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(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

雞球蟲病(Coccidiosis in Chicken)是雞常見且危害十分嚴(yán)重的寄生蟲病，可感染各個年齡段的雞只，對養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。雞球蟲病病原為艾美耳科艾美耳屬球蟲，在我國已發(fā)現(xiàn)有9種球蟲，其中柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)的致病力最強(qiáng)，其寄生部位是盲腸[2]。目前我國控制雞球蟲病的主要方法是應(yīng)用化學(xué)合成類、抗生素類藥物進(jìn)行防治，這些藥物療效顯著，但易產(chǎn)生耐藥性，且大劑量使用后可造成雞只掉毛、食欲降低等副作用，在禽類生產(chǎn)中已經(jīng)出現(xiàn)了明顯弊端。

中草藥具有副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，是新型抗球蟲藥物的重要研發(fā)方向[3]。常山別名雞骨常山、黃常山，其藥用部位為其干燥的根部。常山為常用的中草藥，漢代的醫(yī)藥學(xué)巨著《神農(nóng)本草經(jīng)》對該中藥已經(jīng)有所記載，具有抗瘧疾、催吐、退熱、抗病毒、抗阿米巴原蟲等功效[4]。柴胡別名地熏、山菜，為《中國藥典》收錄的中藥，其藥用部位為其干燥的根部。柴胡的主要功效是和解表里、疏肝解郁、升陽舉陷、退熱截瘧[5]。雞球蟲感染的一個重要過程是在腸道上皮細(xì)胞移行，移行過程中會造成腸道炎癥，引起機(jī)體發(fā)熱。本試驗(yàn)擬將常山的抗原蟲作用和柴胡的解熱作用相結(jié)合，通過組方配比，研究不同給藥劑量對雞球蟲病的療效，篩選最佳給藥濃度，為雞球蟲病的防治提供參考。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)動物

1日齡正陽三黃雞100羽，購自河南省原陽林海禽業(yè)土禽育種公司，飼養(yǎng)在河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物房。飼養(yǎng)室提前消毒、熏蒸，保證無球蟲卵囊污染。雛雞飼料由本課題組購買原料配制，確保無抗球蟲藥物。飼料配方如下；玉米60%、豆粕20%、麥麩10%、菜籽粕5%、其它青飼料5%。

1.2　試驗(yàn)藥物

常山、柴胡購自鄭州大地中草藥批發(fā)中心，粉碎后等量配比，加入適量蒸餾水文火熬制40 min，取汁，定容，計算單位體積液體相當(dāng)于中草藥原粉的質(zhì)量。熬制前中草藥和水的相對質(zhì)量比控制在1100，熬制過程中可適量補(bǔ)充蒸餾水。地克珠利水溶性粉劑(含量>99%)購自浙江國邦藥業(yè)有限公司，通過飼料添加給藥，添加濃度為1mg/kg飼料。

1.3　攻蟲用蟲株

雞柔嫩艾美爾球蟲由本課題組于2015年從鄭州市惠濟(jì)區(qū)某種雞場分離、保存。應(yīng)用前進(jìn)行雛雞接種、復(fù)蘇，收集盲腸內(nèi)容物，按照常規(guī)方法收集卵囊，置于2.5%重鉻酸鉀溶液，29 ℃培養(yǎng)。待90%以上卵囊出現(xiàn)孢子后置于4 ℃冰箱備用。

1.4　試驗(yàn)組設(shè)定

雞苗飼養(yǎng)至11日齡后，每日抽樣采集雛雞糞便，飽和鹽水漂浮法檢查球蟲卵囊，連續(xù)檢查3d。確定無球蟲感染后選擇14日齡雛雞80只，稱重。選取體重接近的雛雞苗，隨機(jī)分成8組，每組10只：5組不同劑量組方、地克珠利對照組(按照1 mg/kg飼料給藥)、陽性對照組(攻蟲不給藥)和陰性對照組(不攻蟲不給藥)。組方組給藥方式是通過藥汁拌料，給藥劑量分別相當(dāng)于每只每日0.6 g、1.0 g、2 g、4 g、6 g中藥組方原粉。

1.5　球蟲感染動物模型構(gòu)建

取完全孢子化的卵囊，計數(shù)、混勻。除陰性對照組外，其余各組雞苗經(jīng)口感染球蟲卵囊，感染量為6萬個/羽。攻蟲后24 h開始給藥，讓雛雞自由采食、飲水。連續(xù)給藥7 d后剖檢，進(jìn)行相關(guān)療效指標(biāo)評價。

1.6　不同試驗(yàn)組雛雞臨床特征觀察

攻蟲后第3d開始，每天上午定時觀察各組雛雞的臨床表現(xiàn)，同時對糞便性狀、血性分泌物的量等做好詳細(xì)記錄，進(jìn)行血便記分。收集糞便，計算克糞便卵囊數(shù)，直到試驗(yàn)結(jié)束。試驗(yàn)過程中如果發(fā)生雛雞死亡情況應(yīng)做好詳細(xì)記錄。

1.7　不同試驗(yàn)組雛雞病理學(xué)變化

試驗(yàn)結(jié)束后對全部存活雞只稱重后剖檢，檢查盲腸、十二指腸等臟器組織的病理學(xué)變化。分離盲腸，縱向剪開后進(jìn)行病變計分。用手術(shù)刀片刮取盲腸內(nèi)容物，稱重，進(jìn)行盲腸內(nèi)容物卵囊量計數(shù)(OPG值)。

1.8　不同試驗(yàn)組藥物療效評價

1.8.1相對增重率統(tǒng)計分別于攻蟲前和試驗(yàn)結(jié)束后按照分組對每只雛雞稱重，做好記錄，計算每組的平均相對增重率。相對增重率的計算方法如下:平均相對增重率=試驗(yàn)組平均增重率/健康對照組平均增重率×100%。

1.8.2存活率統(tǒng)計

試驗(yàn)結(jié)束后統(tǒng)計每個試驗(yàn)組雞只存活數(shù)目，計算存活率。存活率的計算方法如下:每組存活率=存活數(shù)目/試驗(yàn)前數(shù)目×100%。

1.8.3病變值統(tǒng)計

病變值是指各個試驗(yàn)組盲腸的病理變化程度，其計算方法為:病變值=每組平均記分×10。本統(tǒng)計參照李國清等[6]記分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病變值統(tǒng)計。病變值記分的標(biāo)準(zhǔn)如下:0分-黏膜無眼觀病變；1分-黏膜有少量出血點(diǎn)；2分-腸壁稍增厚，黏膜有多量出血點(diǎn)，盲腸內(nèi)容物含少量血液；3分-腸壁腫脹，內(nèi)容物含多量血液；4分-腸壁極度腫脹，外觀呈暗紫紅色，內(nèi)容物含有大量血凝塊；因球蟲病死亡雞只病變值記為4分。

1.8.4卵囊值統(tǒng)計

卵囊值的統(tǒng)計參照角田清等[7]提供方法執(zhí)行，將1.7中每組OPG值以(卵囊數(shù)×106)形式表示，當(dāng)卵囊數(shù)為0-0.1時卵囊值記為0；當(dāng)卵囊數(shù)為0.11-1.0時卵囊值記為1；當(dāng)卵囊數(shù)為1.1-1.9時卵囊值記為10；當(dāng)卵囊數(shù)為2.0-5.9時卵囊值記為20；當(dāng)卵囊數(shù)為6.0-10.9時卵囊值記為30；當(dāng)卵囊數(shù)>11.0時卵囊值記為40。

1.8.5抗球蟲效果評價

參照Merck公司的抗球蟲指數(shù)計算方法，根據(jù)統(tǒng)計的存活率、相對增重率、卵囊值和病變值，通過以下公式計算抗球蟲指數(shù)(ACI):ACI=(相對增重率+存活率)-(病變值+卵囊值)。

抗球蟲效果評價是以ACI為主要標(biāo)準(zhǔn)：ACI<120判定為療效差；120180判定為高效。

2　結(jié)果

2.1　臨床表現(xiàn)

接種球蟲后第4d，除了陰性對照組外，其它各組雛雞均出現(xiàn)不同程度的食欲減退、雞冠蒼白、精神沉郁、翅膀下垂、閉眼瞌睡、下痢、便中帶血等。接種球蟲卵囊后第5d，陽性對照組雛雞排出大量血便，有兩只雛雞死亡，所有給藥組雛雞便中血量明顯減少。第6d下午治療組1、4、5(0.6 g、4 g、6 g給藥量)各有1只雛雞死亡，其余治療組雛雞便中血量進(jìn)一步減少。

2.2　剖檢變化

剖檢結(jié)果表明，陰性對照組雛雞所有臟器均無異常；試驗(yàn)過程中死亡雛雞盲腸、十二指腸等明顯腫脹，腸壁外側(cè)能看到出血點(diǎn)、出血斑，剖檢其內(nèi)容物呈暗紅色甚至黑紅色；相對于陽性對照組雛雞，所有給藥組雛雞盲腸、十二指腸腫脹有不同程度減輕，腸道內(nèi)血性分泌物的量明顯減少，其它臟器未見明顯眼觀病變。

2.3　常山柴胡組方抗球蟲效果分析

通過分析相對增重率、雞只存活率、病變值、卵囊值等計算各個試驗(yàn)組的抗球蟲指數(shù)(ACI)。統(tǒng)計結(jié)果表明，地克珠利對照組(1 mg/kg飼料)的ACI指數(shù)為123.96；常山柴胡組方不同劑量治療組ACI分別為91.17、133.25、149.5、106.96和100.86，均高于陽性對照組(62.14)；1.0 g/只/天的給藥量(治療組2)和2.0 g/只/天的給藥量(治療組3)的ACI高于地克珠利對照組，且均未發(fā)生雛雞死亡。相關(guān)統(tǒng)計結(jié)果見表1。

表1　常山柴胡組方抗球蟲病療效相關(guān)指標(biāo)分析

3　討論與結(jié)論

雞球蟲病可以感染各個年齡段的雞只，其中雛雞感染后死亡率可達(dá)70%-80%，病愈后雛雞食欲減退，生長緩慢。成年雞感染后一般不發(fā)病，但為帶蟲者，可引起增重和產(chǎn)蛋能力降低，是球蟲病的重要傳播源。目前用于治療雞球蟲病的藥物主要是化學(xué)合成類藥物如莫能菌素、地克珠利、磺胺二甲基嘧啶、鹽酸氨丙啉等，這些藥物分別作用于球蟲發(fā)育的不同階段，療效好但易產(chǎn)生耐藥性[8]。作為危害最嚴(yán)重的球蟲病病原之一——柔嫩艾美爾球蟲，其產(chǎn)生抗藥性的速度更是驚人，甚至超過新藥研發(fā)的速度。因此篩選療效好、不易產(chǎn)生耐藥性的中草藥組方成為當(dāng)前養(yǎng)雞業(yè)迫切需要解決的問題。

相關(guān)的研究結(jié)果表明，從中草藥常山中提取的常山堿具有良好的抗球蟲效果，將常山堿進(jìn)行溴代反應(yīng)后形成的常山酮具有更強(qiáng)的抗球蟲效果。目前臨床上應(yīng)用的常山酮主要靠進(jìn)口，國內(nèi)尚無規(guī)?；a(chǎn)，價格昂貴，且已經(jīng)有耐藥性和藥物殘留的相關(guān)報道[9]。常山在我國產(chǎn)地廣泛，資源豐富，其中含有常山堿、八仙花酚等生物活性物質(zhì)，具有多種生理學(xué)作用，能夠解熱、降壓、催吐、抗瘧等[10]。常山作為一種常用中草藥，具有低毒、低殘留、療效持久的優(yōu)勢。因此，本研究將常山和具有解熱療效的中藥柴胡組方，以期篩選出抗球蟲效果好、對機(jī)體保護(hù)作用強(qiáng)的中草藥配方。

本研究中用于構(gòu)建球蟲感染動物模型的卵囊分離自鄭州市郊爆發(fā)球蟲病的某雞場，經(jīng)分離、純化、鑒定為柔嫩艾美爾球蟲卵囊[11]。課題組前期對卵囊毒力評價結(jié)果表明，該卵囊毒力較強(qiáng)，每只雛雞經(jīng)口感染8萬個復(fù)蘇的孢子化卵囊后3周內(nèi)死亡率達(dá)到了30%，具有良好的感染能力，能夠作為構(gòu)建動物模型用蟲株。

抗球蟲指數(shù)分析表明，所有復(fù)方治療組的ACI均未高于160，從療效分析判定均為中等或較差，分析可能和蟲株高毒力有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，常山柴胡粉劑的水提取物能夠有效控制雞球蟲病的發(fā)生，隨著給藥量從0.6 g/只增加到2.0 g/只，相對增重率逐漸增加，盲腸病變程度則逐漸減輕，盲腸平均卵囊數(shù)逐漸減少，抗球蟲指數(shù)逐漸升高，其中1.0 g/只、2.0 g/只劑量組抗球蟲指數(shù)均高于地克珠利對照組。隨著給藥劑量增加至4.0 g/只、6.0 g/只劑量，相對增重率反而下降且均出現(xiàn)死亡雞只，盲腸平均卵囊數(shù)有增多的趨勢，抗球蟲指數(shù)較1.0 g/只、2.0 g/只劑量組低，分析原因可能是中藥水提液味苦，適口性差，過量添加后抑制了雛雞食欲，進(jìn)而引起生長遲緩、免疫力低下等。通過本實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虺醪降玫浇M方劑量和療效之間的關(guān)系：常山柴胡組方按照1.0 g/只和2.0 g/只給藥具有良好的抗球蟲效果。結(jié)合生產(chǎn)用藥成本，可確定1.0 g/只/日為有效的用藥劑量。

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