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(內(nèi)蒙古科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，　內(nèi)蒙古 包頭 014010)

活性氧(Reactive oxygen species，ROS) 是植物有氧代謝過程中的副產(chǎn)物，包括超氧陰離子 (O2-)、羥自由基 (·OH)、單線態(tài)氧和過氧化氫 (H2O2) 等[1]。正常情況下，植物體內(nèi)活性氧的含量呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，不會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生傷害。當(dāng)病原菌、昆蟲侵染植物時(shí)，會(huì)打破活性氧在植物體內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡，產(chǎn)生大量的活性氧，形成氧化逆境[2]?；钚匝醯拇罅糠e累會(huì)引發(fā)或加劇細(xì)胞膜的膜脂過氧化和膜脂作用，造成膜系統(tǒng)的損傷，并能引起細(xì)胞大分子的氧化損傷，從而對(duì)植物造成傷害[3]。

然而，在植物抵御病蟲害侵染過程中，活性氧的作用是雙方面的，有益或有害取決于它在植物體內(nèi)的濃度[4]。低濃度的活性氧既可作為毒性分子殺死病原，又可以作為信號(hào)分子誘導(dǎo)防御基因的表達(dá)，通過引起細(xì)胞木質(zhì)化、胼胝體合成等加固細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，阻礙病原的繼續(xù)入侵[5]。高濃度的活性氧則會(huì)給植物體帶來極大的危害。當(dāng)ROS水平超出防御機(jī)制所及范圍，細(xì)胞就處于氧化脅迫狀態(tài)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化、核酸損傷和酶失活，并能激活程序性細(xì)胞死亡[6]。

為了消除或降低這種危害，植物體內(nèi)存在著抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)，通過降低植物逆境狀態(tài)下的活性氧水平，以減少逆境對(duì)植物產(chǎn)生的危害[7]。因此，活性氧的積累與及時(shí)清除對(duì)植物抗病蟲害性能的提高具有同等重要的意義。過氧化氫(H2O2)作為活性氧家族中的一員，在植物抵御病蟲害侵染過程中扮演著重要角色[8]。本研究利用高粱蚜抗性品種HN 16 (包含RMES1基因[9]) 和感蚜突變體作為研究材料，通過熒光定量PCR的方法，對(duì)蚜蟲取食過程中活性氧途徑關(guān)鍵基因——抗壞血酸過氧化物酶基因(Sb 002 G 431100)的表達(dá)模式進(jìn)行分析，以探明活性氧途徑相關(guān)基因在高粱抗蚜反應(yīng)中可能發(fā)揮的作用。

1　材料和方法

1.1　材　料

本研究以高粱抗蚜品種HN 16和感蚜突變體作為研究材料。高粱蚜由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所提供，并接種到感蚜品種BTx 623上進(jìn)行蚜蟲的繁殖培養(yǎng)。

RNA 提取試劑TransZol Up和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自transgen公司；PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；DNaseⅠ和SYBR?PremixExTaqTM均購(gòu)自Takara公司。

1.2　方　法

1.2.1材料處理

在花盆中種植2種高粱材料，待植株長(zhǎng)至2葉1心期進(jìn)行接蚜處理。平均每株苗接蚜20只，選取接蚜0，24，48，72 h和96 h的葉片進(jìn)行基因表達(dá)量分析。所有實(shí)驗(yàn)均在培養(yǎng)箱中進(jìn)行，培養(yǎng)條件為：16 h光照，8 h黑暗，溫度28～30 ℃，相對(duì)濕度60%。

1.2.2總RNA提取

總RNA 的提取使用TransZol Up試劑。為避免來自基因組DNA的污染，所有的 RNA樣品在提取時(shí)都要進(jìn)行DNaseⅠ消化。具體操作如下：取高粱葉片100 mg，放在預(yù)冷的研缽中，液氮研磨，迅速轉(zhuǎn)入無RNase 的2.0 mL 離心管，立即加入1 mL TransZol Up提取緩沖液，冰浴5 min；加入200μL氯仿，劇烈震蕩30 s，室溫放置3 min；4 ℃ 10 000 r/min離心15 min后，取上清到新的離心管；每使用1 mL TransZol Up加入500μL異丙醇，顛倒混勻，室溫孵育10 min；4 ℃、10 000 r/min 離心10 min，在管側(cè)和管底形成沉淀；棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀2次，室溫將沉淀晾干；加入50～100μL RNase-Free水溶解。檢測(cè)RNA的質(zhì)量和濃度，在-70 ℃保存樣品。

1.2.3引物設(shè)計(jì)與合成

從高粱基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下載抗壞血酸過氧化物酶基因(Sb 002 G 431100)的基因組序列和CDS序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)跨內(nèi)含子引物，即引物1(1 F:5′-CTCAGGCAGGTTTTCTCCACA-3′，1 R:5′-GCAAAGAAAGCGTCCTCATCC-3′)和引物2(2 F:5′-GCCTCATCGCTGAGAAGAACT-3′和2 R:5′-GCATAGGATAGGATGGGGAACT-3′)。內(nèi)參基因引物[10]為(actin F:5′-ACATTGCCCTGGACTACGAC-3′和actin R:5′-AATGAAGGATGGCTGGAAGA-3′)。

1.2.4反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行cDNA的合成。10μL反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為Total RNA 5μL；Anchored Oligo(dT)primer (0.5μg/μL)1μL；2×TS Reaction Mix 10μL；TransScriptRT/RI Enzyme Mix 1μL；Gdna Remover 1μL；RNase-free Water 2μL。將RNA模板，引物與RNase-free Water混勻，65 ℃孵育5 min后，冰浴2 min，然后加入其他反應(yīng)組分，42 ℃孵育反轉(zhuǎn)錄30 min；85 ℃加熱5s失活TransScriptRT/RI與gDNA Remover。反轉(zhuǎn)錄獲得的CDNA分裝20μL小管，每個(gè)樣品分裝5份，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5PCR反應(yīng)

以DNA和反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，用引物1和引物2進(jìn)行PCR程序擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，10 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖檢測(cè)。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)

采用Takara公司的SYBR?PremixExTaqTM進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過檢測(cè)反應(yīng)液中SYBR Green I 的熒光強(qiáng)度，達(dá)到監(jiān)控PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。在Applied Biosystems 7500型熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。按說明書合成20μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件如下：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；58 ℃，34 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s進(jìn)行溶解曲線分析。

2　結(jié)　果

2.1　RNA質(zhì)量檢驗(yàn)

由圖1可以看出，所提取RNA的28 S、18 S和5 S條帶清晰，且條帶間沒有拖尾現(xiàn)象，說明RNA質(zhì)量良好，且沒有降解。

RNA的質(zhì)量檢測(cè)

2.2　反轉(zhuǎn)錄cDNA的質(zhì)量檢測(cè)

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，取HN 16的基因組DNA作為對(duì)照，利用內(nèi)參基因actin進(jìn)行擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增條帶單一，亮度適中，說明反轉(zhuǎn)錄cDNA的質(zhì)量較好(圖2)。

注：M為marker，1為DNA對(duì)照，2～6 為HN 0～96 h的cDNA，7～11為Mutant 0～96 h的cDNA。圖2　反轉(zhuǎn)錄cDNA的質(zhì)量檢測(cè)

2.3　特異引物的篩選

利用高粱cDNA和DNA作為模板，對(duì)抗壞血酸過氧化物酶基因(Sb 002 G 431100) 的2對(duì)跨內(nèi)含子引物的特異性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，2對(duì)引物都具有清晰的擴(kuò)增條帶(圖3)，均可用于下一步的熒光定量PCR檢測(cè)，最終選擇引物1進(jìn)行該基因的表達(dá)量分析。

圖3　引物的篩選

2.4　抗壞血酸過氧化物酶基因(Sb 002 G 431100) 的表達(dá)模式分析

利用熒光定量PCR的方法，對(duì)蚜蟲取食過程中抗壞血酸過氧化物酶基因 (Sb 002 G 431100) 的表達(dá)量進(jìn)行分析，無論是HN 16還是突變體中，該基因的表達(dá)模式均呈現(xiàn)先上升后降低的變化規(guī)律。在蚜蟲取食的最初24 h，該基因在HN 16和感蚜突變體間沒有明顯差異，但當(dāng)蚜蟲取食48 h后，HN 16中的表達(dá)量顯著高于突變體，蚜蟲取食72 h后突變體中的表達(dá)量顯著下降，但在HN 16中則始終維持在相對(duì)穩(wěn)定的水平，說明該基因在RMES1介導(dǎo)的抗蟲反應(yīng)中發(fā)揮著積極作用。

圖4　抗壞血酸過氧化物酶基因 (Sb 002 G 4311001)的表達(dá)模式分析

3　討　論

活性氧(ROS) 對(duì)病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用，能使植株產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)[11]，關(guān)于ROS在抗病中的研究已有諸多報(bào)道[12]，然而，對(duì) ROS 在植物抗蟲中所起作用的研究，目前尚不多見。已有研究表明，活性氧在水稻抗亞洲稻癭蚊(Orseoliaoryzae)[13]和灰飛虱(Laodelphaxstriatellus)[14]，以及小麥抗黑森癭蚊(Mayetioladestructor)[15]中起著重要作用。

本研究選取高粱抗蚜品種HN 16 (包含RMES1基因) 和感蚜突變體(RMES1突變) 作為研究材料，對(duì)蚜蟲取食過程中活性氧途徑關(guān)鍵基因——抗壞血酸過氧化物酶基因 (Sb 002 G 431100) 的表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該基因的表達(dá)在2種材料中均呈現(xiàn)先上升后降低的規(guī)律。在蚜蟲未侵染及侵染程度較低時(shí) (0～24 h)，該基因在2種材料間的表達(dá)量沒有明顯差異，但當(dāng)蚜蟲取食較為嚴(yán)重時(shí) (48 h后)，HN 16中的表達(dá)量顯著高于突變體，特別是蚜蟲取食72 h后，突變體中的表達(dá)量顯著下降，但在HN 16中則始終維持在相對(duì)穩(wěn)定的水平，說明該基因在RMES1介導(dǎo)的抗蟲反應(yīng)中發(fā)揮著積極作用。為了準(zhǔn)確全面探明活性氧在高粱抗蚜反應(yīng)中的作用機(jī)制，下一步還需對(duì)活性氧途徑中的多個(gè)關(guān)鍵基因及抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)進(jìn)行系統(tǒng)研究。

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