趙偉燁 王智慧 曹彥強 劉天琳 羅紅燕 朱 波 蔣先軍?

（1 西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400715）

（2 中國科學(xué)院成都山地災(zāi)害與環(huán)境研究所，成都 610041）

氮（N）素是地球所有生物所必需的營養(yǎng)元素［1］。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中大量氮肥的投入雖然增加了作物的產(chǎn)量，但也引起了水體污染及溫室氣體排放等環(huán)境問題［2］。硝化作用作為農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)氮素損失的主要途徑之一，是氨經(jīng)過亞硝酸鹽最終轉(zhuǎn)化為硝酸鹽的氧化過程，由氨氧化和亞硝酸氧化兩步組成，分別由氨氧化細菌（Ammoniao x i d i z i n g b a c t e r i a,A O B）、氨氧化古菌（Ammonia-oxidizing archaea, AOA）和亞硝酸鹽氧化細菌 （Nitrite-oxidizing bacteria, NOB）驅(qū)動完成［3］。由于氨氧化是硝化作用的限速步驟［4］，同時NOB相比于AOB和AOA更難在實驗室環(huán)境中生長［5］，因此多年來人們研究的方向主要集中在氨氧化微生物上，對AOB和AOA在生態(tài)系統(tǒng)中的分布［6-8］、在土壤硝化作用中 的相對貢獻［9］、影響因子［10-11］以及不同氮源下氨氧化微生物的群落組成變化［12］等進行了大量深入研究。NOB利用亞硝酸鹽氧化酶將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽，亞硝酸鹽是其唯一氮源［13］。亞硝酸鹽作為硝化作用的中間產(chǎn)物，能夠通過氨氧化細菌和亞硝酸鹽氧化細菌之間的緊密配合立刻轉(zhuǎn)化為硝酸鹽［14］，然而，有時氨氧化細菌和亞硝酸鹽氧化細菌不同的生長速率會打破這種合作機制導(dǎo)致亞硝酸鹽的累積［15］。研究發(fā)現(xiàn)［16］，溫度、pH、溶解氧等因子對NOB活性具有顯著影響，也會導(dǎo)致亞硝酸鹽的累積。最近，科學(xué)家們報道了一種單步硝化螺菌屬細菌能夠執(zhí)行全程硝化（complete nitrification）過程［17-18］，即先前被人們認知的僅僅能夠催化亞硝酸鹽氧化的亞硝酸鹽氧化細菌。全程氨氧化微生物（Comammox）的發(fā)現(xiàn)為土壤硝化作用的研究開創(chuàng)了全新的領(lǐng)域。

氮肥施入土壤后會導(dǎo)致土壤局部環(huán)境的變化［19］，在實際的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中，氮肥的施用也必然會導(dǎo)致其他離子進入土壤，對土壤硝化作用產(chǎn)生影響［19］。石灰性紫色土主要發(fā)育在亞熱帶地區(qū)石灰性紫色砂頁巖，pH較高，土質(zhì)較為疏松，氮素含量較低。由于高pH土壤相比于低pH土壤硝化作用強，更容易造成氮素的損失，因此本文以石灰性紫色土為研究對象，采用室內(nèi)培養(yǎng)試驗以表征石灰性紫色土在硫酸銨、氯化銨和尿素三種不同底物下的硝化作用強弱差異，通過實時熒光定量 PCR技術(shù)分析AOB和AOAamoA基因拷貝數(shù)在培養(yǎng)過程中的變化并通過高通量測序分析石灰性紫色土加入不同底物后的物種進化及硝化細菌群落組成。從微生物層面探究石灰性紫色土硝化作用發(fā)生機制，以期為合理施肥，提高氮素利用率提供資料。

1　材料與方法

1.1　供試土壤

供試土壤采自中國科學(xué)院成都山地災(zāi)害與環(huán)境研究所鹽亭紫色土農(nóng)業(yè)生態(tài)觀測研究站，東經(jīng)105°28′，北緯31°16′，年均氣溫17.4℃，年均降水826 mm，為亞熱帶季風氣候。供試土樣為石灰性紫色土，種植作物為小麥。于2016年9月用土鉆按五點取樣法鉆取0～20 cm耕作層土壤，帶回實驗室后均勻混合，去除枯枝落葉等雜物后自然風干，過2 mm篩儲存于4℃冰箱用于培養(yǎng)實驗，其余過1 mm篩用于土壤理化性質(zhì)的測定。供試土壤pH 8.33，有機質(zhì)15.62 g kg-1，全氮1.29 g kg-1，全磷0.81 g kg-1，全鉀17.63 g kg-1，速效氮71.91 mg kg-1。

1.2　試驗設(shè)計

試驗采用室內(nèi)培養(yǎng)的方法，培養(yǎng)前測定土壤含水量，根據(jù)土壤含水量稱取過2 mm篩的鮮土（以10.00 g干土計）置于150ml的玻璃廣口瓶。試驗設(shè)計添加不同氮源的4個處理，分別為CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2，各3個重復(fù)，所加氮源濃度均為 N 100 mg kg-1，通過均勻添加超純水調(diào)節(jié)土壤水分含量至田間持水量（WHC）的60%，用保鮮膜將瓶口封住，用針頭在保鮮膜上扎5～6個小孔，使廣口瓶處于通氣狀態(tài)，將廣口瓶置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，并在培養(yǎng)過程中每隔3 d以稱重法補充蒸發(fā)損失的水分以保持土樣的水分含量恒定。在培養(yǎng)的第0、14、28天進行破壞性取樣，測定培養(yǎng)土樣的銨態(tài)氮、硝態(tài)氮，同時將剩余土樣保存于-20℃用于AOA和AOBamoA基因拷貝數(shù)測定及高通量測序。

1.3　項目分析與測定

pH采用玻璃電極測定（1∶2.5的土水比）；有機質(zhì)用重鉻酸鉀容量法測定；全氮用半微量凱氏法測定；全磷用鉬銻抗比色法測定；全鉀用火焰光度法測定；速效氮用堿水解法測定；銨態(tài)氮和硝態(tài)氮用靛酚藍比色法和紫外分光光度法 測定［20］。

土壤DNA的提?。罕緦嶒灢捎肍astDNA?SPIN Kit for soil（MP Biomedicals）試劑盒進行，分別稱取0.5 g從-20 ℃冰箱去取出的土樣，按試劑盒操作步驟進行，在Fsat PrepTMFP120核酸提取儀中以6 m s-1的速度裂解40 s，提取后的DNA在-20 ℃下保存，用于AOA和AOBamoA基因拷貝數(shù)的測定。

定量PCR分析：實時熒光定量PCR使用大連寶生物工程有限公司的SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒在CFX96 Optical Real-Time PCR System(Bio-Rad Laboratories, Hercules,CA)擴增儀上進行分析。PCR反應(yīng)總體系為20 μL，包含模版 DNA、上下游引物和 Taq DNA聚合酶。AOBamoA基因片段(491bp)上下引物分別為amoA-1F和amoA-2R［21］，AOAamoA基因片段(635bp)上下引物分別為archamoAF和arch-amoAR［22］。

AOB和AOAamoA功能基因及16S rRNA基因-Miseq 測序：（1）目的基因的擴增及純化。①將提取的DNA樣品分別用特異引物（amoA-1F和amoA-2R）、（arch-amoAF和arch-amoAR）及通用引物（515F和907R）進行擴增，每個樣本3個重復(fù)，DNA 水平的 PCR 擴增體系主要包括: 25 μL的SYBR@Premix EX TaqTM(TaKaRa 公司)，上下引物各1.0 μL，加入 1.0 μL的DNA 模板和20.5μL無菌水。PCR擴增條件均為：95℃，5 min；27 循環(huán)×（95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，45 s）；72 ℃，10 min；保持 4 ℃，得到PCR產(chǎn)物。②獲得土壤DNA水平的基因擴增產(chǎn)物后，將PCR 產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠，利用Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver. 2.0 試劑盒（Takara)純化，純化產(chǎn)物溶解于25 μL DNase-free H2O。③純化后的PCR 產(chǎn)物通過1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測純化效果，利用微量紫外分光光度計（NanoDrop ND-1000 UV-Vis）測定擴增產(chǎn)物的濃度。（2）進行Illumina PE250 文庫構(gòu)建，測序由上海美吉生物科技有限公司完成，amoA功能基因測序得到大于 1萬條的測序數(shù)據(jù)量，16S rRNA基因測序得到 大于3萬條的測序數(shù)據(jù)量。（3）數(shù)據(jù)處理：測序后提取出的數(shù)據(jù)以fastq 格式保存，數(shù)據(jù)每個樣本有 fq1 和 fq2兩個文件，里面為測序兩端的序列，序列按順序一一對應(yīng)。測序原始數(shù)據(jù)根據(jù)PE 序列之間的重疊關(guān)系，將成對的序列拼接，對序列中低質(zhì)量序列(＜50 bp)進行剔除，據(jù)序列首尾兩端的條碼和引物序 列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向。利用Usearch軟件按照＞97%進行OTU聚類分析，進行多樣性指數(shù)分析，基于分類學(xué)信息，可以在各個分類水平進行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計，進行一系列群落結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育等深入的統(tǒng)計學(xué)和可視化分析。

1.4　數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 18軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、AOB、AOAamoA基因拷貝數(shù)及AOB和NOB在屬水平上的百分比等在Excel中處理后采用Origin 8.1作圖，系統(tǒng)發(fā)育樹采用Mega 4.0等軟件完成。

2　結(jié) 果

2.1　土壤中NO3--N、NH4+-N含量的變化

土壤中NO3--N、NH4+-N在0 d和28 d的含量變化如圖1所示。CK、(NH4)2SO4、NH4C l和CO(NH2)2四種處理在0 d時的硝態(tài)氮含量分別為N 7.22、6.54、7.77和7.91 mg kg-1，經(jīng)過28 d培養(yǎng)后，土壤中硝態(tài)氮的累積量變?yōu)镹 31.40、115.2、101.3和122.5 mg kg-1，而銨態(tài)氮的變化由0 d時的N 5.91、95.95、95.86和93.98 mg kg-1減少為0.41、0.01、5.31和0.35 mg kg-1。與CK相比，(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2作為氮源加入后顯著促進了硝態(tài)氮的累積（p＜0.05），由圖1看出，NH4Cl處理中硝態(tài)氮的累積量在培養(yǎng)結(jié)束時，硝態(tài)氮的累積量顯著低于(NH4)2SO4和CO(NH2)2處理（p＜0.05），而銨態(tài)氮含量在28 d培養(yǎng)結(jié)束時，除NH4Cl處理外，CK、(NH4)2SO4和CO(NH2)2處理銨態(tài)氮含量均消耗殆盡，28 d結(jié)束時，NH4Cl處理中銨態(tài)氮的含量顯著高于其余處理（p＜0.05），與硝態(tài)氮含量變化相對應(yīng)。

圖1　土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量隨時間的變化Fig. 1 Variation of soil NO3- -N and NH4+-N contents with time

2.2　土壤氨氧化細菌（A O B）和氨氧化古菌（AOA）amoA基因拷貝數(shù)變化

AOB和AOAamoA基因拷貝數(shù)隨時間的變化如圖2所示。從圖2看出，CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2四種處理中AOBamoA基因拷貝數(shù)在培養(yǎng)過程中均呈顯著變化趨勢（p＜0.05），除NH4Cl處理外，CK、(NH4)2SO4和CO(NH2)2處理中AOB豐度均呈現(xiàn)出先顯著增加后顯著降低的趨勢（p＜0.05）。(NH4)2SO4和CO(NH2)2處理中AOB豐度在14 d時達到最大值，分別為3.38×107g-1干土和3.55×107g-1干土，到28 d減少至1.46×107g-1干土和1.69×107g-1干土，可能由于隨著底物濃度的消耗殆盡， AOB豐 度也隨之減少 。而NH4Cl處理中AOB豐度呈現(xiàn)增長趨勢，從圖2看出，在14 d時，NH4Cl處理的土壤A OB豐度顯著低于(NH4)2SO4和CO(NH2)2處理的土壤中AOB豐度（p＜0.05），而在28 d時，NH4Cl處理的土壤AOB豐度顯著高于(NH4)2SO4和CO(NH2)2處理土壤中AOB的豐度（p＜0.05），可能由于NH4Cl處理延緩了銨態(tài)氮的消耗，在培養(yǎng)過程中可以持續(xù)為AOB提供充分底物。由圖2 明顯看出CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2四種處理中AOAamoA基因拷貝數(shù)在培養(yǎng)過程中無顯著變化（p＞0.05）。

圖2　氨氧化細菌（AOB）和氨氧化古菌（ AOA）amoA基因拷貝數(shù)變化Fig. 2 Variation of number of amoA gene copies in ammonia oxidizing bacteria (AOB) and archaea（AOA）

2.3　土壤氨氧化細 菌（A O B）和氨氧化古菌（AOA）amoA功能基因系統(tǒng)進化

AOB和AOAamoA功能基因系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3和圖4所示。對amoA功能基因進行相似性分析，按照＞97%相似性進行OTU分類。石灰性紫色土AOBamoA功能基因在0 d和28 d的測序結(jié)果分析分別得到7個和8個OTU，系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2處理下AOBamoA功能基因類群均屬于Cluster 3 。分析發(fā) 現(xiàn)OTU 1所含序列占比最大，且CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2處理下的序列數(shù)占比由0 d時的14%、16%、15%和9%變?yōu)?8 d時的28%、79%、72%和76%，序列數(shù)顯著增加，且與Nitrosospirasp.Nsp2（AJ298719）有密切的親緣關(guān)系。而OTU 2 中CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2處理下的序列數(shù)占比下降幅度較大，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)與Nitrosolobusmultiformis（X90822）有密切的親緣關(guān)系。石灰石性紫色土AOAamoA功能基因在0 d和28 d的測序結(jié)果分析分別得到9個OTU，系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2處理下AOAamoA功能基因類群Group 1.1b占主要，說明石灰性紫色土中AOAamoA功能基因類群主要屬于Group 1.1b 。

圖3　石灰性紫色土AOB amoA功能基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of AOB amoA functional genes in the calcareous purple soil

圖4　石灰性紫色土AOA amoA功能基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of AOA amoA functional genes in the calcareous purple soil

2.4　硝化細菌群落組成

CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2四種處理在0 d時的樣本16S基因測序得到41 109、31 654、38 918和39 187條序列，28 d時的樣本16S基因測序得到36 212、33 822、32 807和40 295條序列。從所有序列挑出屬于AOB和NOB的序列，在屬水平上AOB和NOB序列占總序列的百分比如圖5所示。從圖5看出CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2四種處理在0 d時AOB分別占總序列的0.12%、0.08%、0.12%、0.13%，NOB分別占總序列的0.61%、0.58%、0 .60%、0.61%，經(jīng)過28 d培養(yǎng)過程，CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2四種處理中AOB分別占總序列的0.12%、0.28%、0.33%、0.20%，NOB分別占總序列的0.76%、1.14%、1.02%、1.26%，而且CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2四種處理下NOB占總序列的比例明顯高于AOB占總序列的比例。除CK外，添加氮源經(jīng)過28 d培養(yǎng)后，AOB和NOB占總序列的比例明顯增長。(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2處理中，經(jīng)過28 d培養(yǎng)，AOB和NOB占比相比于0 d分別增加3.50倍、2.75倍、1.54倍和1.97倍、1.70倍、2.07倍。

圖5　AOB和NOB屬水平占總微生物的百分比Fig. 5 Percentages of AOB and NOB in total number of microorganisms at the genus level

圖6　AOB和NOB在每個cluster的相對豐度Fig. 6 Relative abundanceof AOB and NOB in each cluster

AOB和NOB在每個cluster的相對豐度如圖6所示，從中得出，CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2四種處理中AOB主要以Nitrosospira為主，NOB主要以Nitrospira為主。0 d時，CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2四種處理中AOB的相對豐度分別為0.17、0.12、0.18、0.18，經(jīng)過28 d培養(yǎng)，AOB相對豐度分別為0.14、0.20、0.25、0.20，CK處理經(jīng)過28 d培養(yǎng)AOB的相對豐度有所下降，其余各處理的相對豐度有所上升。0 d時，CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2四種處理中NOB的相對豐度分別為0.83、0.88、0.82、0.82，經(jīng)過28 d培養(yǎng)，NOB 相對豐度變?yōu)?.87、0.80、0.75、0.82，其中NH4Cl處理中NOB的相對豐度有所下降。

3　討 論

本試驗供試土壤為石灰性紫色土，pH較高，與CK相比，(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2處理均刺激土壤硝化作用的發(fā)生。NH3是自養(yǎng)氨氧化微生物的唯一能量來源。土壤中H+的濃度決定了土壤中NH3的存在狀態(tài)，如果土壤中H+的濃度較高，那NH3以AOA和AOB不能利用的NH4+離子態(tài)存在。已有研究表明pH在4.8～8.5的范圍內(nèi)時，土壤 中硝化速率隨著pH的增加而增強［23-25］，這與前人研究一致［1］。但是三種不同底物之間的硝化作用強弱不一，其中NH4Cl處理延緩了 硝態(tài)氮的累積，抑制了銨態(tài)氮的減少，這可能是由于不同氮源引入了不同的陰離子，對土壤硝化作用產(chǎn)生了影響。前人研究表明，SO42-對硝化作用具有促進作用；Cl-對硝化作用的抑制效果也進一步被肯定［26］，可以降低氮素損失，就如同在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中施用硝化抑制劑 來有效降低土壤的硝化速率［27-28］，以提高氮肥利用率。

氨氧化作用是硝化作用的第一步，也是限速步驟，是全球氮循環(huán)的中心環(huán)節(jié)。AOA的發(fā)現(xiàn)為氨氧化作用的研究開啟了新方向［29］。大量研究表明AOB和AOA在不同生境的硝化作用中發(fā)揮著重要作用［30-31］。本試驗所用石灰性紫色土，pH大于7，amoA功能基因拷貝數(shù)變化表明，AOB的豐度在整個培養(yǎng)過程中變化顯著，而且與底物濃度變化相吻合，而AOA的豐度在CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2處理下均無顯著變化，說明AOB是石灰性紫色土硝化作用的主要推動者，這與高pH下土壤硝化作用主要由AOB主導(dǎo)的研究相一致［32］。堿性土壤中AOB較AOA更為活躍，AOB參與了13CO2的固定和氨氧化過程［33］。Shen等［12］的研究也表明施肥對堿性土壤中AOB的影響要大于對AOA的影響且AOB的豐度與pH（8.3～8.7）和土壤的潛在硝化勢顯著相關(guān)。本試驗借助實時熒光定量PCR技術(shù)，通過amoA功能基因拷貝數(shù)得出，NH4Cl處理的土壤中AOB的豐度在培養(yǎng)過程的第14天時顯著低于其他兩個處理（p＜ 0.05），而AOA在整個培養(yǎng)過程中的amoA基因拷貝數(shù)也低于其他兩種氮源處理，但差異不顯著（p＞ 0.05），這可能因為AOA主要在低pH、寡營養(yǎng)等環(huán)境的硝化作用中發(fā)揮作用［1］，因此在高pH的石灰性紫色土硝化作用中不起主導(dǎo)作用，進而氮源的加入對AOA并無明顯刺激，但amoA功能基因拷貝數(shù)變化暗示Cl-對AOB產(chǎn)生了抑制。Darrah等［34］在1985年運用Monod方程模擬氯化銨對硝化細菌的響應(yīng)得出，添加氯化銨N超過7.3 μmol g-1就產(chǎn)生抑制效果。蘇天明等［35］研究也得出了氯化銨的施用減少了亞硝酸細菌的數(shù)量，降低了硝酸鹽的含量。Jooste和van Leeuwen［36］關(guān)于含氯消毒劑對亞硝酸鹽累積的研究中得出了含氯消毒劑通過抑制亞硝酸氧化菌降低了硝酸鹽的積累。以上研究均表明了氯通過抑制硝化微生物進而抑制了硝酸鹽的累積。本試驗進化分析表明CK、(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2處理并未改變AOBamoA功能基因類群，屬于亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）Cluster 3 ，而AOAamoA功能基因類群主要是Group 1.1b ，這與許多重要研究結(jié)果相互印證［37］，為認識氨氧化微生物的關(guān)鍵驅(qū)動因子提供資料補充。

亞硝酸氧化是硝化作用的第二步，由NOB主導(dǎo)完成。由于氨氧化作用被認為是硝化作用的限速步驟，同時AOA的發(fā)現(xiàn)［29］以及NOB在實驗室環(huán)境中相比AOB和AOA更難生長［5］，因此多年來人們對硝化作用的研究主要集中在氨氧化作用。硝化微生物對底物的利用范圍十分有限，AOB、AOA和NOB共存于復(fù)雜的環(huán)境中，這意味著這些微生物對資源利用有不同的方式。最近一項驚奇的研究發(fā)現(xiàn)屬于硝化螺菌屬NitrosospiraSublineageⅡ的菌群能夠催化全程硝化作用，與其他硝化微生物不同的是，這類全程氨氧化微生物（Comammox）含有催化氨氧化和亞硝酸氧化的全部基因，且從已發(fā)表的宏基因組數(shù)據(jù)庫中分析發(fā)現(xiàn)這種全程氨氧化微生物廣泛分布于稻田和其他農(nóng)業(yè)土壤、森林土壤、稻田水域、淡水環(huán)境如濕地，河床，含水層和湖泊沉積物，以及工程系統(tǒng)（活性污泥和飲用水處理廠），ComammoxNitrospira是自然系統(tǒng)微生物群落中常見的硝化細菌［17-18］。全程氨氧化微生物的發(fā)現(xiàn)也符合單步硝化能夠釋放更多自由能的熱力學(xué)理論［5］。氨氧化微生物（AOM）將氨氧化為亞硝酸鹽能夠產(chǎn)生6個電子，較NOB將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽產(chǎn)生的電子多三倍，由于氨氧化微生物代謝時氨單加氧酶活化氨需要2個電子，因此氨氧化微生物每轉(zhuǎn)化一個單位的氮真正 釋放的能量實際上只比亞硝酸氧化細菌釋放的 能量多2倍，這就意味著環(huán)境中AOM的數(shù)量應(yīng)該較NOB多［38-40］。本試驗通過16S rRNA基因測序發(fā)現(xiàn)，土壤中NOB占總微生物的比例卻高于AOB占總微生物的比例，并且以Nitrospira為主，推測供試土壤可能存在全程氨氧化微生物，也可能NOB較AOB具有更高的生長和新陳代謝轉(zhuǎn)化速率。Wang等［41］利用13CO2穩(wěn)定性同位素標記技術(shù)對四種水稻土的培養(yǎng)試驗結(jié)果表明，被標記的Nitrospira豐度也遠高于AOB和AOA，這與我們的試驗結(jié)果相似。Daims等［5］認為相同環(huán)境中Nitrospira的豐度高于AOB和AOA預(yù)示著全程氨氧化微生物的存在。

4　結(jié) 論

(NH4)2SO4、NH4Cl和CO(NH2)2處理均刺激石灰性紫色土硝化作用的發(fā)生，但是相比于(NH4)2SO4和CO(NH2)2處理，NH4Cl處理延緩了硝態(tài)氮的累積，對硝化作用有抑制效果。石灰性紫色土硝化作用的主要推動者為AOB，但氯離子對AOB有抑制。石灰性紫色土中AOB的優(yōu)勢種群為NitrosospiraCluster 3，AOA的優(yōu)勢種群是Group 1.1b，NOB的優(yōu)勢種群為Nitrospira。石灰性紫色土中NOB占土壤總微生物的比例高于AOB，可能存在全程氨氧化微生物。

［ 1 ］ 賀紀正，張麗梅. 氨氧化微生物生態(tài)學(xué)與氮循環(huán)研究進展. 生態(tài)學(xué)報，20 09，29（1）：406—415 He J Z，Zhang L M.Advances in microbial ecology and nitrogen cycling in ammonia oxidation（In Chinese）.Acta Ecologica Sinica，2009，29（1）：406—415

［ 2 ］ 朱兆良. 農(nóng)田中氮肥的損失與對策. 土壤與環(huán)境，2000，9（1）：1—6 Zhu Z L. Loss of nitrogen fertilizer in farmland and countermeasures（In Chinese）. Soil and Environment，2000，9（1）：1—6

［ 3 ］ Ushiki N，Jinno M，F(xiàn)ujitani H，et al. Nitrite oxidation kinetics of twoNitrospirastrains：The quest for competition and ecological niche differentiation.Journal of Bioscience and Bioengineeri ng，2017，123（5）：581—589

［ 4 ］ Kowalchuk G A，Stephen J R. Ammonia—oxidizing bacteria：A model for molecular microbial ecology.Annual Reviews in Microbiology，2001，55（1）：485—529

［ 5 ］ Daims H，Lücker S，Wagner M. A new perspective on microbes formerly known as nitrite—oxidizing bacteria. Trends in Microbiology，2016，24（9）：699—712

［ 6 ］ Hyman M R，Arp D J.14C2H2and14CO2—labeling studies of the de novo synthesis of polypeptides byNitrosomonaseuropaeaduring recovery from acetylene and light inactivation of ammonia monooxygenase.Journal of Biological Chemistry，1992，267（3）：1534—1545

［ 7 ］ Francis C A，Beman J M，Kuypers M M M. New processes and players in the nitrogen cycle：The microbial ecology of anaerobic and archaeal ammonia oxidation. The ISME Journal，2007，1（1）：19—27

［ 8 ］ Prosser J I，Nicol G W. Relative contributions of archaea and bacteria to aerobic ammonia oxidation in the environment. Environmental Microbiology，2008，10（11）：2931—2941

［ 9 ］ Taylor A E，Zeglin L H，Wanzek T A，et al.Dynamics of ammonia—oxidizing archaea and bacteria populati ons and contributions to soil nitrification potentials. The ISME Journal，2012，6（11）：2024—2032

［10］ Jiang X J，Hou X Y，Zhou X，et al. pH regulates key players of nitrification in paddy soils. Soil Biology &Biochemistry，2015，81：9—16

［11］ He J Z，Shen J P，Zhang L M，et al. Quantitative analyses of the abundance and composition of ammonia—oxidizing bacteria and ammonia—oxidizing archaea of a Chinese upland red soil under long—term fertilization practices. Environmental Microbiology，2007，9（9）：2364—2374

［12］ Shen X Y，Zhang L M，Shen J P，et al. Nitrogen loading levels affect abundance and composition of soil ammonia oxidizing prokaryotes in semiarid temperate grassland. Journal of Soils and Sediments，2011，11（7）：1243—1252

［13］ 張星，林煒鐵，朱雅楠. 硝化細菌中亞硝酸鹽氧化還原酶的研究進展. 微生物學(xué)通報，2008，35（11）：1806—1810 Zhang X，Lin W T，Zhu Y N. Research progress of nitrite oxidoreductase in nitrifying bacteria（In Chinese）.Journal of Microbiology，2008，35（11）：1806—1810

［14］ Randall C W，Buth D. Nitrite build—up in activated sludge resulting from temperature effects. Water EnvironmentFederation，1984，56（9）：1039—1044

［15］ Smith R V，Doyle R M，Burns L C，et al. A model for nitrite accumulation in soils. Soil Biology &Biochemistry，1997，29（8）：1241—1247

［16］ Philips S，Laanbroek H J，Verstraete W. Origin，causes and effects of increased nitrite concentrations in aquatic environments. Reviews in Environmental Science and Biotechnology，2002，1（2）：115—141

［17］ Daims H，Lebedeva E V，Pjevac P，et al. Complete nitrification byNitrospirabacteria. Nature，2015，528（7583）：504—509

［18］ van Kessel M A H J，Speth D R，Albertsen M，et al. Complete nitrification by a single microorganism.Nature，2015，528（7583）：555—559

［19］ 佟德利，徐仁扣. 三種氮肥對紅壤硝化作用及酸化過程影響的研究. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2012，18（4）：853—859 Tong D L，Xu R K. Effects of three kinds of nitrogen fertilizer on nitrification and acidification of red soil（In Chinese）. Journal of Plant Nutrition and Fertilizer Science，2012，18（4）：853—859

［20］ 楊劍虹，王成林，代享林. 土壤農(nóng)化分析與環(huán)境監(jiān)測.北京：中國大地出版社，2008 Yang J H，Wang C L，Dai X L. Soil agrochemical analysis and environmental monitoring（In Chinese）.Beijing：China Earth Publishing House，2008

［21］ Beman J M，F(xiàn)rancis C A. Diversity of ammonia—oxidizing archaea and bacteria in the sediments of a hypernutrified subtropical estuary：Bahía del Tóbari，Mexico. Applied and Environmental Microbiology，2006，72（12）：7767—7777

［22］ Rotthauwe J H，Witzel K P，Liesack W. The ammonia monooxygenase structural gene amoA as a functional marker：Molecular fine—scale analysis of natural ammonia—oxidizing populations. Applied and Environmental Microbiology，1997，63（12）：4704—4712

［23］ Wood P M. Mechanisms for biological ammonia oxidation//Cole J A，F(xiàn)erguson S J. The nitrogen and sulphur cycles. UK：Cambridge University Press，1988：219—243

［24］ Killham K. Nitrification in coniferous forest soils.Plant and Soil，1990，128：31—44

［25］ Paul E A，Clack F E. Soil microbiology and biochemistry. San Diego：Academic Press，1989

［26］ 張樹蘭，楊學(xué)云，呂殿青，等. 溫度、水分及不同氮源對土壤硝化作用的影響. 生態(tài)學(xué)報，2002，22（12）：2147—2153 Zhang S L，Yang X Y，Lü D Q，et al. Effects of temperature，moisture and different nitrogen sources on nitrification in soil（In Chinese）. Acta Ecologica Sinica，2002，22（12）：2147—2153

［27］ McGeough K L，Watson C J，Müller C，et al.Evidence that the efficacy of the nitrification inhibitor dicyandiamide（DCD）is affected by soil properties in UK soils. Soil Biology & Biochemistry，2016，94：222—232

［28］ Guo Y J，Di H J，Cameron K C，et al. Effect of application rate of a nitrification inhibitor，dicyandiamide（DCD），on nitrification rate，and ammonia—oxidizing bacteria and archaea growth in a grazed pasture soil：An incubation study. Journal of Soils and Sediments，2014，14（5）：897—903

［29］ Leinin ger S，Urich T，Schloter M，et al. Archaea predominate among ammonia—oxidizing prokaryotes in soils. Nature，2006，442（7104）：806—809

［30］ Francis C A，Roberts K J，Beman J M，et al.Ubiquity and diversity of ammonia—oxidizing archaea in water columns and sediments of the ocean.Proceedings of the National Academy of Science，2005，102：14683—14688

［31］ Nugroho R A，R?ling W F M，van Straalen N M，et al. Changes in nitrification and bacterial community structure upon cross—inoculation of Scots pine forest soils with different initial nitrification rates. Soil Biology & Biochemistry，2009，41：243—250

［32］ Jia Z J，Conrad R. Bacteria rather than Archaea dominate microbial ammonia oxidation in an agricultural soil. Environment Microbiology，2009，11：1658—1671

［33］ Xia W，Zhang C，Zeng X，et al. Autotrophic growth of nitrifying community in an agricultural soil. The ISME Journal，2011，5（7）：1226—1236

［34］ Darrah P R，Nye P H，White R E. Modelling growth responses of soil nitrifiers to additions of ammonium sulphate and ammonium chloride. Plant and Soil，1985，86（3）：425—439

［35］ 蘇天明，顧明華，黎曉峰，等. 尿素配施氯化銨對菜薹硝酸鹽積累的影響. 中國蔬菜，2005（9）：7—9 Su T M，Gu M H，Li X F，et al.Effect of urea ammonium chloride on nitrate content inBrassica campestris（In C hinese）.Chinese Vegetables，2005（9 ）：7—9

［36］ Jooste S H J，van Leeuwen J. Induction of nitrite build—up in water by some common disinfectants.Water SA.，1993，19（2）：107—112

［37］ 賀紀正，張麗梅. 土壤氮素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵微生物過程及機制.微生物學(xué)通報，2013（1）：90—108 He J Z，Zhang L M.Key microbial processes and mechanisms of soil nitrogen transformation（In Chinese）. Microbiology China，2013（1）：90—108

［38］ Aleem M I H. Generation of reducing power in chemosynthesis III. Energy—linked reduction of pyridine nucleotides inThiobacillusnovellus. Journal of Bacteriology，1966，91（2）：729—736

［39］ Ferguson S J. Is a proton—pumping cytochrome oxidase essential for energy conservation inNitrobacter? Febs Letters，1982，146（2）：239—243

［40］ Hagopian D S，Riley J G. A closer look at the bacteriology of nitrification. Aquacultural Engineering，1998，18（4）：223—244

［41］ Wang B，Zhao J，Guo Z，et al. Differential contributions of ammonia oxidizers and nitrite oxidizers to nitrification in four paddy soils. The ISME Journal，2015，9（5）：1062—1075