張紅萍，袁梅

（嘉興市中醫(yī)醫(yī)院，浙江 嘉興314001）

γδ T細(xì)胞是T細(xì)胞的一個(gè)功能性亞群，其表面的T細(xì)胞受體（TCR）由γδ肽鏈組成。盡管γδ T細(xì)胞在T細(xì)胞族群中占比很小，但其卻能直接殺傷腫瘤細(xì)胞而不需要依賴MHC分子。盡管如此，腫瘤細(xì)胞對(duì)γδ T細(xì)胞單獨(dú)治療的敏感性卻仍較低[1]，因此需輔以其它藥物提高γδ T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。本研究目的在于探討γδ T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞系Huh7的細(xì)胞毒性，并研究槲皮素對(duì)γδ T細(xì)胞的協(xié)同效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑 槲皮素購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich。JC-1線粒體膜電位染料、乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒和線粒體分離試劑盒購(gòu)于江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，MCL-1、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、細(xì)胞色素C和GAPDH抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling公司。ECL試劑盒購(gòu)于美國(guó)Pierce公司，pcDNA3.1質(zhì)粒和脂質(zhì)體2000（Lipofectamine 2000）購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，溴代醇磷酸 （bromohydrin pyrophosphate，BrHPP）購(gòu)于法國(guó) Innate Pharma 公司，IL-2購(gòu)于美國(guó)R&D system公司，γδ TCR-PE流式細(xì)胞抗體和CD3-FITC流式細(xì)胞抗體購(gòu)于美國(guó)BD Bioscience公司。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞系Huh7購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5%CO2。γδ T細(xì)胞的培養(yǎng)按文獻(xiàn)[2]所示，取12例健康志愿者的全血采用密度梯度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞，并培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，加入3μmol/L γδ T細(xì)胞特異性擴(kuò)增劑BrHPP和400U/mL IL-2培養(yǎng)14天。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 γδ T細(xì)胞的鑒別 培養(yǎng)γδ T細(xì)胞用帶PE熒光標(biāo)記的γδ TCR流式細(xì)胞抗體和帶FITC熒光標(biāo)記的CD3流式細(xì)胞抗體孵育20分鐘，用生理鹽水將細(xì)胞清洗3次后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 MCL-1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 將MCL-1基因的開放閱讀框架序列經(jīng)PCR擴(kuò)增后以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構(gòu)建成MCL-1重組過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。MCL-1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒用Lipofectamine 2000按試劑操作說(shuō)明書步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將2μg/mL MCL-1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞中。

1.2.3 γδ T細(xì)胞的殺傷活性 采用乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)。按不同的效靶比（效應(yīng)γδ T細(xì)胞個(gè)數(shù)：目標(biāo)Huh7靶細(xì)胞個(gè)數(shù)，E:T），將Huh7細(xì)胞和γδ T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，12小時(shí)后用乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，按說(shuō)明書步驟檢測(cè)Huh7細(xì)胞乳酸脫氫酶的釋放率。

1.2.4 槲皮素對(duì)γδ T細(xì)胞殺傷活性的影響 采用乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、槲皮素組、γδ T細(xì)胞組、槲皮素+γδ T細(xì)胞組、槲皮素+γδ T細(xì)胞+MCL-1質(zhì)粒組。各組實(shí)驗(yàn)處理方法詳見(jiàn)表1。細(xì)胞處理完畢后用乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，按說(shuō)明書步驟檢測(cè)Huh7細(xì)胞乳酸脫氫酶（LDH）的釋放率。

表1 各組實(shí)驗(yàn)處理方法

1.2.5 線粒體膜電位測(cè)定 將Huh7細(xì)胞按上述進(jìn)行分組。藥物處理完畢后按試劑操作說(shuō)明書步驟將細(xì)胞用JC-1染料進(jìn)行孵育，孵育完畢后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)JC-1發(fā)出的紅色熒光，紅色熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，線粒體膜電位越高[3]。

1.2.6 線粒體分離 將Huh7細(xì)胞按上述進(jìn)行分組。用線粒體分離試劑盒按試劑說(shuō)明書步驟將處理后的Huh7細(xì)胞線粒體從細(xì)胞質(zhì)中分離出來(lái)，取無(wú)線粒體的細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行后續(xù)的western blot實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 將Huh7細(xì)胞按上述進(jìn)行分組。細(xì)胞處理完畢后用蛋白提取液提取Huh7細(xì)胞中的總蛋白質(zhì)，將等量的總蛋白質(zhì)用12.5%SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離。分離完畢后通過(guò)電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用MCL-1、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、 細(xì)胞色素 C和GAPDH抗體孵育過(guò)夜，之后再用帶辣根過(guò)氧化物酶的二抗孵育2小時(shí)，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。

2 結(jié)果

2.1 γδ T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷活性 人全血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)體外γδ T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)后用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)γδ T細(xì)胞可在體外擴(kuò)增培養(yǎng)，且培養(yǎng)產(chǎn)物高表達(dá)CD3和γδ TCR（圖1），將γδ T細(xì)胞與Huh7細(xì)胞按不同（E:T）混合培養(yǎng)。LDH釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，E:T越高，Huh7細(xì)胞的LDH釋放率越高，表明γδ T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞有殺傷活性 （表2），且呈γδ T細(xì)胞的劑量依賴。

圖1 體外培養(yǎng)后γδ T細(xì)胞的流式細(xì)胞圖

2.2 槲皮素提高γδ T細(xì)胞對(duì)肝癌的細(xì)胞毒性LDH釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，γδ T細(xì)胞+槲皮素組Huh7的LDH釋放率顯著高于γδ T細(xì)胞組和槲皮素組（表3），表明槲皮素處理能顯著提高γδ T細(xì)胞對(duì)Huh7的細(xì)胞毒性。

表2 γδ T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷活性 （±s，%）

表2 γδ T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷活性 （±s，%）

與對(duì)照組比較*P＜0.05，與1.25倍γδ T細(xì)胞組比較☆P＜0.05，與 2.5倍 γδ T 細(xì)胞組比較△P＜0.05，與 5倍 γδ T 細(xì)胞組比較▲P＜0.05

?

2.3 槲皮素通過(guò)下調(diào)MCL-1的表達(dá)促進(jìn)γδ T細(xì)胞對(duì)Huh7凋亡的誘導(dǎo)活性 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，槲皮素體外處理能顯著降低Huh7細(xì)胞中MCL-1的表達(dá)水平（圖2），提示槲皮素對(duì)γδ T細(xì)胞的增效作用可能和Huh7細(xì)胞MCL-1的下調(diào)有關(guān)。當(dāng)在Huh7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MCL-1質(zhì)粒后，γδ T細(xì)胞聯(lián)合槲皮素對(duì)Huh7的細(xì)胞毒性受到明顯抑制（表3），表明槲皮素通過(guò)下調(diào)Huh7細(xì)胞中MCL-1蛋白的表達(dá)增強(qiáng)γδ T細(xì)胞對(duì)其的細(xì)胞毒性。另外，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，槲皮素單獨(dú)處理不影響線粒體膜電位，但其通過(guò)抑制Huh-1的表達(dá)促進(jìn)γδ T細(xì)胞依賴的線粒體膜電位下降，說(shuō)明槲皮素能顯著增強(qiáng)γδ T細(xì)胞對(duì)Huh7細(xì)胞線粒體膜電位的損傷（圖3），而Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果則顯示槲皮素抑制MCL-1蛋白的表達(dá)顯著促進(jìn)γδ T細(xì)胞依賴的細(xì)胞色素C的釋放和凋亡標(biāo)志蛋白caspase-9和caspase-3的活化（圖2），表明槲皮素通過(guò)MCL-1/線粒體途徑增強(qiáng)γδ T細(xì)胞對(duì)肝癌的細(xì)胞毒性。

圖2 各組MCL-1表達(dá)水平

表3 槲皮素增強(qiáng)γδ T細(xì)胞對(duì)Huh7細(xì)胞的細(xì)胞毒性（±s）

表3 槲皮素增強(qiáng)γδ T細(xì)胞對(duì)Huh7細(xì)胞的細(xì)胞毒性（±s）

與對(duì)照組比較*P＜0.05，與槲皮素+γδ T細(xì)胞組比較△P＜0.05

組別 n/孔 L D H釋放率（%）對(duì)照組 3 1.8±0.5槲皮素組 3 6.2±0.7*△γ δ T 細(xì)胞組 3 2 4.3±3.5*△槲皮素+γ δ T 細(xì)胞組 3 7 1.7±7.9槲皮素+γ δ T 細(xì)胞+M C L-1質(zhì)粒組 3 2 9.5±3.8△

3 討論

圖3 槲皮素對(duì)Huh7細(xì)胞線粒體膜電位的影響

肝癌是世界上發(fā)病率最高的消化道惡性腫瘤之一，預(yù)后差，死亡率居所有惡性腫瘤的第3位[4]。在肝癌治療中，盡管手術(shù)和肝移植治療是目前最有效的治療手段，然而對(duì)于不能進(jìn)行手術(shù)的患者而言，免疫治療是不可缺少的替代治療手段[5]，而一些免疫效應(yīng)細(xì)胞也已經(jīng)開始作為藥物進(jìn)行臨床試驗(yàn)，用于腫瘤治療[6]。槲皮素是一種天然黃酮類化合物，有較好的抗氧化和抗炎作用，近幾年的研究表明槲皮素還有一定的抗腫瘤效應(yīng)，能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)通路的敏感性[7]。然而，槲皮素對(duì)腫瘤免疫治療的協(xié)同作用至今無(wú)充分報(bào)道。本研究結(jié)果表明槲皮素能顯著增強(qiáng)γδ T細(xì)胞對(duì)肝癌的細(xì)胞毒性，因此槲皮素可作為一種免疫治療輔助藥物。

MCL-1是屬于Bcl-2蛋白家族的抗凋亡蛋白成員。研究表明人類腫瘤細(xì)胞中MCL-1往往會(huì)發(fā)生過(guò)表達(dá)，這可能是腫瘤細(xì)胞對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)。通過(guò)輔助治療降低腫瘤細(xì)胞中MCL-1的表達(dá)水平，可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，并降低其對(duì)化療藥物的耐藥性[8]，因此MCL-1可以作為腫瘤治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。γδ T細(xì)胞現(xiàn)已被作為一種免疫治療藥物進(jìn)行臨床試驗(yàn)。這種T細(xì)胞亞群主要通過(guò)分泌一些凋亡誘導(dǎo)因子使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。在γδ T細(xì)胞介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路中，其分泌的凋亡誘導(dǎo)因子能引起線粒體膜電位的下降，從而使細(xì)胞色素C等凋亡活性物質(zhì)從線粒體中釋放到細(xì)胞質(zhì)中，導(dǎo)致caspase-9和caspase-3的活化，最終細(xì)胞凋亡[9-11]。

在本研究中，為了探討槲皮素增強(qiáng)γδ T細(xì)胞抗肝癌活性的分子機(jī)制，進(jìn)行了western blot實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素能顯著下調(diào)肝癌細(xì)胞中MCL-1這一抗凋亡蛋白的表達(dá)水平。當(dāng)用重組真核過(guò)表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)肝癌細(xì)胞中MCL-1的蛋白水平后，槲皮素對(duì)γδ T細(xì)胞的協(xié)同抗腫瘤作用受到明顯抑制，證明槲皮素是通過(guò)降低肝癌中MCL-1蛋白的表達(dá)促進(jìn)γδ T細(xì)胞介導(dǎo)的線粒體途徑的凋亡。

綜上所述，本研究證明了槲皮素能有效提高γδ T細(xì)胞對(duì)肝癌的細(xì)胞毒性，增強(qiáng)γδ T細(xì)胞治療效果，為腫瘤免疫治療提供了更有效的策略和思路。

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