姜　鑫，　劉　帥，　徐宏建，　張永根

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

玉米蛋白粉是工業(yè)上利用玉米生產(chǎn)淀粉后產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物之一，其蛋白質(zhì)含量較高，約占干物質(zhì)的60%～75%，還含有脂肪和纖維素等成分。玉米蛋白粉的代謝能高于玉米，氨基酸總量高于豆粕和魚粉，目前作為蛋白補(bǔ)充，被廣泛應(yīng)用于飼料生產(chǎn)中。然而由于玉米蛋白粉中主要含有醇溶蛋白和谷蛋白，醇溶蛋白分子中存在大區(qū)域的α-螺旋結(jié)構(gòu)，具有很強(qiáng)的疏水性，谷蛋白只溶于堿水溶液，二者的水溶性差，且氨基酸不平衡，導(dǎo)致玉米蛋白粉在反芻動物體內(nèi)不易被消化吸收，對瘤胃微生物發(fā)酵和群體結(jié)構(gòu)的影響明顯低于魚粉和豆粕（王夢芝，2009）。利用微生物發(fā)酵玉米蛋白粉，可以將其中的玉米蛋白水解為小的短肽分子，這類短肽分子具有多種功能，如抗氧化 （Luo等，2014）、免疫等功能。研究表明，玉米蛋白水解物（CPH）可以促進(jìn)瘤胃微生物生長，改善瘤胃壞境（程茂基等，2004）。據(jù)報道，CPH可以提高豁眼鵝的生長性能（童輝等，2009），減弱生雞肉靡脂質(zhì)氧化（許瑞雪等，2016）。國外也有報道，CPH對大鼠肝組織損傷具有一定的治療作用 （Luo等，2014），并且還可以提高蛋雞的生產(chǎn)性能（Gunawardana等，2009）。目前關(guān)于CPH在奶牛生產(chǎn)中應(yīng)用的研究鮮有報道，因此，本試驗研究了在全混合日糧（TMR）中添加CPH對奶牛瘤胃體外發(fā)酵及纖維素酶活的影響，以期為CPH能夠應(yīng)用于奶牛生產(chǎn)中提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1CPH制備利用微生物發(fā)酵法制備CPH。具體方法如下：玉米蛋白粉與麩皮以8∶2的比例混合作為培養(yǎng)基，料水比（m/V）＝1∶2，以納豆芽孢桿菌：脈孢霉為7∶3的比例接種，接種量為0.31%（m/m），接種順序為先接種脈孢霉，12 h后再接種納豆芽孢桿菌，32℃培養(yǎng)40 h后取5 g發(fā)酵后的玉米蛋白粉于50 mL離心管中，添加一定比例的去離子水（1∶9，m/V），漩渦振蕩器振蕩 2min，40 ℃條件下恒溫振蕩1 h，20000 g離心，離心后用0.22μm濾膜過濾，真空冷凍干燥濾液得CPH，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2TMR體外發(fā)酵底物為TMR，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1（干物質(zhì)基礎(chǔ)）。

1.2供體動物及瘤胃液的采集3頭安裝永久性瘤胃瘺管的健康荷斯坦奶牛，體重（600±25）kg，每日飼喂兩次（07:00和18:00），自由飲水。奶牛飼喂日糧營養(yǎng)水平與發(fā)酵底物相同（表1）。晨飼前1 h分別采集3頭奶牛的瘤胃液，均勻混合，瘤胃液通過四層紗布進(jìn)行過濾。

表1　基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

1.3試驗設(shè)計本試驗采用單因素完全隨機(jī)試驗設(shè)計，設(shè)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4個處理組，分別添加0、0.06、0.12 g/L 和 0.24 g/L CPH， 每個處理設(shè) 3個重復(fù)，進(jìn)行奶牛瘤胃體外發(fā)酵試驗。

1.4體外發(fā)酵分別稱取 13.2 g CaCl2·2H2O、10.0 g MnCl2·4H2O、1.0 g CoCl2·6H2O、8.0 g FeCl3·6H2O、4.0 gNH4HCO3、35.0 gNaHCO3、5.7 gNa2HPO4、6.2 g K2HPO4、0.6 g MgSO4·H2O、0.1%刃天青及 4mg NaOH，加入蒸餾水定容至l000 mL，制成緩沖液（pH 6.9），通入CO2至過飽和。并按瘤胃液∶緩沖液以1∶2的比例混勻，配置人工瘤胃液。準(zhǔn)確稱取0.2 g底物加入到纖維袋內(nèi)，并置入100mL注射器內(nèi)，加入30 mL體外發(fā)酵液，置于恒溫水浴搖床中，39℃下恒溫培養(yǎng)。

1.5樣品采集和指標(biāo)測定采集體外發(fā)酵24 h內(nèi)發(fā)酵液，經(jīng)四層紗布過濾，用于測定pH、菌體蛋白和纖維素酶濃度，部分按與發(fā)酵液相應(yīng)比例添加25%的偏磷酸，用于測定瘤胃液VFA和NH3-N的濃度。所有樣品放于-20℃冰箱保存。

1.5.1發(fā)酵液pH、NH3-N和VFA濃度測定采用 pH（Startorius，PB-10）測定體外發(fā)酵 24 h 內(nèi)發(fā)酵液pH；采用馮宗慈比色法測定瘤胃液NH3-N濃度；采用氣相色譜儀（島津GC-2010，日本）測定瘤胃液中VFA濃度。

1.5.2發(fā)酵液菌體蛋白濃度測定采用嘌呤法（劉晶等，2014）測定發(fā)酵液中菌體蛋白濃度。

1.5.3發(fā)酵液纖維素酶活性和干物質(zhì)消失率測定纖維素酶活性的測定參照 《反芻動物營養(yǎng)學(xué)研究方法》中的方法 （王加啟，2011）。酶活單位（IU）指每分鐘每毫升酶液作用于底物生成的還原糖量（μmol）。

采集體外發(fā)酵24 h內(nèi)發(fā)酵液后，取出纖維袋，蒸餾水沖洗3次后，在105℃下烘干4 h，干燥器中冷卻后稱重，計算體外干物質(zhì)消失率。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

產(chǎn)氣量計算公式為：GP＝a＋b（1-exp-c×t）；

式中：a為可溶性快速產(chǎn)氣量，mL/0.1 g底物；b為不可溶性慢速產(chǎn)氣量，mL/0.1 g底物；c為產(chǎn)氣速率GP/h。

利用SAS 9.2的非線性（NLIN）方程對氣體產(chǎn)率進(jìn)行分析。有效產(chǎn)氣速率（EGp）計算公式為：

式中：c為產(chǎn)氣速率常數(shù)；k為一段速率常數(shù)，假定為 0.05/h（Wang 等，2012）。

其他數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件包中的mixed模型，根據(jù)正交多項式系數(shù)表選擇3階系數(shù)對數(shù)據(jù)進(jìn)行趨勢性分析，P＜0.05表示差異顯著，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”的形式表示。

2　結(jié)果

2.1CPH對體外發(fā)酵24 h產(chǎn)氣量的影響CPH對體外發(fā)酵24 h產(chǎn)氣量的影響見表2和圖1。隨發(fā)酵時間延長，各組發(fā)酵液產(chǎn)氣量呈上升趨勢。24 h試驗組產(chǎn)氣量、慢速產(chǎn)氣部分、潛在產(chǎn)氣部分和有效產(chǎn)氣速率均顯著高于對照組（P＜0.05），其中試驗組Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ產(chǎn)氣量分別較對照組升高5.32%、7.45%和10.64%。且隨添加量的增加，各組產(chǎn)氣量呈線性增加。

表2　CPH對體外發(fā)酵24 h產(chǎn)氣量的影響

圖1　添加不同水平CPH體外發(fā)酵24 h內(nèi)產(chǎn)氣量的動態(tài)變化

2.2CPH對體外發(fā)酵24 h pH、NH3-N和VFA濃度的影響CPH對瘤胃pH、NH3-N和VFA濃度的影響見表3和圖2～7。隨發(fā)酵時間延長，各組發(fā)酵液pH呈下降趨勢。24 h試驗組Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ發(fā)酵液pH分別較對照組降低0.60%、0.75%和1.35%（P＜0.05），且隨添加量的增加，各組發(fā)酵液pH呈線性下降。

隨發(fā)酵時間延長，各組發(fā)酵液NH3-N濃度呈現(xiàn)上升趨勢。24 h試驗組Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ發(fā)酵液NH3-N濃度分別較對照組升高3.05%、4.67%和11.42%（P＜0.01），且隨添加量增加，各組NH3-N濃度呈線性增加。

表3　CPH對體外發(fā)酵24 h pH、NH3-N和VFA濃度的影響

圖2　添加不同水平CPH體外發(fā)酵24 h內(nèi)pH的動態(tài)變化

圖3　添加不同水平CPH體外發(fā)酵24 h內(nèi)NH3-N濃度的動態(tài)變化

圖4　添加不同水平CPH體外發(fā)酵24 h內(nèi)乙酸濃度的動態(tài)變化

圖5　添加不同水平CPH體外發(fā)酵24 h內(nèi)丙酸濃度的動態(tài)變化

圖6　添加不同水平CPH體外發(fā)酵24 h內(nèi)丁酸濃度的動態(tài)變化

圖7　添加不同水平CPH體外發(fā)酵24 h內(nèi)總揮發(fā)酸濃度的動態(tài)變化

隨著發(fā)酵時間延長，各組發(fā)酵液總揮發(fā)酸、乙酸、丙酸和丁酸濃度呈現(xiàn)上升趨勢。24 h試驗組發(fā)酵液總揮發(fā)酸、乙酸、丙酸和丁酸濃度均極顯著高于對照組（P＜0.01），其中試驗組Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ分別較對照組升高16.81%、19.97%和23.57%，并隨添加量的增加呈線性升高，且具有一定的二次和三次效應(yīng)，試驗組Ⅲ和Ⅳ乙比丙值較對照組分別降低10.00%和7.92%（P＜0.01）。

2.3CPH對體外發(fā)酵24 h纖維素酶活、菌體蛋白和體外干物質(zhì)消失率的影響CPH對體外發(fā)酵24 h纖維素酶活性、菌體蛋白濃度和體外干物質(zhì)消失率的影響見表4。24 h試驗組Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ發(fā)酵液內(nèi)水楊甘酶含量分別較對照組升高1.24%、6.19%和8.05%（P＜0.01），且各組發(fā)酵液內(nèi)水楊甘酶含量隨CPH添加量增加呈線性升高。

表4　CPH對體外發(fā)酵24 h纖維素酶活、菌體蛋白和體外干物質(zhì)消失率的影響

24 h試驗組Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ發(fā)酵液內(nèi)菌體蛋白濃度分別較對照組升高12.48%、30.37%和24.95%（P＜0.01），并隨添加量增加呈線性升高。

24 h試驗組Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ體外干物質(zhì)消失率分別較對照組升高 1.42%、8.74%和 12.31%（P＜0.05），并隨添加量增加呈線性升高。

3　討論

3.1CPH對奶牛瘤胃體外發(fā)酵的影響產(chǎn)氣量的變化與揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量和微生物蛋白合成的變化呈正相關(guān)（Krishnamoorthy 等，1991），產(chǎn)氣量和干物質(zhì)消失率越高，飼料利用率越高。本試驗中，添加CPH處理產(chǎn)氣量和干物質(zhì)消失率都顯著高于對照組，可能與菌體蛋白濃度和揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)量增加有關(guān)。可見添加CPH有利于飼料在瘤胃內(nèi)的降解，提高飼料利用率。

pH、VFA和NH3-N濃度是評價瘤胃發(fā)酵的重要參數(shù)（Wanapat等，1999）。當(dāng)pH長時間低于6.2時，瘤胃內(nèi)纖維素降解菌降解纖維素的能力會下降，嚴(yán)重時會導(dǎo)致奶牛瘤胃酸中毒（Erdman等，1982）。本試驗中，隨著CPH添加量的增大，pH呈現(xiàn)下降趨勢，但一直維持在6.58～6.67，有利于瘤胃發(fā)酵。pH降低的主要原因可能是TMR中加入CPH后促進(jìn)了瘤胃微生物活動，增加了發(fā)酵液中VFA的含量。VFA的主要作用是為反芻動物提供能量，主要包括乙酸、丙酸和丁酸。瘤胃內(nèi)部分細(xì)菌、真菌和原蟲的主要發(fā)酵產(chǎn)物為乙酸、丙酸和丁酸，且瘤胃內(nèi)纖維素酶降解纖維的主要產(chǎn)物為乙酸。本試驗中，添加CPH提高了總揮發(fā)酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量，可能是由于瘤胃內(nèi)微生物相對菌群數(shù)量和纖維素酶含量的增加所致。王文娟等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，在肉牛日糧中添加大豆肽顯著提高了瘤胃內(nèi)VFA含量，與本試驗結(jié)果趨勢相近，隨著CPH添加量的增加VFA含量呈遞增趨勢。研究表明，牛奶中乳糖含量與瘤胃內(nèi)丙酸含量呈正相關(guān)（Miller-Webster等，2002），且乙酸和丁酸為合成牛奶中脂肪的前體物質(zhì)。因此，我們推測CPH對奶牛產(chǎn)奶性能有一定的潛力。NH3-N是瘤胃內(nèi)氮代謝的主要產(chǎn)物，原蟲和部分蛋白降解菌通過降解日糧中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生NH3-N，并為瘤胃微生物合成菌體蛋白提供原料。NH3-N在瘤胃內(nèi)含量一般處于動態(tài)平衡，研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃內(nèi)NH3-N含量適宜范圍為15～30 mg/100 mL（Wanapat等，1999）。本試驗中，添加不同水平的CPH可以提高菌體蛋白含量并在合理范圍內(nèi)提高NH3-N含量，這可能與原蟲和某些蛋白降解菌相對菌群數(shù)量增加有關(guān)。有研究指出，瘤胃內(nèi)原蟲和蛋白降解菌相對菌群數(shù)量的增加會引起NH3-N含量增加（Sun等，2013），為微生物提供氮源，從而使菌體蛋白含量增加。王文娟等（2011）對瘤胃灌注小肽對肉牛瘤胃發(fā)酵與營養(yǎng)物質(zhì)消化代謝的影響發(fā)現(xiàn)，大豆小肽可以提高瘤胃內(nèi)菌體蛋白和NH3-N濃度。說明添加CPH可以提高瘤胃NH3-N的含量，提供氮源，進(jìn)而促進(jìn)瘤胃微生物合成菌體蛋白。

3.2CPH對纖維素酶活的影響羧甲基纖維素酶又稱內(nèi)切葡聚糖酶，這類酶可作用于纖維素內(nèi)部非結(jié)晶區(qū)，從高分子內(nèi)部任意切開β-1，4糖苷鍵，產(chǎn)生帶有非還原性末端的小分子纖維素；水楊苷酶又稱外切葡聚糖苷酶或纖維二糖酶，這類酶可以將短鏈的非還原性末端纖維二糖殘基逐個切下降解晶體纖維素。這兩類纖維素酶活性的強(qiáng)弱，可間接說明瘤胃內(nèi)纖維降解程度。瘤胃內(nèi)纖維降解菌可以產(chǎn)生纖維素酶，主要用于分解纖維素。本試驗中，添加不同水平的CPH羧甲基纖維素酶活性無明顯變化，但水楊苷酶活性顯著高于對照組，主要原因可能是CPH使瘤胃內(nèi)某些纖維降解菌相對菌群數(shù)量增加所致，其具體機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。劉春龍等（2006）研究表明，從絲蘭屬植物中提取出的一種具有生物活性的物質(zhì)絲蘭皂苷可以提高瘤胃內(nèi)纖維素酶活，并隨添加水平的升高而增強(qiáng)，與本試驗結(jié)果相似。說明添加CPH可以提高瘤胃內(nèi)纖維類物質(zhì)的降解率，從而提高纖維在消化道內(nèi)的消化率。

4　結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，TMR中添加CPH可以改善瘤胃發(fā)酵，提高瘤胃內(nèi)纖維素酶活性，從而提高飼料利用率，其中以添加0.24 g/L為宜。

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