，　，　　，　　，　，　　，　，　　

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院油菜研究所，　貴陽 550008；　2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料研究所，　貴陽 550008；3.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，　四川 自貢 643000；　4.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，　成都 610066)

轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子廣泛存在于各種生物體中，對于真核生物主要通過特異性結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)域，從而激活或抑制靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，引起靶標(biāo)基因的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)[1-3]。比較常見的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子有MYB、NAM、NAC、WRKY等，其中的WRKY轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是一類超級基因家族[4]，其C端變異較大，N端相對保守，在其N端有幾個(gè)WRKYGQK核心結(jié)構(gòu)域，在發(fā)揮生物學(xué)功能的時(shí)候就是通過該核心結(jié)構(gòu)域?qū)Π袠?biāo)基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異性識(shí)別，然后結(jié)合靶標(biāo)基因W-box位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對其的轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制，從而達(dá)到對靶標(biāo)基因的表達(dá)調(diào)控。WRKY超級基因家族具有非常豐富的生物學(xué)功能，研究表明，WRKY超級基因家族參與了植物種子萌發(fā)、各個(gè)器官形態(tài)建成、代謝及衰老調(diào)控等眾多生理功能[5-7]。

本研究對擬南芥WRKY基因家族的一個(gè)成員WRKY 71進(jìn)行了基因克隆并對其進(jìn)行了序列分析，以擬南芥cDNA為模板通過RT-PCR成功克隆轉(zhuǎn)錄因子WRKY 71，為后續(xù)表達(dá)分析及進(jìn)一步的功能鑒定奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1植物材料、菌株、載體

植物、菌株、載體等為本實(shí)驗(yàn)室保存，其中擬南芥種子為哥倫比亞生態(tài)型，大腸桿菌(E.coli)選擇JM 109，用作克隆的載體為pMD 18-T。

1.1.2化學(xué)及分子生物學(xué)試劑

化學(xué)及分子生物學(xué)試劑主要有：PCR反應(yīng)試劑、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T 4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)

首先查閱擬南芥的專業(yè)網(wǎng)站www.arabidopsis.org獲得WRKY 71的cDNA序列，然后運(yùn)用引物設(shè)計(jì)的專業(yè)軟件Primer 5.0依據(jù)WRKY 71的cDNA序列信息設(shè)計(jì)合適的引物。引物序列信息為：

F：5-3TACCTACTAG TACAACTCGT，

R：5-3TCTTGACTCGTTCTTGGAG。

1.2.2RNA提取及反轉(zhuǎn)錄為cDNA

擬南芥RNA的提取方法參照張年輝的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行適當(dāng)改動(dòng)，具體反應(yīng)體系及反應(yīng)程序如下：

反應(yīng)體系(20μL)：

反應(yīng)體系反應(yīng)體積RNaseinhibitor0．5μL5AMVBuffer4．0μLdNTPmixture(10mMeach)2．0μLOligo(dT)18primer1．0μL模板RNA2．0μLDEPCH2O9．5μLAMVRNase1．0μL

反應(yīng)程序：

反應(yīng)程序94 ℃4 min

72 ℃10 min

4 ℃保溫

1.2.3PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子WRKY 71

轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子WRKY 71的PCR擴(kuò)增按照以下實(shí)驗(yàn)程序進(jìn)行：

94 ℃4 min

72 ℃10 min

4 ℃ 保溫

1.2.4轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子WRKY 71 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR擴(kuò)增獲得的是單一目的條帶，因此用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化回收(具體實(shí)驗(yàn)方案參照TIANGEN生物科技有限公司DNA回收試劑盒的說明書)。

1.2.5轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子WRKY 71的克隆

轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子WRKY 71的克隆以pMD 18-T克隆載體進(jìn)行，具體的pMD 18-T克隆載體與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子WRKY 71的連接、轉(zhuǎn)化方法參照TIANGEN生物科技有限公司在克隆試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)方案。

1) 連接反應(yīng)體系(10μL體系)

反應(yīng)成分反應(yīng)體積回收WRKY71PCR片段5．8μLpMD18?T0．2μLSoulutionⅠ4μL

2) 轉(zhuǎn)化

a.連接反應(yīng)完成后獲得的連接產(chǎn)物全部以移液器迅速加入到制備好的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，然后冰浴40 min。

b.冰浴完成后迅速在42 ℃水浴鍋處理45 s，特別注意時(shí)間不能過長，然后再進(jìn)行冰浴5 min。

c.恒溫培養(yǎng)：以移液器吸取700μL的LB液體培養(yǎng)基加入到上述Eppendof管，然后在37 ℃恒溫條件225 r/min搖床培養(yǎng)1 h。

d.涂布及過夜培養(yǎng)：上述恒溫培養(yǎng)細(xì)胞離心，以移液器吸取100μL培養(yǎng)細(xì)胞均勻涂布到準(zhǔn)備好的LB+Amp固體培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫條件下進(jìn)行過夜培養(yǎng)。

3) 培養(yǎng)細(xì)胞重組子的菌落PCR篩選

以接種針從LB固體培養(yǎng)基平板上挑選邊緣光滑且大小均一的單菌落，以其作為菌落PCR擴(kuò)增的模板，上游引物為pMD 18-T上游測序引物，配套的下游引物是轉(zhuǎn)錄因子WRKY 71的下游引物。

4) PCR陽性單菌落測序分析

將菌落PCR陽性單菌落接種于200μL的LB+Amp液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫條件下?lián)u床進(jìn)行過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)細(xì)胞以移液器吸取200μL送invitrogen公司測序分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　DNA的提取

DNA的質(zhì)量及濃度直接影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，通過紫外分光光度計(jì)檢測計(jì)算發(fā)現(xiàn)DNA的A260/A280為1.80，比值處于1.6～1.9之間，同時(shí)以移液器取2μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)一清晰而且無拖尾現(xiàn)象的亮帶，說明提取的DNA質(zhì)量及濃度符合下一步實(shí)驗(yàn)的要求。

2.2　轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子WRKY 71基因片段的PCR擴(kuò)增

查閱擬南芥的專業(yè)網(wǎng)站www.arabidopsis.org獲得轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子WRKY 71(AT 1 G 29860)的cDNA序列信息，以引物設(shè)計(jì)軟件primer primer 5設(shè)計(jì)合適的引物，合成引物后先進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增，探索出最佳的退火溫度，然后做第2次PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增獲得一900 bp左右的條帶(圖1)，與預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，用回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物用做連接反應(yīng)。

注：1為對照；2為cDNA為模板的PCR擴(kuò)增。圖1　轉(zhuǎn)錄因子WRKY 71基因片斷的PCR擴(kuò)增

2.3　連接轉(zhuǎn)化

在進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化時(shí)要求克隆載體和PCR產(chǎn)物按照一定的摩爾比，一般情況下，克隆載體：PCR產(chǎn)物為1∶3為最佳配比，克隆載體的質(zhì)量要求在100 ng左右，待連接的PCR產(chǎn)物為20 ng左右，連接轉(zhuǎn)化后以kan進(jìn)行抗性篩選，獲得分布均勻的白色單菌落，可用于下一步的實(shí)驗(yàn)。

2.4　重組子的篩選鑒定

2.4.1菌落PCR的檢測分析

以接種針在菌落分布均勻區(qū)域挑取分隔良好的白色單菌落，然后在沸水中出來5 min，以移液器取2μL進(jìn)行菌落PCR重組子的篩選鑒定，PCR擴(kuò)增結(jié)果獲得一900 bp大小左右的條帶(圖2)，與預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說明轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子WRKY 71可能已經(jīng)克隆到pMD 18-T載體中。

注：1、2、5為陽性菌落；4為陰性菌落。圖2　轉(zhuǎn)錄因子WRKY 71的菌落PCR

2.4.2轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子WRKY 71的雙酶切分析

大腸桿菌JM 109遺傳背景比較復(fù)雜，基因組較大，有可能與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子WRKY 71存在同源序列，導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性PCR擴(kuò)增條帶，因此，有必要做進(jìn)一步的酶切分析。挑取PCR結(jié)果為陽性的白色單菌落培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切分析，雙酶切獲得一大小在900 bp左右條帶(圖3)，與預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步說明轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子WRKY 71可能已經(jīng)連接到克隆載體pMD 18-T中。

圖3　轉(zhuǎn)錄因子WRKY 71的酶切鑒定

2.5　轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子WRKY 71測序與生物信息學(xué)分析

酶切分析與預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致的白色單菌落培養(yǎng)過夜，取菌液送上海英俊生物科技有限公司進(jìn)行測序分析，測序獲得一大小為849 bp的基因序列，與擬南芥專業(yè)網(wǎng)站公布的AT 1 G 29860序列高度同源，同源性達(dá)到99%，只在起始密碼子下游57 bp位置由G突變?yōu)镃，但并不改變氨基酸的編碼，以生物信息學(xué)分析軟件DNAstar進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子WRKY 71由282個(gè)氨基酸序列構(gòu)成，具有一個(gè)WRKYGQK核心序列(圖4)，氨基酸序列與擬南芥專業(yè)網(wǎng)站公布的AT 1 G 29860同源性達(dá)100%，說明已經(jīng)成功克隆轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子WRKY 71。

圖4　轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子WRKY 71蛋白質(zhì)序列

3　討　論

WRKY是一類超級基因家族，廣泛參與了植物眾多生理過程[8-9]，Guo等的研究表明,WRKY超家族與植物抗衰老過程密切相關(guān)，通過分析WRKY超家族的轉(zhuǎn)錄過程發(fā)現(xiàn)其構(gòu)成了植物抗衰老過程的第二大超級基因家族[10]，通過對擬南芥進(jìn)行黑暗處理，被分析的59個(gè)WRKY基因有21個(gè)上調(diào)表達(dá)[11-13]。最近的研究表明，WRKY超級基因家族參與了植物病源脅迫過程，在植物抗病反應(yīng)中發(fā)揮了十分重要的生物學(xué)功能[14-15]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),AtWRKY18和AtWRKY70高表達(dá)明顯增強(qiáng)其對腐生型真菌的抗病性[16]。

本研究克隆了WRKY超級家族的一個(gè)成員WRKY 71，研究結(jié)果表明，克隆的目的基因與登錄GenBank的AtWRKY71基因高度同源，核苷酸序列同源性達(dá)99%，氨基酸序列同源性達(dá)100%，因此，成功克隆WRKY 71轉(zhuǎn)錄因子，為后續(xù)鑒定WRKY 71與W-box的結(jié)合活性及其在生物脅迫或非生物脅迫應(yīng)答過程中的分子生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

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