桑亞通，沈丹，陳偉，產(chǎn)舒恒，顧浩，高波，宋成義

揚州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇 揚州　225009

增強子是能強化轉(zhuǎn)錄起始的一段DNA序列，最早是由Benerji在SV40DNA中發(fā)現(xiàn)[1]，隨后在病毒及真核生物基因組中均發(fā)現(xiàn)了增強子元件的存在。已有研究表明增強子在基因表達調(diào)控中通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子與靶基因的結(jié)合，參與基因的表達調(diào)控，發(fā)揮重要作用。與啟動子不同的是，增強子對基因的調(diào)控不具有方向性，且不受兩者距離的影響，無論位于基因的上游或下游，甚至基因的內(nèi)含子中，均可調(diào)控靶基因的表達[2-3]。因此，增強子的獲得對于研究基因表達調(diào)控模式具有重要意義，但傳統(tǒng)方法進行增強子注解效率低下。研究證實增強子捕獲技術(shù)是一種有效的增強子注釋方法[4]，最早在 1979年 Casadaban等以LacZ為目的基因，將一個啟動子缺失的乳糖操縱子載體通過噬菌體感染隨機整合到大腸桿菌基因組上，最終獲得了一些特異性表達的基因[5]。受此研究啟發(fā)，研究人員對啟動子捕獲載體進行改造，將一個報告基因和最小啟動子融合取代缺失啟動子的報告基因，該啟動子不能單獨驅(qū)動報告基因的表達，而當插入位點附近存在增強子元件時，則啟動子被激活從而驅(qū)動報告基因的表達，這種方法即為增強子捕獲。首個轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的增強子捕獲載體是基于P轉(zhuǎn)座子設(shè)計的，以β-半乳糖苷酶基因為報告基因，成功應(yīng)用于果蠅的增強子捕獲研究[6]。之后，轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)增強子捕獲技術(shù)廣泛應(yīng)用于各種動物的增強子研究。Grabher等[7]在青中成功應(yīng)用了以轉(zhuǎn)座子為介導(dǎo)的增強子捕獲技術(shù)，Balciunas等[8]利用SB轉(zhuǎn)座子，在斑馬魚中進行增強子捕獲研究，獲得了9種具有不同的組織或器官特異性GFP表達模式的斑馬魚品系。除此之外，研究人員對增強子捕獲系統(tǒng)進行改進，利用酵母雙元雜交系統(tǒng) (Gal4-UAS) 進行增強子捕獲。目前，二元的Gal4-UAS系統(tǒng)也已經(jīng)成功應(yīng)用于斑馬魚和果蠅的增強子捕獲研究[9-11]。

斑馬魚作為研究脊椎動物的模型，具有養(yǎng)殖方便、繁殖周期短、產(chǎn)卵量大、胚胎體外受精、體外發(fā)育、胚體透明等優(yōu)點，已成為生命科學(xué)研究的重要工具。近年來，Tol2轉(zhuǎn)座子已成功應(yīng)用于斑馬魚的增強子捕獲研究[12]。本研究通過sp-PCR、原位雜交和比較基因組學(xué)等技術(shù)手段對本實驗室已經(jīng)建立的Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的增強子捕獲品系 (TK4) 進行鑒定，以期解析所捕獲的增強子。

1　材料與方法

1.1　材料

Tuebingen斑馬魚購自國家斑馬魚資源中心；Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的增強子捕獲轉(zhuǎn)基因斑馬魚 F1代TK4系為本實驗室制備。

基因組提取試劑盒、純化試劑盒、切膠回收試劑盒購自寶生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶Sau3AⅠ、T4 DNA連接酶、退火緩沖液均購自NEB有限公司；無RNA酶DNaseⅠ、RNAsein、NaOH、鏈酶蛋白酶、多聚甲醛、PTU、HEPES、Tween20、tRNA、肝素鈉、苯酚、氯仿、HCl、BCIP、NBT等購自Sigma公司；地高辛標記RNA混合液、蛋白酶 K、羊抗地高辛標記物抗體等購自Roche公司；轉(zhuǎn)錄緩沖液、T7 RNA聚合酶等購自Promega公司；去離子甲酰胺購自CarloErba；羊血清、無水甲醇、NaCl、KCl、MgCl2、無水乙醇等購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2　TK4系斑馬魚的來源與熒光檢測

TK4系由本實驗室前期通過Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)制備的穩(wěn)定增強子捕獲品系F1代，該轉(zhuǎn)基因增強子捕獲載體中含一個 krt4 (keratin4) 迷你啟動子和GFP表達盒 (圖1A)。將TK4系與TU系野生型斑馬魚進行交配，獲得F2代胚胎，在E3溶液中培養(yǎng)至特定的發(fā)育時期以備熒光檢測。在體式熒光顯微鏡 (M165FC,Lecia,德國) 下觀察不同時期的胚胎GFP的表達并做好記錄。本實驗中觀察的胚胎GFP的表達時期分別是6 hpf、24 hpf、48 hpf、3 dpf、4 dpf、5 dpf。

1.3　轉(zhuǎn)基因在基因組上插入位點鑒定

參照文獻[13]，通過sp-PCR進行轉(zhuǎn)基因在基因組上插入位點鑒定。首先根據(jù)轉(zhuǎn)座元件序列設(shè)計兩輪PCR引物，接頭序列參考文獻[13]，引物序列及接頭序列如表1所示。然后進行sp-PCR，具體步驟如下：采用 TaKaRa的基因組提取試劑盒提取飼養(yǎng) 20 d的 F2代斑馬魚的基因組，用Sau3AⅠ對基因組進行酶切，以產(chǎn)生 GATC末端進行后續(xù)接頭連接。50 μL反應(yīng)體系為：基因組DNA 5 μL，10×NEB 緩沖液 5 μL，Sau3AⅠ3 μL，雙蒸水補齊至50 μL。將反應(yīng)體系置于37 ℃過夜處理，之后用DNA片段純化試劑盒 (TaKaRa公司) 進行純化并用45 μL雙蒸水洗脫。接頭連接50 μL 體系包括：基因組酶切 37 μL，10× T4 DNA連接酶緩沖液5 μL，接頭6 μL，T4 DNA連接酶(400 U/μL) 2 μL；連接反應(yīng)條件：16 ℃，16 h。其中，使用 SPLNK-BOT 2 μL，SPLNK-GATC-TOP 2 μL，退火緩沖液46 μL進行接頭合成。反應(yīng)程序為95 ℃、3 min；自然降至室溫。之后進行兩輪PCR，其中第一輪PCR體系 (50 μL) 為：連接基因組 DNA 10 μL，雙蒸水 11 μL，2×Taqmix 25 μL，SPLINK 1 2 μL，Tol2/ SP1R 2 μL。PCR 擴增程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃2 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。第二輪PCR體系 (50 μL) 為：第一輪 PCR 產(chǎn)物1 μL，雙蒸水 20 μL，2×Taqmix 25 μL，SPLINK 2 2 μL，Tol2/SP2R 2 μL。PCR 擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35 個循環(huán)；最后 72 ℃延伸 10 min。反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物在 1.2%瓊脂糖凝膠電泳中進行電泳檢測并切膠回收，測序。

1.4　增強子注解

將測序獲得的染色體側(cè)翼 DNA序列通過BLASTN與 ENSEMBL的斑馬魚基因組數(shù)據(jù)庫(GRCz10) 進行比對。為了檢測整合位點附近的增強子元件，再從Ensembl瀏覽器上下載斑馬魚Danio rerio、青Oryzias latipes、東方紅鰭Takifugu rubripes、秀美花Poecilia formosa、羅非魚Oreochromis niloticus、矛尾魚 Latimeria chalumnae、非洲爪蟾Xenopus tropicalis、雞Gallus gallus、大鼠Rattus norvegicus、小鼠Mus musculus、人Homo sapiens的整合位點側(cè)翼序列上下游各50 kb區(qū)域的基因組序列 (www.ensembl.org)，并將所得到的序列進行比對分析 (http://genome.lbl.gov/vista/mvista/submit.shtml)。

1.5　原位雜交

根據(jù)插入位點處的內(nèi)源基因rps26編碼序列設(shè)計反義RNA原位雜交探針，探針rps26-001以及探針rps26-201引物序列 (表2)。采用地高辛和T7 RNA聚合酶標記合成反義RNA探針。參考文獻[14]進行斑馬魚胚胎原位雜交，通過體式顯微鏡 (M165FC，Lecia，德國) 采集圖片。

2　結(jié)果與分析

2.1　F2代胚胎不同發(fā)育時期GFP表達

將 TK4系F1與TU系斑馬魚進行雜交，收集胚胎于 E3培養(yǎng)液中培養(yǎng)至特定的發(fā)育時期進行觀察并拍照記錄。結(jié)果如圖1所示，在胚胎發(fā)育至6 hpf未觀察到GFP表達 (圖 1B)，在胚胎發(fā)育至24 hpf時觀察到GFP表達，表達部位主要集中于頭部和軀干 (圖 1C)。隨著發(fā)育時間的延長，組織器官逐漸分化，48 hpf時GFP表達部位主要集中于頭部、眼睛、下頜、脊髓和肌肉等(圖 1D)。從 48 hpf發(fā)育至 5 dpf，GFP表達部位基本穩(wěn)定，主要集中于中腦、后腦、眼睛、下頜和脊髓，肌肉的GFP熒光表達強度逐漸減弱(圖 1E–G)。

表1　sp-PCR引物序列與接頭序列[13]Table 1　sp-PCR primers and linker sequences[13]

表2　探針rps26-001與rps26-201引物序列Table 2　Probe rps26-001and rps26-201 primer sequences

圖1　TK4增強子捕獲轉(zhuǎn)基因斑馬魚不同發(fā)育時期的熒光表達情況 (A：TK4增強子捕獲品系轉(zhuǎn)基因構(gòu)件示意圖；B–G為不同發(fā)育階段胚胎熒光檢測)Fig. 1　GFP-expression of TK4 enhancer trapping transgenic zebrafish at different developmental stages. (A)Transgenic components of TK4 enhancer trapping line. (B–G) GFP-expression at different developmental stages.

2.2　增強子捕獲轉(zhuǎn)基因斑馬魚的增強子注解

將測序結(jié)果中得到的Tol2轉(zhuǎn)座子插入位點的側(cè)翼DNA序列在ENSEMBL的斑馬魚基因組數(shù)據(jù)庫 (GRCz10) 中進行比對，結(jié)果顯示捕獲載體插入23號染色體rps26基因的intron1中，且報告基因的插入方向與rps26基因的方向相反。從Ensembl瀏覽器上下載斑馬魚、青、東方紅鰭、秀美花、羅非魚、矛尾魚、非洲爪蟾、雞、大鼠、小鼠、人的插入位點側(cè)翼序列上下游各 50 kb區(qū)域的同源基因組序列以及注解文件，并將所得到的序列進行比對分析，結(jié)果如圖 2所示，載體插入位置為黑色箭頭所指。在100 kb的基因組范圍內(nèi)有 7個基因，分別為arf3a、wnt10b、wnt1、rps26、IKZF4、dnajc22和lmbr1l。在rps26基因的下游有2個CNS，其中CNS1較CNS2相似序列的保守度 (Identity)更高，相似序列的寬度 (Width) 更廣，并且這兩個元件在真骨魚類 (青、東方紅鰭、秀美花和羅非魚) 中高度保守，但是在兩棲類 (非洲爪蟾)、鳥類 (雞) 和哺乳類 (小鼠、大鼠和人)中均不保守。結(jié)果提示這兩個CNS可能為潛在的增強子。

圖2　插入位點側(cè)翼區(qū)比較基因組學(xué)分析Fig. 2　Comparative genomic analysis of the flank sequences of the insertion site. Dr: Danio rerio; Tr: Takifugu rubripes; Ol: Oryzias latipes; Pf: Poecilia formosa; On: Oreochromis niloticus; Lc: Latimeria chalumnae; Xt: Xenopus tropicalis; Gg: Gallus gallus; Rn: Rattus norvegicus; Mm: Mus musculus; Hs: Homo sapiens; UTR: untranslated region;CNS: conserved non-coding sequence.

2.3　原位雜交

由于載體的插入位點是在rps26基因的1號內(nèi)含子中，為了驗證TK4的GFP表達模式是否與rps26基因表達模式一致，進行了受精至3 dpf斑馬魚早期胚胎原位雜交實驗。斑馬魚rps26基因存在兩個可變剪切轉(zhuǎn)錄本，分別為rps26-001和rps26-201，根據(jù)這兩個轉(zhuǎn)錄本分別設(shè)計原位雜交探針，檢測rps26基因在斑馬魚早期胚胎中的表達特性。結(jié)果顯示，兩個轉(zhuǎn)錄本在單細胞受精卵中 (0.2 hpf) 已經(jīng)啟動表達，提示存在母源性表達；而rps26-001在0.75 hpf時表達有所減弱，至4 hpf時表達又開始增強，rps26-201在 0.75 hpf表達明顯高于rps26-001，表明rps26-201的表達啟動要早于rps26-001；在4 hpf至48 hpf的發(fā)育過程中兩個轉(zhuǎn)錄本均有表達；在發(fā)育至24 hpf時，表達呈現(xiàn)全身性的特點，無明顯組織和細胞特異性，而發(fā)育至48 hpf時，表達部位主要集中于頭部及中腦，呈現(xiàn)明顯的組織特異性；發(fā)育至3 dpf時，組織特異性表達更加明顯，主要集中于中腦-后腦連接處、眼眶以及原腎管等部位表達，各階段rps26-201的表達信號要高于rps26-001。rps26-001和rps26-201的表達在早期胚胎 (受精至24 hpf)中呈現(xiàn)無明顯組織和細胞特異性，且啟動較早，而GFP在6 hpf時尚無表達信號，至24 hpf則呈現(xiàn)一定的組織特異性，兩者并不一致，但后期rps26-001和rps26-201的表達與GFP表達模式部分相似，包括主要集中在腦部，特別是中腦信號比較強。

圖3　rps26-001和rps26-201轉(zhuǎn)錄本在不同發(fā)育階段斑馬魚胚胎中原位雜交Fig. 3　In situ hybridization for rps26-001和rps26-201 transcripts at different stages of zebrafish embryos.

3　討論

轉(zhuǎn)座子是在基因組內(nèi)可自主移動的一段DNA序列，最早是由 McClintock在研究玉米籽粒顏色遺傳時發(fā)現(xiàn)的[15]。而Tol2轉(zhuǎn)座子則是由Koga等在研究白化青魚時發(fā)現(xiàn)[16]，屬于 hAT轉(zhuǎn)座子超家族。目前，Tol2轉(zhuǎn)座子因其可攜帶較長的插入片段等優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于斑馬魚、爪蟾、雞和小鼠等模式脊椎動物的研究中[12,17–19]。最近研究表明，Tol2轉(zhuǎn)座子已成功應(yīng)用于斑馬魚的功能基因[20]和增強子捕獲[21-23]的研究中。傳統(tǒng)的增強子捕獲技術(shù)需要耗費大量的人力物力，為了分離到單性狀的個體，需要制備大規(guī)模的G3代突變?nèi)后w，除此之外，傳統(tǒng)方法很難分離得到增強子。目前在斑馬魚上進行增強子捕獲研究最有效的方法是利用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的增強子捕獲技術(shù)，這一技術(shù)為研究相關(guān)基因的調(diào)控模式提供了很好的工具。近年來，利用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的增強子捕獲技術(shù)獲得插入突變體庫進而對相關(guān)器官功能、疾病等的研究已取得較大進展。Parinov等[12]利用Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)斑馬魚增強子捕獲技術(shù)，建立突變品系，研究斑馬魚發(fā)育的相關(guān)功能基因。Xue等[24]通過Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的大規(guī)模增強子誘捕篩選到 26個血管特異表達綠色熒光蛋白(EGFP) 報告基因的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系，其中有一些品系在胚胎的某些特異血管結(jié)構(gòu)中表達綠色熒光蛋白。最終獲得EGFP報告基因受hhex或ets1a基因增強子控制的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，而hhex和ets1a基因?qū)ρ芘c血細胞前體的發(fā)育具有重要作用，因此，該品系為深入研究這兩個基因在血管與血液發(fā)育中的作用機制提供了新的機遇。Huang等[25]利用Tol2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)介導(dǎo)的增強子捕獲技術(shù)構(gòu)建得到了心肌特異性表達GFP的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，且在心房和房室管中觀察到了特異性表達的GFP。

本課題組采用Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的增強子捕獲技術(shù)獲得了大量斑馬魚插入突變體，通過報告基因GFP可確定捕獲的增強子和內(nèi)源基因時空表達特性，大大提高了篩選效率。我們已通過表型篩選建立了若干個突變品系，本研究所用的TK4系斑馬魚表型為頭部和軀干具有較為明顯的GFP表達，通過 sp-PCR的方法成功地克隆到了Tol2轉(zhuǎn)座子插入位點的側(cè)翼基因組序列，揭示了TK4系的插入位點是rps26基因的1號內(nèi)含子，并且報告基因的插入方向與基因相反。同時結(jié)合比較基因組學(xué)手段，通過跟其他物種進行同源比對，發(fā)現(xiàn)在rps26基因下游有2個潛在的增強子信號(CNS1和CNS2)，其中CNS1較為明顯，在魚類中保守性較強。在 CNS1的上下游有很多基因，包括arf3a、wnt10b、wnt1、rps26、IKZF4、dnajc22和lmbr1l。已有研究表明，Wnt1在小鼠的中腦和前后腦的形成中起重要作用，在斑馬魚中需要wnt1和wnt10b來維持中腦和后腦連接處的Pax2.1和Fgf8的閾值水平[26]。rps26基因編碼的核糖體蛋白就是核糖體小亞基40S的組成部分，該蛋白屬于rps26e核糖體蛋白家族[27]。IKZF4也稱轉(zhuǎn)錄因子Eos，是鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子ikaros家族中的一員。作為負性調(diào)節(jié)因子可以參與許多基因的表達調(diào)控[28]。有研究表明，Eos位于細胞核中，在中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中扮演重要角色[29]。Eos對淋巴系細胞發(fā)育和形成過程也有重要作用[30]。dnajc22作為果蠅wurst基因的同源物，目前研究較少，而果蠅wurst基因編碼一種 J結(jié)構(gòu)域跨膜蛋白，該蛋白是果蠅氣管尺寸和氣道清除的必要調(diào)節(jié)因子[31]。對于基因arf3a和lmbr1l的功能及其表達特性，目前尚未見報道。目前關(guān)于這些基因的表達調(diào)控機理也尚未見報道。而該品系的建立及注釋對于進一步研究這些基因的功能特點及其表達調(diào)控機制提供了很好的模式動物。Gharbi等[32]所捕獲的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系中，通過原位雜交驗證了捕獲的內(nèi)源性基因kctd15a與轉(zhuǎn)基因斑馬魚熒光蛋白表達模式基本一致，而且在后期的發(fā)育過程中也有著相似的時空表達特征。在 Liu等[4]所捕獲的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系中，通過對EGFP和捕獲的內(nèi)源性基因設(shè)計反義 RNA探針來檢測內(nèi)源性基因的表達模式比較，發(fā)現(xiàn)EGFP的表達模式與所捕獲到的內(nèi)源性基因基本一致。在劉帥軍等[33]所捕獲的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系中，通過原位雜交驗證了捕獲的內(nèi)源性基因denraa與轉(zhuǎn)基因斑馬魚GFP表達模式基本一致。而本研究中通過比較TK4的GFP表達模式與rps26基因原位雜交結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩者表達模式存在相似之處，但也并不完全一致，提示兩者可能既接受共同的增強子調(diào)控，但也存在不同增強子調(diào)控，所獲得的 2個潛在的增強子 (CNS1和 CNS2) 可能對附近的基因 (包括rps26) 發(fā)揮差異的時空表達調(diào)控作用，但需進一步深入研究驗證。

4　結(jié)論

本研究首次獲得了rps26基因的2個潛在增強子調(diào)控元件，揭示了rps26基因表達特性及其與潛在增強子調(diào)控的可能聯(lián)系。研究結(jié)果為深入理解和研究rps26基因調(diào)控機制提供重要參考；同時本研究所嘗試的增強子研究綜合技術(shù)手段(包括轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的增強子捕獲、sp-PCR、比較基因組學(xué)和原位雜交等) 也為后基因組學(xué)時代解析基因表達調(diào)控提供方法參考。

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