張校立，徐葉挺，艾沙江·買買提，許 娟，鄧 莉，王繼勛

(新疆農(nóng)業(yè)科學院園藝作物研究所/農(nóng)業(yè)部新疆地區(qū)果樹科學觀測試驗站，烏魯木齊　830091)

0　引 言

【研究意義】新疆地方梨品種資源豐富，品種類型獨特，具有很多優(yōu)異基因資源，是我國梨樹資源的重要組成部分之一。最著名品種是庫爾勒香梨(PyrusbretschneideriRehd)，庫爾勒香梨原產(chǎn)新疆庫爾勒地區(qū)，在新疆已有1 400多年的栽培歷史，其果實香味濃郁、皮薄肉脆、清甜爽口、細嫩多汁、耐貯藏性強，是新疆名特優(yōu)果品之一，截至2016年，庫爾勒香梨種植面積達7.38×104hm2(110.83萬畝)，產(chǎn)量達128.04×104t[1]。香梨產(chǎn)業(yè)已成為庫爾勒地區(qū)的主導產(chǎn)業(yè)。庫爾勒香梨自交不親合，S基因型為S22S28[2]，自交結實率低，需要配置授粉品種，但不同的授粉品種會對香梨果實產(chǎn)生顯著的花粉直感效應，突出表現(xiàn)為不同花粉授粉后果實萼片脫落或宿存，萼片脫落后的幼果發(fā)育成為 “母梨”，萼片宿存的幼果發(fā)育成為“公梨”，二者不但外在品質(zhì)果形上差異很大，而且內(nèi)在品質(zhì)和口感上也差異明顯，市場價格差異也非常顯著。徐勝利等[3]研究表明，選擇新疆梨作為授粉品種能夠明顯改善香梨果形和果實品質(zhì)。通過對新疆地方梨品種S-等位基因的鑒定，對庫爾勒香梨合理授粉品種的選配和豐產(chǎn)栽培具有重要的理論意義。【前人研究進展】梨自交不親和性基因的研究始于20世紀50年代，國外最早是Kikuchi, Machida和Terami等[4-6]日本學者，采用廣泛的田間授粉雜交實驗，從日本沙梨中鑒定了7個S等位基因，命名S1～S7。2000、2001年，Castillo 使用PCR-RFLP系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)了S8和S9兩個新的S等位基[1]。2006年，Kin等[8]又利用PCR-RFLP在梨品種-Chengsilri.中鑒定出S10-RNase新基因。在西洋中, Zisovich 等[9],Takasaki 等[10]與Mota et等[11],利用特異引物和基因克隆的方法已經(jīng)鑒定出Sa～St等17個S-RNases基因。2009年，Javier[12]在西洋梨品種‘Abugo’ 和 ‘Ceremeno’兩個品種中,鑒定出了一個新的自交親和的S-allele：S 21，這個基因是由S21的突變體。2014年，Azam Nikzad Gharehaghaji. Kazem Arzani等[13]在57個伊朗的梨品種中鑒定出了3個新的S-RNase，分別是S126、S127 和 S128。中國最早是烏云塔娜[14]在2003年，從中國白梨中分離鑒定了7個新的S基因，分別記S17、S19、S20、S21、S22、S26、S27等位基因；譚曉風等[15]分別從白梨、沙梨及秋子梨等亞洲梨種群分離鑒定了34個S等位基因；從 2003 年開始至今采用 PCR-RFLP、DNA 測序、雜交檢測等方法開展了中國梨自交不親和性的研究，發(fā)現(xiàn)了包括 S1～S10基因在內(nèi)的 42個 S 基因，從中國梨中克隆了 S12、S13、S15、S17～S22、S25～S30、S32、S34、S35、S38～S40、S42、S46等 S 基因全長 cDNA 序列。迄今為止，國內(nèi)外通過不同的鑒定方法，大概確定了近500 個梨品種的 S 基因型，近500個品種中大部分是白梨系統(tǒng)、秋子梨系統(tǒng)、沙梨系統(tǒng)的品種，新疆梨系統(tǒng)的品種非常少，目前，只有陳慧等[16]鑒定了黃句句(S22S34)、伊犁紅句句(S22S28)、早熟句句(S17S19)、乃希木特阿木提(S19S28)沙01號(S22S28)、斯爾克甫梨(S22S28)、墨梨(S26 S b)、貴德長把(S19 S b)等8個新疆梨系統(tǒng)品種S-基因型?！颈狙芯壳腥朦c】新疆梨地方品種是我國特有的梨樹資源，資源豐富，具有很多優(yōu)異的基因資源。新疆地方梨品種S基因型的鑒定研究比較少，大部分新疆梨地方梨的S基因型還未鑒定，該研究的9個新疆地方梨品種的基因型目前尚未見報道。研究對新疆地方梨品種S基因型進行鑒定?！緮M解決的關鍵問題】利用PCR和DNA 測序技術鑒定9個新疆地方梨品種的S 基因型。9個品種S 基因型的鑒定，以期豐富我國梨品種 S 基因型信息，為庫爾勒香梨篩選最佳的授粉梨品種提供了一定的理論基礎，為庫爾勒香梨的豐產(chǎn)栽培和遺傳改良奠定基礎。

1　材料與方法

1.1　材 料

1.1.1新疆地方梨品種

供試品種9個新疆地方梨品種分別為褐色句句梨、輪臺句句梨、霍城冬黃梨、八月梨、庫爾勒黃酸梨、句句梨、 奎克阿木特1號、可特阿木特和棋盤梨。品種均來自新疆農(nóng)業(yè)科學院輪臺國家果樹資源圃。于2017年4月上旬采集各品種幼嫩葉片置于液氮中，帶回實驗室后于-80 ℃ 冷凍保存。

1.1.2試劑

ExTaq、pMD18-T Vector、DNA回收試劑盒購自北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司，DNA 提取試劑盒購于天根科技生化化有限公司，其他藥品均購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2　方 法

1.2.1基因組 DNA 提取

參照植物基因組 DNA 提取試劑盒說明書(柱式植物DNAout2．0，天根科技生化化有限公司) 提取梨基因組 DNA，在1%瓊脂糖凝膠、1×TAE緩沖液、3～5 V/cm 下電泳，電泳結果用上海復日 FR-980 凝膠圖成像系統(tǒng)照相，檢測 DNA 樣品。

1.2.2PCR 擴增及檢測

根據(jù)已報道梨的S基因相關信息, 獲知梨S基因的一級結構由5個保守區(qū)、1個高頻可變區(qū)及1個內(nèi)含子組成。高頻可變區(qū)是花粉識別的部位。S基因多態(tài)性主要源于高頻可變區(qū)的差異, 通常根據(jù)高頻可變區(qū)的差別判斷不同的S基因。因此，根據(jù) S 基因一級結構特點，利用 S 基因高變區(qū)( hypervariable region，HV) 的保守序列設計合成引物。

正向引物 PF：(5'-TTTACGCAGCAATATCAG-3')

反向引物 PR：( 5'-AC( A / G) TTCGGCCAAATAATT-3')

在江南等[17]擴增反應體系及反應過程的基礎上略作調(diào)整，使用ExTaq酶保證擴增結果的可靠性，擴增產(chǎn)物在 1.4% 瓊脂糖凝膠上于100 V電泳30～45 min，上海復日FR-980凝膠圖像系統(tǒng)分析拍照并記錄分析。

1.2.3PCR 產(chǎn)物回收、克隆、測序

利用凝膠回收試劑盒回收目的 DNA 片段，與 PEASY-T5載體16℃ 條件下過夜連接，連接產(chǎn)物轉化至感受態(tài)大腸桿菌Trans1-T1，涂于 SOC/Amp50 固體培養(yǎng)基上 37℃ 過夜。挑選陽性克隆，菌液 PCR 篩選帶有目的片段長度的克隆 。每個 S 基因片段挑選 3 個陽性克隆，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。測序結果利用Blast 與 GenBank 中已知的 S-RNase 基因序列比較，確定其S基因型。

2　結果與分析

2.1　新疆梨地方梨品種基因組 DNA 提取

利用北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒，提取新疆梨地方梨品種的基因組 DNA，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，具有提取濃度高、純度好，蛋白質(zhì)、RNA 雜質(zhì)含量少特點，通過稀釋可以直接用于 PCR擴增。圖1

注：M. Markers、1.褐色句句梨；2、輪臺句句梨；3.霍城冬黃梨；4.八月梨；5.庫爾勒黃酸梨；6.句句梨；7. 奎克阿木特1號；8.可特阿木特；9. 棋盤梨

Note: M.Markers;1.Hesejujuli;2.Luntaijujuli;3.Huochengdonghuali;4.Bayueli;5.Kuerle- huangsuanli; 6. Jujuli;7.Kuikeamute1hao;8.Keteamute;9.Qipanli

圖19個新疆地方梨品種基因組DNA瓊脂糖電泳檢測結果
Fig.1The agarose electrophresis result of DNA extracted from nine local pear cultivars in Xinjiang

2.2　新疆梨地方梨品種PCR 擴增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離

使用S-allele特異性引物PF和PR將對新疆地方梨品種的基因組 DNA 進行 PCR 擴增，擴增產(chǎn)物進一步聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，由于PCR 產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠上電泳隨遷移率的不同, 表現(xiàn)為不同位置的條帶。研究表明，除奎克阿木特1號表現(xiàn)出明顯的3條明顯的條帶外，褐色句句梨、輪臺句句梨、霍城冬黃梨等8個品種在聚丙烯酰胺凝膠上均呈現(xiàn)2條明顯的條帶。褐色句句梨、輪臺句句梨、霍城冬黃梨、八月梨等8個品種的兩條帶都在300～500 bp，奎克阿木特1號的兩個條帶在300～500 bp，另外一條帶在600～800 bp。褐色句句梨、輪臺句句梨、八月梨、句句梨的兩個擴增條帶和奎克阿木特1號的其中兩個擴增條帶在聚丙烯酰胺凝膠上的位置相同,其S基因堿基序列是否相同有待進一步分析。圖2

2.3　新疆梨地方梨品種S基因型的鑒定

聚丙烯酰胺凝膠電泳后回收目的條帶、克隆后，將克隆后的陽性克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，將測定的結果序列使用生物信息學軟件進行 Blast 搜索、同源性比較, 根據(jù)分析GenBank內(nèi) S 基因的堿基序列及同源性,確定9個新疆地方梨品種的 S 基因型。7個品種中 S 基因的核苷酸序列與 GenBank 中已登錄的梨 S 基因有極高的同源相似性，褐色句句梨的S基因與S28、S4基因的相似性達98%、99%；輪臺句句梨的S基因與S28、S4基因的相似性均為100%，霍城冬黃梨的S基因與S28、S4基因的相似性達100%、99%；八月梨S基因與S28，S4基因的相似性達99%、100%；庫爾勒黃酸梨的S基因與S22、S35基因的相似性達100%、100%；奎克阿木特1號的S基因與S36、S34、S22基因的相似性達100%、98%、100%；可特阿木特一個S基因與S8相似性達100%，另外，一個沒有鑒定出來，棋盤梨一個S基因與S28相似性達99%，另外，一個也沒有鑒定出來。表1

注：M. Markers、1.褐色句句梨、2、輪臺句句梨、3.霍城冬黃梨、4.八月梨、5.庫爾勒黃酸梨、6.句句梨、7. 奎克阿木特1號、8.可特阿木特、9. 棋盤梨

M.Markers;1.Hesejujuli;2.Luntaijujuli;3.Huochengdonghuali;4.Bayueli;5.Kuerle- huangsuanli; 6. Jujuli;7.Kuikeamute1hao;8.Keteamute;9.Qipanli

圖29個新疆梨地方梨品種S 基因特異擴增的 6% 聚丙烯酰胺凝膠電泳
Fig.2The 6% PAGE of PCR amplification of genomic DNA with S gene specific primers on the nine local pear cultivars in Xinjiang表19個新疆地方梨品種的S基因型
Table1S-genotypes of nine local pear cultivars in Xinjiang

序號No．品種Cultivars系統(tǒng)System引物PrimersPCR片段長度ThePCRfragmentsize(bp)S基因型S-genotype1褐色句句梨新疆梨PF/PR428/374S28S42輪臺句句梨新疆梨PF/PR428/374S28S43霍城冬黃梨新疆梨PF/PR428/371S28S44八月梨新疆梨PF/PR428/347S28S45庫爾勒黃酸梨新疆梨PF/PR346/378S22S356句句梨新疆梨PF/PR428/374S28S47奎克阿木特1號新疆梨PF/PR568/342/428S36S34S228可特阿木特新疆梨PF/PR440/xS8Sx9棋盤梨新疆梨PF/PR428/xS28Sx

3　討 論

研究應用 PCR和DNA測序技術對 S 基因特異性擴增條帶的測序, 然后通過 blast生物信息軟件對測序的DNA序列進行分析，由于可特阿木特和棋盤梨各鑒定出一條基因，9個新疆地方梨品中只能明確確定了 7個品種 S基因型，結果為：褐色句句梨 S28S4、輪臺句句梨S28S4、霍城冬黃梨S28S4、八月梨S28S4、庫爾勒黃酸梨S22S35、句句梨S28S4、奎克阿木特1號S36S34S22；可特阿木特和棋盤梨S基因型暫定為S8Sx和 S28Sx。同為新疆地方梨品種，它們之間既有相同之處，也有不同之處，比如：褐色句句梨、輪臺句句梨，霍城冬黃梨、八月梨、句句梨等5個品種具有相同的基因型S28S4，它們5個品種間不能相互作授粉品種，因為它們具有相同的基因型，如果相互間作授粉品種，就會出現(xiàn)不結果或結果率極低；庫爾勒黃酸梨和奎克阿木特1號2個品種的基因型不相同，它們?nèi)齻€品種間可以相互作授粉品種。由于可特阿木特和棋盤梨只鑒定出一個S基因，沒有明確確定出其S基因型，因此，可特阿木特和棋盤梨與其它品種間的授粉情況暫不能下定論。這9個新疆地方梨品種中除可特阿木特外，其它8個品種都含有庫爾勒香梨的S基因，色句句梨、輪臺句句梨，霍城冬黃梨、八月梨、句句梨、棋盤梨等6個品種含有庫爾勒香梨的S28，庫爾勒黃酸梨和奎克阿木特1號含有庫爾勒香梨的S22基因，除可特阿木特外，其它8個新疆地方梨品種都不適宜作庫爾勒香梨的授粉品種。

在起源上，8個新疆地方梨品種既然都含有庫爾勒香梨的S基因，說明這 8個品種與庫爾勒香梨在起源上有很大的相關性。另外，鑒定出的9個新疆地方梨品種的分別含有S4、S8、S22、S28、S34、S35、S36等S基因，這些基因分別屬于白梨系統(tǒng)、沙梨系統(tǒng)和西洋梨系統(tǒng)的S基因，初步推論新疆地方梨品種可能是白梨系統(tǒng)、沙梨系統(tǒng)和西洋梨系統(tǒng)的雜種，雜種后代又經(jīng)過長期的自然雜交，互相演化而來成現(xiàn)在的品種，這個推論結果與沈德緒、藤元文等[18，19]的研究結果大致是相同的；在果樹育種學上，沈德緒等[18]認為新疆梨可能是西洋梨與白梨的雜交種；藤元文等[19,20]認為新疆梨遺傳組成至少包括了白梨或砂梨，西洋梨和杏葉梨，可能是這幾個種的自然雜交種，另外，他們利用DNA標記研究表明原產(chǎn)新疆的所謂杏葉梨屬于西方梨類型；但是，馬兵剛等[20]試驗結果RAPD 數(shù)據(jù)對新疆梨是否為西洋梨和白梨的雜交種無法判斷。新疆地方梨品種尤其是庫爾勒香梨具體的起源與分類還需進一步深入的研究與分析，這對庫爾勒香梨的品種改良及豐產(chǎn)栽培具有重要的指導價值。

4　結 論

通過PCR和DNA測序技術鑒定了9個新疆地方梨品中的S基因型，確定了7個新疆地方梨品種S基因型，鑒定的結果為：褐色句句梨 S28S4、輪臺句句梨S28S4、霍城冬黃梨S28S1、八月梨S28S4、庫爾勒黃酸梨S22S35、句句梨S28S4、奎克阿木特1號S36S34S22；新疆地方梨品S-genotype的鑒定，增加我國7個新疆地方梨品種的S-genotype信息，為新疆地方梨品種尤其是庫爾勒香梨起源與分類提供了一定的理論支持，為庫爾勒香梨的的豐產(chǎn)栽培和品種改良提供了指導依據(jù)，為庫爾勒香梨授粉品種的篩選新疆地方梨品種提供理論依據(jù)。

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