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(1.貴州師范大學(xué)貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽(yáng) 550001;2.貴州師范大學(xué)國(guó)家喀斯特石漠化防治工程技術(shù)研究中心,貴州貴陽(yáng) 550001；3.貴州師范大學(xué)貴州省藥物質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽(yáng) 550001)

圖1　典型鏈格孢霉毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1　Chemical structure of typical Alternaria mycotoxins

鏈格孢霉菌(Alternariaspecies)是普遍存在的病原體和腐生菌,具有寄生、腐生以及植物致病性,且適宜在低溫下繁殖生長(zhǎng)[1]。鏈格孢霉菌可以產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物,統(tǒng)稱為鏈格孢霉毒素。蘋果、柑橘、番茄、蘿卜、高粱、小麥、飼料等果蔬和谷物,均可在田間、運(yùn)輸或冷藏環(huán)境下受到霉菌的污染而腐敗,繼而產(chǎn)生并累積鏈格孢霉毒素[2]。研究表明,有些鏈格孢霉毒素對(duì)動(dòng)植物具有急性和亞急性毒性、細(xì)胞毒性、致畸致癌性及胚胎毒性等毒性,有些與食道癌密切相關(guān),因此應(yīng)當(dāng)引起重視[3-4]。近年來(lái),對(duì)于鏈格孢霉毒素的理化性質(zhì)、分析方法都有所進(jìn)展,在毒理機(jī)制方面也有相關(guān)的報(bào)道。本文就鏈格孢毒素的分類、理化性質(zhì),常見的分析方法和毒理機(jī)制等方面進(jìn)行了綜述。

1　鏈格孢霉毒素簡(jiǎn)介

目前已知的具有明顯毒性的鏈格孢霉毒素有70多種,人和動(dòng)物攝入被鏈格孢毒素污染的谷物及飼料可導(dǎo)致急性或慢性中毒,從食物中檢出的鏈格孢霉毒素有主要有交鏈孢酚(alternariol,AOH)、交鏈孢酚單甲醚(alternariol monomethyl ether,AME)、交鏈孢烯(altenuene,ALT)、細(xì)交鏈孢菌酮酸(Tenuazonic acid,TeA)、AAL毒素(Alternaria alternata,AAL-toxin),交鏈孢毒素(Altertoxin,ATXs)和騰毒素(Tentoxin,TEN)等[5-6]?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

根據(jù)鏈格孢霉毒素的結(jié)構(gòu),可以將其分為5大類。二苯并吡喃酮類及其衍生物:如典型化合物AOH、AME、ALT;二萘嵌苯及其衍生物:如典型化合物ATX-I、ATX-II、ATX-III;細(xì)交鏈格孢菌酮酸及其衍生物:如典型化合物TeA;一系列長(zhǎng)鏈氨基多元醇的丙三羧酸酯類化合物:如典型化合物AAL毒素;混雜結(jié)構(gòu):一種環(huán)形四肽,如典型化合物TeN[7-8]。典型鏈格孢霉毒素的分類及理化性質(zhì)如表1所示。

2　鏈格孢霉毒素的分析方法

鏈格孢霉毒素的檢測(cè)方法有很多,主要有薄層色譜法(thin layer chromatography,TLC)[10-11]、氣相色譜法(gas chromatography,GC)、氣相色譜質(zhì)聯(lián)用法(gas chromatograph-mass spectrometer,GC-MS)[12-13]、液相色譜法(liquid chromatography,LC)、液相色譜質(zhì)聯(lián)用法(liquid chromatography-mass spectrometer,LC-MS)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[14-17]及其他技術(shù)如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)技術(shù)[18]等。

2.1　薄層色譜法

TLC作為一種簡(jiǎn)單快速的定性分析方法已被用于各種分析領(lǐng)域,也一直應(yīng)用于鏈格孢霉屬真菌毒素的測(cè)定。Matysikl[19]采用薄層色譜法和光密度計(jì)測(cè)定番茄和覆盆子中鏈格孢霉毒素。結(jié)果得到分析時(shí)間為30 min,Rf值分別是AOH=43和AME=72,以此得出可應(yīng)用于鏈格孢霉毒素的檢測(cè)。此法雖簡(jiǎn)單快速,但隨機(jī)誤差大,重復(fù)性較差,近些年應(yīng)用較少,已逐漸被其他方法所替代。

2.2　氣相色譜法及氣質(zhì)聯(lián)用法

表1　典型鏈格孢霉毒素的分類及理化性質(zhì)Table 1　Classification and physical-chemical properties of typical Alternaria mycotoxins

GC聯(lián)用不同的檢測(cè)技術(shù)也已經(jīng)應(yīng)用于鏈格孢霉屬真菌毒素的檢測(cè)。GC特別是GC-MS,不僅具有高靈敏度和選擇性,而且可以檢測(cè)混合物中的某些物質(zhì)。它適合檢測(cè)非極性和半極性化合物,揮發(fā)性和半揮發(fā)性化合物。Harvan等[20]采用氣相色譜法,利用火焰離子化檢測(cè)器(flame ionization detector,FID),以三甲基硅烷乙酰胺∶三甲基硅烷∶吡啶(6∶2∶9)為衍生劑測(cè)定TeA,該方法的檢出限為0.1 μg/g。盡管GC/GC-MS方法靈敏度優(yōu)異,但這些方法還沒(méi)有廣泛應(yīng)用于鏈格孢真菌毒素檢測(cè),主要原因是:樣品制備的鏈格孢霉菌毒素大多需要衍生化,衍生化會(huì)導(dǎo)致重復(fù)性差,耗時(shí),成本高等缺點(diǎn)。

2.3　液相色譜法及液質(zhì)聯(lián)用法

近年來(lái),液相色譜法聯(lián)用其他技術(shù)如紫外檢測(cè)器(ultraviolet absorption detector,UVD)、二極射線管檢測(cè)器(diode array detector,DAD)、熒光檢測(cè)器(fluorescence detector,FLD)、電化學(xué)檢測(cè)器(electrochemical detect,ECD)、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(evaporative light-scattering detector,ELSD)和質(zhì)譜(mass spectrometry,MS)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于檢測(cè)鏈格孢霉毒素。目前在真菌毒素檢測(cè)的實(shí)際工作中,為提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性,液相色譜通常與質(zhì)譜聯(lián)用,其聯(lián)用技術(shù)是目前真菌毒素檢測(cè)中應(yīng)用最廣泛的技術(shù),此技術(shù)結(jié)合了色譜和質(zhì)譜兩者的優(yōu)點(diǎn),使得真菌毒素的檢測(cè)工作更加快速、高效[21]。Liu等[22]采用穩(wěn)定同位素稀釋液LC-MS/MS的方法檢測(cè)鏈格孢霉毒素的騰毒素、二氫麥角毒素等,結(jié)果得出:檢出限范圍為0.10～0.99 μg·kg-1,日內(nèi)/日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于8.8%,回收率在98%～115%之間。目前,根據(jù)質(zhì)檢總局關(guān)于出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中SN/T4259-2015,出口水果蔬菜中鏈格孢霉毒素的測(cè)定也多采用液質(zhì)聯(lián)用方法檢測(cè)。LC-MS,特別是基于電噴霧(electrospray ionization,ESI)離子源的LC-MS/MS或LC-MSn,對(duì)于鏈格孢霉毒素的檢測(cè)發(fā)揮了重要的作用。

2.4　其他技術(shù)

2.4.1ELISA技術(shù)GC-MS和LC-MS等分析方法需要昂貴的設(shè)備和高素質(zhì)的技術(shù)人員,而ELISA技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、小型化、快速性和可移植性的特點(diǎn),可以避免上述儀器分析方法的弱點(diǎn)。它已經(jīng)成為快速測(cè)定鏈格孢霉毒素在內(nèi)的真菌毒素的檢測(cè)方法。到目前為止,ELISA方法已有被用于檢測(cè)AAL、AOH和TeA等毒素。馬良等[23]采用自制的抗細(xì)交鏈格孢菌酮酸(TeA)多克隆抗體,建立了以辣根過(guò)氧化物酶催化魯米諾-過(guò)氧化氫為發(fā)光體系的間接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法定量檢測(cè)谷物中TeA毒素,得出最低檢出限為0.010 ng·mL-1,線性范圍0.0323～0.244 ng·mL-1,在面粉和燕麥中的平均加標(biāo)回收率為82.4%～96.1%和81.5%～93.4%,批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)均小于12%,與液質(zhì)方法比較準(zhǔn)確度無(wú)顯著差異,與其他幾種食品中的常見真菌毒素?zé)o交叉反應(yīng),可快速、準(zhǔn)確、靈敏地測(cè)定谷物中TeA檢測(cè)。Gross等[24]用琥珀酸酐對(duì)TeA進(jìn)行衍生化,以活性酯法將其與鑰孔血藍(lán)蛋白偶聯(lián)成人工抗原,采用TeA-KLH偶聯(lián)物篩選得到多克隆抗體,并利用此多克隆抗體構(gòu)建直接競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附方法,此方法對(duì)TeA具有一定的靈敏性。

2.4.2逆流色譜(Countercurrent chromatography,CCC)技術(shù)CCC技術(shù)是以分析物在液-液兩相溶劑中的分配差異為核心的快速分離技術(shù)。Fan等[25]使用離子液體改性逆流色譜法作為預(yù)處理方法,然后通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定葡萄酒和果汁中的鏈格孢真菌毒素。該方法提供了高回收率的鏈格孢霉毒素,具有良好的重現(xiàn)性和低檢測(cè)限,已被連續(xù)應(yīng)用于實(shí)際蘋果汁和葡萄酒樣品中鏈格孢霉毒素的測(cè)定。研究者分析了當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)共12種葡萄酒樣品和15種蘋果汁樣品,結(jié)果樣品中AOH和AME的檢出率均在50%以上。所采取的方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏,可用于分析和監(jiān)測(cè)其他食品樣品中的鏈格孢霉菌素。

2.4.3電化學(xué)技術(shù)到目前為止,電化學(xué)方法用于檢測(cè)的鏈格孢真菌毒素只報(bào)告一次[26]。研究人員使用蘑菇改性的碳糊電極酪氨酸酶定量檢測(cè)AOH和AME通過(guò)電化學(xué)方法[27],結(jié)果表明AME和AOH都是底物蘑菇酪氨酸酶。此外,該方法具有低噪聲,并且具有容易和快速的電極表面更新。

3　鏈格孢霉毒素的毒理機(jī)制

鏈格孢毒素對(duì)動(dòng)植物的毒性作用機(jī)制研究表明,人和動(dòng)物食用被其污染的食物和飼料會(huì)面臨急性、慢性毒性、致畸、致突變性、致癌性和致死性等風(fēng)險(xiǎn)。不同的鏈格孢霉毒素,毒性及毒理機(jī)制存在差異,研究鏈格孢霉毒素的毒理機(jī)制,對(duì)于預(yù)防和控制其致毒具有重要的意義。

表2　典型鏈格孢霉毒素的毒性及毒理機(jī)制Table 2　Toxicity and toxicological mechanism of typical Alternaria mycotoxins

3.1　交鏈孢酚(AOH)

AOH具有基因毒性、協(xié)同作用、遺傳毒性、致突變性、細(xì)胞毒性、胚胎毒性、致癌性。AOH和AME都能夠增加DNA斷裂的速率,且它們之間表現(xiàn)出協(xié)同作用。AOH抑制DNA刺激拓?fù)洚悩?gòu)酶I,IIα和IIβ的DNA切割活性[28],破壞中國(guó)倉(cāng)鼠成纖維細(xì)胞(V79)、人類肝癌細(xì)胞(HepG2)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(HT29)和人肺癌細(xì)胞(A431)的DNA完整性。遺傳毒性和致突變性表現(xiàn)為AOH能造成細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡[29]。Fernández等[30]研究表明AOH可導(dǎo)致人結(jié)腸癌細(xì)胞(caco-2)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),但僅在高濃度中表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。胚胎毒性表現(xiàn)為AOH和AME的混合物及單劑量的AOH可導(dǎo)致仔鼠畸形,并可觀察到兩者之間的協(xié)同作用[3]。AOH還具有致癌性。Liu等[31]發(fā)現(xiàn)AOH能引起食道上皮細(xì)胞增殖,并且能引起胚胎食道鱗狀細(xì)胞癌變。

3.2　交鏈孢酚單甲醚(AME)

AME具有致畸性、致突變性、胚胎毒性、致癌性、誘變性及其協(xié)同作用。研究表明,高劑量的AME胎鼠平均體重減少,內(nèi)臟嚴(yán)重壞死。AOH和AME可能引起細(xì)胞致突變性,可誘導(dǎo)胎兒食道的鱗狀細(xì)胞癌。AME可以增強(qiáng)AOH的胚胎毒性,同時(shí),AOH也可以增強(qiáng)AME的胚胎毒性。致癌性表現(xiàn)為經(jīng)AME和AOH處理的人胚胎食管上皮細(xì)胞中可檢出活化的癌基因等。研究表明,在沙門菌實(shí)驗(yàn)中無(wú)代謝激活A(yù)ME有弱誘變性。AME和AOH還具有協(xié)同作用[32],單獨(dú)的AOH或AME對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性作用之和比它們的混合物的毒性作用要弱。Bensassi等[33]將人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116置于AME中,證明AME通過(guò)激活細(xì)胞凋亡的線粒體通路誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞的死亡。

3.3　交鏈孢菌酮酸(TeA)

TeA具有急性毒性、亞急性毒性、潛在致癌性、胚胎毒性、致死性、細(xì)胞毒性以及協(xié)同作用,其毒癥狀為腹瀉、肌肉震顫和驚厥。TeA毒素水平居各鏈格孢霉毒素之首,被美國(guó)食品藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)列入有毒化學(xué)物質(zhì)登記冊(cè)中[34]。TeA致癌性表現(xiàn)為每天按照25 mg·kg-1BW TeA喂養(yǎng)小鼠10個(gè)月,食道出現(xiàn)癌癥前期變化[35]。Griffin等[36]給7日齡的雞胚每隔一天注射100 μL的TeA,觀察雞胚發(fā)育情況,第23天后,雞胚全部死亡。TeA有致死性。David等[37]發(fā)現(xiàn)TeA和ATX-I會(huì)導(dǎo)致大鼠和雞死亡。此外,致死性表現(xiàn)在哺乳動(dòng)物食道和胃腸道大面積出血及循環(huán)衰竭、運(yùn)動(dòng)功能障礙、死亡。TeA還具有細(xì)胞毒性。Zhou等[38]通過(guò)研究TeA對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞(3T3細(xì)胞)、中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞(CHL細(xì)胞)和人類肝細(xì)胞(L-O2細(xì)胞)3種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的影響,發(fā)現(xiàn)TeA可降低細(xì)胞增殖速率并減少總蛋白的含量。在研究高粱中鏈格孢屬代謝產(chǎn)物的毒性時(shí)發(fā)現(xiàn),只產(chǎn)AOH、AME和ALT的培養(yǎng)物對(duì)大鼠和雛雞均無(wú)毒性作用,而加入一定量的TeA和ATX-Ⅰ后,卻是致命的[37]。單獨(dú)TeA要產(chǎn)生這樣的急性毒性,所需劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)這個(gè)加入量,這表明TeA能與其他鏈格孢霉毒素協(xié)同作用,產(chǎn)生急性毒性。

3.4　交鏈孢毒素(ATXs)

ATXs具有致突變性、誘變性、細(xì)胞毒性。ATX具有致突變性、誘變性。在鼠傷寒沙門氏菌艾姆斯實(shí)驗(yàn)中ATX-II有明顯致突變性。ATX-Ⅰ、ATX-Ⅱ和ATX-Ⅲ均表現(xiàn)誘變性,其中ATX-Ⅲ對(duì)沙門菌TA98的誘變性最強(qiáng),其次是ATX-I和ATX-Ⅱ。ATX-Ⅰ和ATX-Ⅱ具有細(xì)胞毒性。200 mg/kg的ATX-I和ATX-II可引起小鼠中毒甚至死亡,毒癥狀包括倦怠、心內(nèi)膜下及株網(wǎng)膜下出血等[39]。最近證實(shí)了就DNA鏈斷裂而言,ATX-II比AOH更易致變哺乳動(dòng)物細(xì)胞。典型鏈格孢霉毒素的毒性及機(jī)制如表2所示。

4　展望

鏈格孢霉毒素是比較常見的真菌毒素之一,越來(lái)越多的研究證明,鏈格孢霉毒素存在著一定的協(xié)同作用。由于鏈格孢霉毒素的污染的途徑多而廣,嚴(yán)重危害了人和動(dòng)物的健康安全,因此,篩選出高效、快速、簡(jiǎn)便的分析方法以及深入研究毒理機(jī)制作用都具有重要的意義。

4.1　分析方法

傳統(tǒng)的分析技術(shù)如TLC、GC/GC-MS缺點(diǎn)較明顯。LC-MS/MS或LC-MSn已成為鏈格孢霉真菌毒素檢測(cè)的主流。然而,液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)需要大規(guī)模設(shè)備和高素質(zhì)的技術(shù)人員,它們不能滿足實(shí)時(shí)、快速的對(duì)食品安全領(lǐng)域真菌毒素的檢測(cè)。因此,需要開發(fā)出更多的類似于ELISA技術(shù)快速的方法,用于鏈格孢霉毒素的檢測(cè)。隨著進(jìn)一步發(fā)展,今后檢測(cè)方法的研究重點(diǎn)應(yīng)是簡(jiǎn)單、便攜、快速、高效。

4.2　毒理機(jī)制

現(xiàn)階段,對(duì)于鏈格孢霉毒素毒理機(jī)制的研究深度參差不齊,交鏈孢菌酮酸(TeA)、交鏈孢酚(AOH)相對(duì)較多,而對(duì)于如AAL毒素、交鏈孢毒素(ATXs)和騰毒素(TeN)很少,且鏈格孢霉毒素之間的協(xié)同作用研究也不全面,今后的研究可以重點(diǎn)放在鏈格孢霉毒素之間的協(xié)同作用機(jī)制上,這對(duì)于有效控制鏈格孢霉毒素的致毒危害及人和動(dòng)物的健康安全都具有重要意義。

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