常 堃，蔡 婧，李世華，李 軍，劉 杰，張九玲，李為民，肖 艷，田繼成

（十堰市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 十堰 442000）

雙單雜交技術(shù)是由“布勒現(xiàn)象”[1]衍生而來，是1種目的性較強的常規(guī)育種手段，香菇的有性生殖方式為異宗結(jié)合。利用雙單雜交技術(shù)，將具有優(yōu)良特性的香菇雙核菌絲，對需要改良菌株的單核菌絲進行雙單配對，形成雙核菌絲，從而選育出新的雜交菌株。

高溫脅迫導(dǎo)致包括香菇在內(nèi)的各種生物體產(chǎn)生一系列生理紊亂，是生理學(xué)研究的重要領(lǐng)域之一[2-3]。本研究使用雙單雜交技術(shù)，先對親本菌株進行雜交，再對所得雜交子菌絲進行高溫逆境脅迫處理，獲得一些菌絲可以正常生長的雜交子，隨之進行出菇對比試驗，初步篩選出了具有利用價值的雜交子。

1　材料與方法

1.1　供試菌株

香菇L808、L9319引自浙江省麗水市大山菇業(yè)研究開發(fā)有限公司，香菇9608引自河南西峽縣真菌研究所。

1.2　培養(yǎng)基

單孢子分離培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。雙單雜交培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。逆境脅迫培養(yǎng)基：木屑80%、麩皮19%、石膏1%，含水量50%～55%，試管尺寸18mm×180mm。

1.3　菌種配方

木屑60%、細木屑20%、麩皮18%、石膏1%、石灰1%，含水量50%～55%。

1.4　栽培料配方

木屑80%、麩皮19%、石膏1%，含水量50%～55%。

1.5　雙單雜交

收集L808的單核菌絲，與供體L9319和9608的雙核菌絲分別對峙培養(yǎng)于同一PDA試管中，雙核菌絲位于試管底部，單核菌絲位于試管中部，菌絲塊之間相差4 cm～5 cm，25℃培養(yǎng)10 d～15 d后，挑取單核菌絲靠近試管前端的邊緣菌塊鏡檢，具有鎖狀聯(lián)合者視為雜交成功，并于試管中進行擴大培養(yǎng)。

1.6　逆境脅迫處理

將擴大培養(yǎng)的雜交子菌絲接入試管木屑培養(yǎng)基中，棉花塞封口，25℃暗培養(yǎng)10 d，待菌絲萌發(fā)延伸，將菌絲至于35℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)直到菌絲長滿試管，培養(yǎng)箱為電熱恒溫培養(yǎng)箱（無水盤加濕）。

椎體轉(zhuǎn)移性腫瘤常見于惡性腫瘤晚期，會嚴重影響患者的生活質(zhì)量和生存期限。目前對于脊柱轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療存在不少爭議，缺乏客觀量化的標準來指導(dǎo)治療方案［1-3］。脊柱腫瘤評分系統(tǒng)中，Tomita評分與脊柱轉(zhuǎn)移瘤的預(yù)后密切相關(guān)，可作為外科干預(yù)決策的重要參考標準［4］。根據(jù)Tomita評分，4～7分者預(yù)期壽命較長，一般情況尚可的患者，可通過局限性手術(shù)來穩(wěn)定脊柱，減輕疼痛，改善生活質(zhì)量。

1.7　雜交新菌株的篩選

將菌絲可以長滿試管的雜交子直接制種，28℃暗培養(yǎng)30 d～40 d，然后淘汰菌絲生長過慢和無法萌發(fā)延伸的雜交子。

1.8　栽培試驗和子實體形態(tài)、形狀的觀察

按上述培養(yǎng)料配方，采用地面斜靠栽培模式進行對比試驗，每個品種設(shè)3次重復(fù)，代料干重1.2 kg·袋-1。記錄各雜交子的污染率和子實體產(chǎn)量，計算其生物學(xué)效率，對每個雜交子子實體隨機取樣，測定各雜交子菌蓋厚度、菌蓋直徑和菌柄直徑。

2　結(jié)果與分析

2.1　雙單雜交

將L9319和9608分別與收集的80份L808單核菌絲進行雙單雜交，獲得L9X8（L9319與L808雙單雜交） 雜交子63株，獲得9X8（9608與L808雙單雜交） 雜交子56株。

2.2　逆境脅迫處理結(jié)果

逆境脅迫處理后共獲得31株雜交子，其中L9X8有22株，9X8有9株。制種后獲得15株雜交子菌種，其中L9X8有12株，9X8有3株。

2.3　栽培試驗結(jié)果

2.3.1雜交子養(yǎng)菌結(jié)果的比較

表1列出了各雜交子在不同時期的污染情況。

由表1可知，大部分雜交子菌絲抗雜能力很差，污染集中表現(xiàn)在刺孔后，只有L9X8-3和L9X8-40的菌絲生長良好。

2.3.2進入出菇期雜交子特征

表1　雜交子污染情況Tab.1　Contamination of hybrids

表2列出了能夠出菇的雜交子的出菇分布情況和產(chǎn)量。

表2　雜交子產(chǎn)量情況Tab.2　Yield of hybrids

由表2可見，大部分雜交子產(chǎn)量很低，且集中在前2潮出菇，雜交子L9X8-3呈爆發(fā)性出菇，且產(chǎn)量最高，均產(chǎn)達到988.9 g·棒-1，而雜交子L9X8-7在第3潮開始出菇。經(jīng)過逆境處理能夠正常生長的雜交子菌絲吃料情況無明顯差異。產(chǎn)量方面除L9X8-3外，其余雜交子產(chǎn)量均低于對照。部分雜交子子實體特征見圖1、圖2和表3。

圖1　L9X8-7子實體形態(tài)Fig.1　Morphology of L9X8-7 fruiting body

圖29X8-40子實體形態(tài)Fig.2　Morphology of 9X8-40 fruiting body

表3　部分雜交子子實體特征Tab.3　Fruiting body characteristics of parthybrids

從表3、圖1和圖2可以看出，經(jīng)過逆境處理后，部分雜交子子實體特征表現(xiàn)為L9X8-7子實體大量出現(xiàn)畸形，經(jīng)測量菌柄平均直徑達到24.73mm，菌蓋不易開傘；9X8-40子實體菇形大，易開傘，容易形成片菇。

3　討論

單單雜交、雙單雜交、多孢自交已廣泛使用在食用菌育種中，本研究經(jīng)過逆境脅迫處理所獲雜交子L9X8-3呈現(xiàn)出爆發(fā)性出菇、子實體叢生、菌蓋面黑、產(chǎn)量高等特點，高產(chǎn)的特征值得將其作為育種材料進一步進行回交試驗；9X8-40子實體特征為板菇（俗稱的大片菇），雖然這一特點不管是在鮮銷市場還是干貨市場均不被看好，但其比較符合美國香菇工廠化品種的需求，擁有一定的潛在價值；雜交子L9X8-7在第3潮開始出菇（7月份），此高溫出菇的特征值得將其作為育種材料進一步研究，而且其菇柄肥厚，很適合用于香菇加工，隨著香菇產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，該品種同樣擁有一定的潛在價值。

本研究采用對雜交菌株進行高溫逆境脅迫的處理方式。結(jié)果表明，所獲部分雜交子在子實體形態(tài)方面有了明顯改變，至于獲得雜交菌株性狀能否遺傳，則有待于進一步研究。

參考文獻：

[1]Bak WC,Lee TS,Lee WK,et al.Selective breeding and hybridization ofLentinus edodesstrains for bed-log cultivation[J].Journal of Korean Forestry Society,1996,85(2):309-315.

[2]Moller IM,Jenesen PE,Hansson A.Oxidativemodifications to cellular componcents in plants[J].Annu Rcv Plant Biol,2007,58(1):459-481.

[3]Ferreia AS,Totola MR,Borges AC.Physiological implications of trehalose in the ectomycorrhizal fungusPisolithussp,under thermal stress[J].J.Therm.Biol.,2007,32(1):34-41.