鄭 虹,李莉娟,童秋霞,陳聯(lián)邦,王艷君,季瀟煒,鄧加聰,2,*

(1.福建師范大學(xué)福清分校，海洋與生化工程學(xué)院,福建福清 350300; 2.食品軟塑包裝技術(shù)福建省高校工程研究中心,福建福清 350300)

木聚糖是植物半纖維素的主要成分,在玉米芯、麥麩等農(nóng)副產(chǎn)品中含量豐富,約占植物細(xì)胞干重的15%～35%,是自然界中含量豐富的可再生資源之一。木聚糖酶(EC3.2.1.8)是降解木聚糖的一種復(fù)合酶,在多聚糖半纖維素的進(jìn)一步應(yīng)用起著極為重要的作用,在食品行業(yè)、造紙行業(yè)、飼料行業(yè)等都有廣泛的應(yīng)用[13]。因此,對木聚糖酶的開發(fā)研究具有廣闊的應(yīng)用前景和極大的商業(yè)價(jià)值。

木聚糖酶在自然界中分布廣泛,在微生物、植物、動(dòng)物等組織中廣泛存在,其中微生物是木聚糖酶的主要獲取途徑[45]。但由于產(chǎn)量低,成本高等,工業(yè)化生產(chǎn)木聚糖酶較為困難,篩選高產(chǎn)木聚糖酶的菌株是目前研究的關(guān)鍵。已報(bào)道的能產(chǎn)木聚糖酶的微生物主要有青霉[6]、曲霉[78]、放線菌[9]、芽孢桿菌[1011]等。林小洪等[12]篩選到一株同溫層芽孢桿菌B659,該菌株所產(chǎn)木聚糖酶的最適溫度和pH分別為55 ℃和6.5。侯潔[13]等從土壤中篩選到一株產(chǎn)酶較高的霉菌FH2213,對該木聚糖酶進(jìn)行酶學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)該酶的反應(yīng)溫度和pH分別為65 ℃和5.4。國內(nèi)外研究較多的主要在于霉菌所產(chǎn)木聚糖酶的研究,而對腸桿菌所產(chǎn)木聚糖酶的研究報(bào)道得較少。

本文從土樣中分離篩選高產(chǎn)木聚糖酶的菌株,并研究菌株所產(chǎn)木聚糖酶的酶學(xué)特性,為該菌株所產(chǎn)木聚糖酶的后期研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土樣 采集于福建師范大學(xué)福清分校后山黃瓜、西紅柿種植園的土壤;木聚糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、氯化鈉羧甲基纖維素鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉等試劑 均為分析純,購自國藥集團(tuán)有限公司；富集培養(yǎng)基(g/L):木聚糖 10,(NH4)2SO420,KH2PO42,pH7.0～7.2;分離培養(yǎng)基(g/L):木聚糖10,(NH4)2SO420,KH2PO42,瓊脂粉2.0,pH7.0～7.2。斜面培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏3,蛋白胨10,NaCl 5,瓊脂粉2.0,pH7.0～7.2;種子培養(yǎng)基(g/L):羧甲基纖維素鈉30,蛋白胨5,NaCl 5,pH7.0～7.2;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):羥甲基纖維素鈉20,KNO310,KH2PO40.5,Na2HPO40.5,MgSO4·7H20 0.5,pH7.0～7.2。

GSP9050MBE型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;THZC型振蕩培養(yǎng)箱 太倉市華美生化儀器廠;SWCJIFD型超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;LDZX40B1型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;BS224S型電子天平 賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;FA2204B型電子分析天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司;H1850R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)有限公司;DHG9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 木聚糖酶菌株的富集培養(yǎng) 取土樣1 g于100 mL富集培養(yǎng)基中,30 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h,進(jìn)行富集培養(yǎng)。

1.2.2 木聚糖酶菌株的分離及初篩 富集液按10倍稀釋法進(jìn)行稀釋,取10-6、10-7、10-83個(gè)稀釋度進(jìn)行涂布,30 ℃倒置培養(yǎng)48 h,挑取菌落大、生長快的單菌落接種于斜面培養(yǎng)基,培養(yǎng)后備用。

1.2.3 木聚糖酶菌株的復(fù)篩 將初篩得到的菌株接種于斜面培養(yǎng)基,30 ℃活化培養(yǎng)48 h,試管中加入10 mL無菌水,刮下菌苔,按5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,30 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h,測定發(fā)酵液的生物量OD600和木聚糖酶活力,挑取兩者均高的菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 木聚糖酶菌株的形態(tài)及生理生化鑒定 參考文獻(xiàn)[14]和[15]進(jìn)行形態(tài)及生理生化實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 高產(chǎn)木聚糖酶菌株RX9的16S rRNA序列分析 按常規(guī)堿提取法[16]提取菌株的基因組;以菌株基因組為模板,應(yīng)用細(xì)菌16S rRNA的通用引物(正向引物16sF:5′CAGAGTTTGATCCTGGCT3′,反向引物16sR:5′AGGAGGTGATCCAGCCGCA3′)擴(kuò)增菌株的16S rRNA,PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5×PCR buffer 2.5 μL、dNTP 1 μL、PCR引物各0.5 μL、Taq酶 0.5 μL、DNA模板1 μL,加滅菌雙蒸水至25 μL。PCR反應(yīng)條件:98 ℃、3 min;98 ℃、25 s,55 ℃、25 s,72 ℃、1 min,循環(huán)30次;延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

擴(kuò)增得到的16S rRNA序列送上海生工進(jìn)行測序。測得的16S rRNA序列與NCBI網(wǎng)站的GenBank中的序列進(jìn)行比對,隨機(jī)挑取若干條同源性較高的序列,運(yùn)用軟件MEGA4.0 Bootstrap Test of Phylogeny的NJ算法(Bootstrap 參數(shù)為1000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育的分析。

1.2.6 菌株產(chǎn)木聚糖酶的酶學(xué)特性研究 發(fā)酵液8000 r/min下離心5 min,收集上清液,備用。

1.2.6.1 溫度對酶活的影響 取5 mL左右上清液在不同溫度(20、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃)下保溫30 min,測定處理液的酶活。

1.2.6.2 pH對酶活的影響 取5 mL上清液用0.5 mol/L的鹽酸溶液或0.5 mol/L的NaOH溶液調(diào)至不同pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10),在室溫下放置30 min,測定處理液的酶活。

1.2.7 木聚糖酶活力測定 木聚糖酶酶活測定采用DNS法[17]。取0.4 mL經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液(酶液的稀釋倍數(shù)為25倍),加入3.6 mL 0.1%的木聚糖底物溶液(pH9.0)混勻,50 ℃水浴恒溫反應(yīng)15 min,立即向試管中加入3 mL DNS試劑并混勻終止反應(yīng),然后在沸水中煮沸10 min,冷卻后加水定容至50 mL,充分搖勻,以滅活酶液做對照,測量樣品540 nm波長處的吸光度。

酶活單位定義為:以木聚糖為底物,每分鐘釋放1 μmol相當(dāng)于木糖的還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位(U)。

酶活力(U/mL)=W×1000/M×T×V×N

其中,W:木糖量(mg),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求得;M:木糖分子量(g/mol),150.13;T:反應(yīng)時(shí)間(min);V:酶用量(mL);N為稀釋倍數(shù)，此處為25。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Excel和DPS軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶產(chǎn)生菌的分離與初篩

通過富集培養(yǎng)、稀釋涂布、平板劃線等方法,從土壤中分離篩選到10株菌落大、生長快的菌株,編號為RX1、RX2、RX3、RX4、RX5、RX6、RX7、RX8、RX9、RX10。菌株RX9的單菌落見圖1。

圖1 木聚糖酶產(chǎn)生菌的初篩Fig.1 Screening of xylanase producing strain

2.2 高產(chǎn)木聚糖酶菌株的復(fù)篩

由圖2可見,不同菌株所產(chǎn)木聚糖酶的活力各不相同,初篩得到的10株菌株的產(chǎn)酶能力如下:RX9>RX3>RX7>RX8>RX2>RX10>RX6>RX4>RX5>RX1;從生物量上看,可以發(fā)現(xiàn)RX9、RX3、RX7、RX2、RX10等菌株發(fā)酵液的OD600較高,說明菌株生物量較高,其中菌株RX9的生物量和所產(chǎn)堿性木聚糖酶的酶活均達(dá)到最高,分別為0.17和3263.65 U/mL。綜合以上兩點(diǎn)菌株RX9做為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的初始菌株。

圖2 不同菌株的木聚糖酶活力Fig.2 Xylanase activity of different strains

2.3 菌株RX9的菌株形態(tài)及生理生化鑒定

菌株RX9的菌株形態(tài)及部分生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3、表1。

圖3 菌株RX9形態(tài)觀察Fig.3 The morphology of strain RX9

由圖3可見,菌株RX9的菌落為白色、圓形較小,邊緣及表面光滑濕潤,菌落不透明,隆起無褶皺。鏡檢發(fā)現(xiàn)菌體短桿狀,革蘭氏染色為陰性。

由表1結(jié)果可見,菌株RX9甲基紅反應(yīng)陽性,VP測定呈陰性,檸檬酸鹽利用、碳源利用、氮源利用呈陽性,丙二酸利用為陰性,能還原亞硝酸鹽。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》及菌株菌落形態(tài)及鏡檢結(jié)果,初步鑒定該菌株為腸桿菌屬(Enterobacter)。

表1 菌株RX9生理生化實(shí)驗(yàn)Table 1 Physiological and biochemical of strain RX9

2.4 菌株RX9的分子遺傳學(xué)分析

2.4.1 菌株RX9的16S rRNA基因擴(kuò)增 將提取到的菌株基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)電泳得知該擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1456 bp的16S rRNA基因,結(jié)果見圖4。

圖4 菌株RX9 16S rRNA基因擴(kuò)增Fig.4 Amplification of 16S rRNA gene for strain RX9 注：M：標(biāo)準(zhǔn)Marker；1：菌株RX916S rRNA。

2.4.2 16S rRNA的測序和遺傳分析 將所得到的16S rRNA基因序列進(jìn)行測序,測序后,與NCBI網(wǎng)站上的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行在線序列同源性比對,結(jié)果顯示該菌株的序列與Enterbacter(腸桿菌屬)的多株菌具有99%以上的同源性。隨機(jī)抽取序列比對后的若干個(gè)序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建,結(jié)果見圖5。括號內(nèi)的編號為各菌株16S rRNA在Genbank中的登錄號。

圖5 菌株RX9的序列分析Fig.5 Sequence analysis of strain RX9

從圖5可見,菌株RX9與登錄號EF030721、EU301774、FJ668829等菌株16S rRNA序列的同源性達(dá)到99%。因此,在細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分類學(xué)上,將該菌株歸屬為腸桿菌屬(Enterbacter),命名為EnterbacterRX9。

2.5 木聚糖酶酶學(xué)特性研究

2.5.1 溫度對木聚糖酶酶活的影響 由圖6可見,木聚糖酶的活性隨溫度的增加呈先增后降的趨勢,在20～100 ℃范圍內(nèi),木聚糖酶的相對酶活在70%以上;木聚糖酶的最適溫度是50 ℃,其木聚糖酶的活性可高達(dá)3249.58 U/mL;在100 ℃下保溫30 min,仍具有2310.03 U/mL的酶活,表明該菌株所產(chǎn)的木聚糖酶具有良好的耐溫性。據(jù)侯潔[13]和吳仁智[18]等報(bào)道,多數(shù)霉菌所產(chǎn)木聚糖酶的最適溫度都在55 ℃以上。

圖6 溫度對木聚糖酶活力的影響Fig.6 Effect of temperature on xylanase activity

2.5.2 pH對木聚糖酶酶活的影響 由圖7可見,菌株RX9所產(chǎn)木聚糖酶的活性pH范圍較廣,pH在5.5～10之間,都保持有一定的活力,木聚糖酶的活性隨pH的增加呈先增后減的趨勢,當(dāng)pH在7.5～9.5之間,木聚糖酶的活性基本穩(wěn)定在3200 U/mL以上,當(dāng)pH為9.0時(shí),酶活力達(dá)到最大值為3574.00 U/mL,而pH9.5之后酶活力開始下降，表明該菌株所產(chǎn)木聚糖酶具有良好pH穩(wěn)定性。

圖7 pH對木聚糖酶活力的影響Fig.7 Effect of pH on xylanase activity

3 結(jié)論

通過富集培養(yǎng)、稀釋涂布、平板劃線等方法,從土壤中分離篩選到一株高產(chǎn)木聚糖酶的菌株RX9;對菌株RX9進(jìn)行菌落形態(tài)、生理生化實(shí)驗(yàn)及16S rRNA序列遺傳分析,該菌株的序列與Enterbacter(腸桿菌屬)的多株菌具有99%以上的同源性,將該菌株歸屬為腸桿菌屬(Enterbacter),命名為EnterbacterRX9。

研究溫度和pH對菌株RX9所產(chǎn)木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì),發(fā)現(xiàn)木聚糖酶在20～100 ℃下保溫30 min,仍具有70%以上的酶活性,在100 ℃下保溫30 min,其酶活力仍達(dá)到2310.03 U/mL,表明該菌株所產(chǎn)的木聚糖酶具有良好的耐溫性;而該酶在pH在5.5～10之間,都保持有一定的活力,木聚糖酶的活性隨pH的增加呈先增后減的趨勢,當(dāng)pH在7.5～9.5之間,木聚糖酶的活性基本穩(wěn)定在3200 U/mL以上,當(dāng)pH為9.0時(shí),酶活力達(dá)到最大值為3574.00 U/mL,而pH9.5之后酶活力開始下降。表明該菌株所產(chǎn)木聚糖酶具有良好的熱穩(wěn)定和pH穩(wěn)定性。

[1]陳洪洋,蔡俊,林建國,等.木聚糖酶的研究進(jìn)展[J].中國釀造,2016,35(11):16.

[2]雷潔瓊.木聚糖酶的研究進(jìn)展和應(yīng)用[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志,2016,46(2):5054.

[3]高雅君,丁長河.木聚糖酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].2017,24(2):3236.

[4]何敏超,張宇,許敬亮,等.木聚糖酶高產(chǎn)菌株篩選研究進(jìn)展[J].化工進(jìn)展,2013,32(1):145150.

[5]高艷秀,陳復(fù)生,丁長河.微生物木聚糖酶及其應(yīng)用[J]. 中國釀造,2012,31(3):1012.

[6]楊紹青,閏巧娟,江正強(qiáng),等. 嗜熱擬青霉固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶條件的優(yōu)化[J]. 微生物學(xué)通報(bào),2006(3):16.

[7]孫婕,郁惠蕾,李春秀,等.一株高產(chǎn)木聚糖酶真菌的篩選及酶學(xué)性質(zhì)分析[J].生物加工過程,2013,11(1):3540.

[8]李愛軍,蔣文明,歐仕益,等.黑曲霉ATCC16404固體發(fā)酵豆皮產(chǎn)生木聚糖酶的研究[J].食品工業(yè)科技,2011,32(11):261265.

[9]梁方方,莫毅,楊琳,等.木聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 飼料研究,2011(3):4547

[10]高志強(qiáng),李茜,徐岳松,等.高產(chǎn)木聚糖酶細(xì)菌的篩選、鑒定及其部分酶學(xué)特性[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2017,23(3):443447.

[11]易旭東,潘虎,田云,等.一株堿性木聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2017,33(17):1218.

[12]林小洪,葉秀云,王國增,等.產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].中國食品學(xué)報(bào),2016,16(1):115122.

[13]侯潔,李琴,李秀婷,等.產(chǎn)木聚糖酶霉菌發(fā)酵條件優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].食品工業(yè),2016,37(10):130134.

[14]東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學(xué)出版社，2001:349387.

[15]布坎南,吉本斯.伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M].北京:科學(xué)出版社.1984:382473.

[16]魏群.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:高等教育出版社.2005:5662.

[17]王俊麗,聶國興,曹香林,等.不同DNS試劑測定木糖含量的研究[J].食品研究與開發(fā),2010,31(7):14.

[18]吳仁智,黃俊,蘆志龍,等.里氏木霉和黑曲霉產(chǎn)酸性木聚糖酶及酶學(xué)特性比較[J].廣西科學(xué),2014,24(1):112119.