存在局限性，如成本高，鑒定可操作性有限等，今后育種上可以利用新型分子標記技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)鑒定方法輔助利用指紋圖譜。我國中央一號文件明確指出要加快發(fā)展草牧業(yè)，開展優(yōu)質(zhì)飼草料種植，國家對草牧業(yè)重視程度日漸增高，今后不斷有育成的新品種擴編入國家品種資源庫當(dāng)中，這也就預(yù)示著苦荬菜品種指紋圖譜需根據(jù)時事不斷補充和更新，也就意味著在今后還需繼續(xù)擴大引物篩選數(shù)量，增加核心引物，不斷完善苦荬菜品種(系)指紋數(shù)據(jù)庫，提高指紋圖譜的準確性、實用性和兼容性，為苦荬菜品種快速鑒定、管理和知識產(chǎn)權(quán)保護等方面提供科學(xué)基礎(chǔ)資料。

4 結(jié)論

本研究篩選24對ESR-SSR引物和32對SRAP引物組合用于14個國內(nèi)苦荬菜品種(系)的DNA指紋圖譜構(gòu)建，結(jié)果表明EST-SSR和SRAP標記可以適用于苦荬菜品種鑒定及遺傳分析，來源不同的苦荬菜品種(系)在基因水平上存在著的豐富變異，9個品種(系)在7個引物擴增條帶上具有特征譜帶，構(gòu)建的苦荬菜品種(系)指紋圖譜能夠全部區(qū)分所有供試材料，每個苦荬菜品種(系)有一套特異的分子ID身份指紋編碼，該試驗研究結(jié)果可作為鑒定苦荬菜品種的科學(xué)依據(jù)，為后續(xù)苦荬菜品種(系)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的擴充奠定基礎(chǔ)。

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