張　鵬，周　蘭，席曉圓，德　格，柯友勝，劉　盼，宋發(fā)軍

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430074)

紫杉醇是分離自紅豆杉的具有促進(jìn)微管蛋白聚合及抑制細(xì)胞有絲分裂的獨(dú)特抗癌藥物[1]，但由于植物的藥用成分含量受其品種、生長(zhǎng)環(huán)境和采集季節(jié)等因素的影響較大[2]，且紅豆杉野生資源匱乏，因此，僅依靠從紅豆杉中提取紫杉醇無(wú)法滿足市場(chǎng)需求. 植物內(nèi)生菌是一類(lèi)生活在健康植物組織和器官內(nèi)的微生物類(lèi)群[3]，許多植物內(nèi)生菌可生產(chǎn)與宿主植物相同的生物活性物質(zhì)．1993年首次發(fā)現(xiàn)紅豆杉內(nèi)生真菌Taxomycesandreanae[4]可以產(chǎn)紫杉醇，目前已分離了20多個(gè)屬的上百株可產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌[5,6].但紫杉醇產(chǎn)量較低和不穩(wěn)定等因素制約了產(chǎn)紫杉醇真菌的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用[7].提高真菌紫杉醇產(chǎn)量的方法包括發(fā)酵條件優(yōu)化[7]、誘變育種[8,9]及基因工程育種[10]等，其中通過(guò)基因工程手段構(gòu)建紫杉醇穩(wěn)定高產(chǎn)菌株是實(shí)現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的主要途徑之一[11,12].目前關(guān)于真菌紫杉醇的合成相關(guān)酶類(lèi)基因的報(bào)道極少[13]，因此，開(kāi)發(fā)真菌的紫杉醇合成相關(guān)基因資源并明晰其功能成為解決真菌紫杉醇產(chǎn)量低及不穩(wěn)定等問(wèn)題的關(guān)鍵.

枝狀枝孢霉(簡(jiǎn)稱(chēng)枝霉，MD2)是本實(shí)驗(yàn)室從曼地亞紅豆杉分離的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌[14].本研究在完成枝霉MD2基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，分析各基因響應(yīng)茉莉酸甲酯(MeJA)誘導(dǎo)的表達(dá)特征，選擇UnigeneA03231(簡(jiǎn)稱(chēng)A03231)為研究對(duì)象，克隆其DNA及cDNA全長(zhǎng)序列，分別采用Southern blot和qRT-PCR技術(shù)分析其在基因組中的拷貝數(shù)以及響應(yīng)MeJA誘導(dǎo)的表達(dá)特征，并采用生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，構(gòu)建該基因的原核表達(dá)菌株，初步優(yōu)化其誘導(dǎo)表達(dá)條件.

1　材料與方法

1.1　材料和儀器

枝霉MD2、E.coliBL21(DE3)和載體pET-32a(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存.T4 DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶等(Takara)，Trizol reagent RNA提取液(Invitrogen)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo)，Realtime PCR Master Mix(TOYOBO)，DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit(Roche), 其他分析純?cè)噭┵?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.擴(kuò)增產(chǎn)物由武漢擎科偉業(yè)生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定.

冷凍離心機(jī)(Centrifuge 5424R, Eppendorf)，PCR儀(C1000 Touch, Bio-Rad)，7500 Fast Real-Time PCR System(Quantstudio 5, Applied Biosystems).

1.2　枝霉MD2基因組DNA和RNA的提取

將枝霉MD2接種于YES培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)5 d后，采用SDS-CTAB法[15]提取其基因組DNA.添加終濃度為100 μmol/L的MeJA，并分別于0, 6, 12, 18, 24, 30 h收集菌體，用Trizol試劑分別提取其總RNA，并用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成其第一鏈cDNA[16].

1.3　A03231 DNA和cDNA全長(zhǎng)序列的克隆

分別以枝霉MD2的基因組DNA和總RNA做模版，采用引物A03231-F1：5′- ATGGCTTCAACAACATTAGC-3′和A03231-R1：5′-TCAAAACGCCATCCTCAACT-3′擴(kuò)增A03231的全長(zhǎng)序列.

1.4　A03231的拷貝數(shù)及響應(yīng)MeJA誘導(dǎo)表達(dá)特征的分析

用A03231全長(zhǎng)序列中不含有的SmaI和EcoR I完全消化枝霉MD2的基因組DNA，電泳分離后，根據(jù)DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I說(shuō)明書(shū)，以A03231的DNA全長(zhǎng)序列為探針進(jìn)行Southern blot分析該基因的拷貝數(shù).

用于qRT-PCR分析的A03231引物為A03231-F2：5′-GCTTATGAAAATGGCATCGG-3′和A03231-R2：5′-CGAGGTGATGTCTACTGTGC-3′，內(nèi)參基因18S rDNA引物為18S F: 5′-AGCAACTATACGGTGAAACTG-3′ 和18S R: 5′-TCTAATAAATACACCCCTTCC-3′，按照SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR分析，重復(fù)3次.

1.5　A03231的生物信息學(xué)分析

采用Vector NTI比對(duì)A03231的DNA序列與cDNA序列，分析其是否有內(nèi)含子.采用Blastp(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast), ProtParam(http:∥web.expasy.org/protparam/),ProtScale(http:∥web.expasy.org/protscale/),TMHMM(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/),SignalP 4.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/),SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)和PHYRE2(http:∥www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)分別預(yù)測(cè)A03231編碼蛋白的同源性、親疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)等.

1.6　A03231原核表達(dá)載體的構(gòu)建

用含有酶切位點(diǎn)的引物A03231-F3(5′-AAAGAATTCGCTTCAACAACATTAGCCCA-3′，引入EcoR I位點(diǎn))和A03231-R3(5′-AAAGCGGCCGCTCAAAACGCCATCCTCAACT-3′，引入NotI位點(diǎn))擴(kuò)增A03231序列，經(jīng)相應(yīng)內(nèi)切酶消化后回收目標(biāo)片段，與相同內(nèi)切酶消化的pET-32a(+)連接獲得原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-A03231，并轉(zhuǎn)化E.coliBL21獲得原核表達(dá)菌株pET-32a-A03231/E.coliBL21.

1.7　誘導(dǎo)表達(dá)條件的初步優(yōu)化

分別將含有pET-32a(對(duì)照)和pET-32a-A03231的菌株接種到含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃,180 r/min下培養(yǎng)至OD600=0.4～0.6后，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，12000 r/min離心3 min收集菌體，用PBS緩沖液重懸沉淀，加入5×蛋白Loading buffer混勻，煮沸5～10 min，離心取上清液于SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色并脫色后檢測(cè)目標(biāo)基因的表達(dá).在此基礎(chǔ)上，依次優(yōu)化IPTG的誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑量、誘導(dǎo)時(shí)間，初步獲得該基因較適的原核表達(dá)條件.

2　結(jié)果與分析

2.1　A03231的克隆

分別用SDS-CTAB法和Trizol試劑盒提取枝霉MD2的基因組DNA(圖1A)和總RNA(圖1B)后，分別以其基因組DNA和cDNA為模板擴(kuò)增A03231(圖1C)并測(cè)序，結(jié)果表明A03231長(zhǎng)度為918 bp，無(wú)內(nèi)含子.

M1：DL15000 Marker; M2：DL2000 Marker A) 1為枝霉MD2基因組DNA；B) 1～6分別為枝霉MD2經(jīng)MeJA誘導(dǎo)0, 6, 12, 18, 24, 30 h RNA; C) 1, 2分別為A03231 DNA和cDNA全長(zhǎng)序列擴(kuò)增產(chǎn)物圖1　枝霉MD2的基因組DNA(A), 總RNA(B)和A03231的克隆(C)Fig.1　Genomic DNA (A), total RNA (B) of C. cladosporioides MD2 and cloning of A03231 (C)

2.2　 A03231的拷貝數(shù)分析和響應(yīng)MeJA誘導(dǎo)的表達(dá)特征分析

以A03231基因全長(zhǎng)序列做探針進(jìn)行Southern blot分析，結(jié)果表明A03231在染色體上以單拷貝形式存在(圖2A).以不經(jīng)MeJA誘導(dǎo)的枝霉MD2為對(duì)照，qRT-PCR分析誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)的A03231表達(dá)水平(圖2B)，結(jié)果表明：在30 h誘導(dǎo)處理范圍內(nèi)，A03231的表達(dá)量隨MeJA誘導(dǎo)表現(xiàn)為先升高后降低；但在30 h，其表達(dá)水平仍然高于0 h，說(shuō)明MeJA誘導(dǎo)處理提高了A03231的表達(dá)量.

M : λ-EcoT14 I digest圖2　A03231的拷貝數(shù)分析(A)和響應(yīng)MeJA誘導(dǎo)的表達(dá)特征分析(B)Fig.2　Copy numbers analysis of A03231 (A) and its expression characteristics in response to MeJA (B)

2.3　 A03231的生物信息學(xué)分析

用Blastp軟件在線分析A03231，并與一致性較高的蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果見(jiàn)圖3.圖3顯示A03231編碼蛋白與Solanumlycopersicum的3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase(GenBank：NP 001296810.1)一致性為68%；與ColletotrichumorbiculareMAFF 240422的short chain dehydrogenase/reductase(GenBank：ENH82870.1)一致性為64%；與Penicilliumgriseofulvum的Short-chain dehydrogenase/reductase SDR(GenBank：KXG49772.1)一致性為63%；與AspergillusfischeriNRRL 18的NADP(+)-dependent dehydrogenase(GenBank：XP 001258531.1)一致性為62%；與Aspergilluscalidoustus的short chain dehydrogenase/reductase(GenBank：CEL06036.1)一致性為61%；與Colletotrichumchlorophyti的3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] reductase (GenBank：OLN97504.1)一致性為60%.

圖3　 A03231的進(jìn)化分析Fig.3　Evolutionary analysis of A03231

經(jīng)ProtParam預(yù)測(cè)，A03231編碼產(chǎn)物的相對(duì)分子量為33071.5 Da，等電點(diǎn)(pI)為5.69，不穩(wěn)定指數(shù)為38.17，脂肪指數(shù)為87.77，分子式為C1457H2314N406O448S12.經(jīng)ProtScale預(yù)測(cè)，A03231編碼蛋白為親水性蛋白(圖4A).經(jīng)TMHMM和SignalP 4.1預(yù)測(cè)，A03231編碼蛋白不存在信號(hào)肽，但是存在2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu).經(jīng)PHYRE 2預(yù)測(cè)，A03231編碼蛋白存在8個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)、8個(gè)延伸鏈(圖4B).經(jīng)SMART預(yù)測(cè)，A03231編碼蛋白在N端含有ADH(Alcohol dehydrogenases)short C2和ADH short結(jié)構(gòu)域(圖4C).經(jīng)PHYRE 2預(yù)測(cè)，A03231編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)含有與NAD(P)結(jié)合的Rossmann折疊結(jié)構(gòu)域(圖4D,詳見(jiàn)鏈接：http:∥www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/phyre2_output/5a57abf9549d41f0/summary.html)

A) 親疏水性分析；B) 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析；C) 二級(jí)結(jié)構(gòu)域分析；D) 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖4　 A03231的生物信息學(xué)分析Fig.4　Bioinformatics analysis of A03231

2.4　 A03231原核表達(dá)菌株的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)條件的初步優(yōu)化

將表達(dá)載體pET-32a-A03231用EcoR I和NotI酶切驗(yàn)證后(圖5A)，轉(zhuǎn)化E.coliBL21獲得重組菌株pET-32a-A03231/E.coliBL21.重組菌株和對(duì)照菌株(pET-32a/E.coliBL21)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE電泳檢測(cè)(圖5B)，結(jié)果表明：與對(duì)照相比，pET-32a-A03231/E.coliBL21表達(dá)出符合預(yù)期大小的目標(biāo)蛋白，即His-A03231融合蛋白，約45 KD(12 KD+33.07KD)，表明A03231在E.coliBL21中成功表達(dá).

之后，依次優(yōu)化了誘導(dǎo)溫度(圖5B)、IPTG劑量(圖5C)和誘導(dǎo)時(shí)間(圖5D)對(duì)A03231在E.coliBL21中表達(dá)的影響，初步獲得了A03231的較適誘導(dǎo)表達(dá)條件為：誘導(dǎo)溫度為28 ℃，IPTG 濃度為0.6 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為8 h.

3　討論

短鏈脫氫酶/還原酶(SDRs)是一大類(lèi)利用NAD(P)H作為氫供體將羰基化合物還原為相應(yīng)醇化合物的蛋白質(zhì)超家族，其蛋白質(zhì)成員由250～300個(gè)氨基酸組成，且序列相似度僅為15%～30%[17].雖然超家族成員的序列有很大的差異性，但它們都含有保守的Rossmann-fold折疊結(jié)構(gòu)域[18].短鏈脫氫酶能將甾體、前列腺素、脂肪酮、芳香酮等底物催化還原為重要醫(yī)學(xué)中間體醇，具有重要的醫(yī)學(xué)與工業(yè)價(jià)值[19].

紫杉醇是二萜類(lèi)化合物，合成途徑涉及多個(gè)脫氫酶/還原酶，其中屬于甲羥戊酸途徑的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)活性和表達(dá)量的增加有助于提高紫杉醇以及倍半萜類(lèi)的合成.枝霉MD2是一株產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌，MeJA[20-22]誘導(dǎo)可以提高其紫杉醇產(chǎn)量，UnigeneA03231是響應(yīng)MeJA誘導(dǎo)而表達(dá)水平提高的一個(gè)候選基因，三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明UnigeneA03231編碼蛋白含有典型的Rossmann-fold結(jié)構(gòu)域，屬于短鏈脫氫酶家族.UnigeneA03231與紫杉醇合成相關(guān)的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)有68%的一致性，UnigeneA03231可能具有與HMGR 相似的功能，參與了枝霉MD2的紫杉醇的合成和調(diào)控.因此，深入研究A03231的功能有助于揭示枝霉MD2紫杉醇合成的分子機(jī)理. 關(guān)鍵酶基因的原核表達(dá)條件優(yōu)化是大量分離和純化目標(biāo)蛋白及研究酶蛋白生物催化功能的前提[23].而本研究對(duì)UnigeneA03231的克隆、序列分析以及誘導(dǎo)表達(dá)條件的分析，可為后期深入研究該基因的催化功能奠定基礎(chǔ).

M：DL15000 Marker; M1低分子量蛋白Marker 20.1～ 97. 4 KDa A) 1為pET-32a-A03231的酶切分析；B) 1～5分別為pET-32a-A03231/E.coli BL21在20, 25, 28, 32, 37 ℃誘導(dǎo)溫度下的表達(dá)情況(1 mmol/L IPTG，誘導(dǎo)4 h)，6為對(duì)照；C) 1～8分別為pET-32a-A03231/E.coli BL21經(jīng)0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)情況(28℃，誘導(dǎo)4 h)，9為對(duì)照；D) 1～6分別為pET-32a-A03231/E.coli BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4, 6, 8, 10, 12, 14 h的表達(dá)情況(28 ℃，1 mmol/L IPTG)，7為對(duì)照?qǐng)D5　pET-32a-A03231質(zhì)粒的酶切分析及其在E.coli BL21表達(dá)條件的優(yōu)化Fig.5　Restriction digestion of pET-32a-A03231 and optimization of its expression conditions in E.coli BL21

[1]Schiff P B,Fant J,Horwitz S B. Promotion of microtubule assemblyinvitroby Taxol[J]. Nature,1979, 277(5698): 665-667.

[2]宋發(fā)軍， 黃珍， 羅忠,等. 代謝組學(xué)及其在藥用植物研究中的應(yīng)用[J].中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016,35(2),36-41.

[3]宋發(fā)軍,于鵬飛,劉佳,等. 促進(jìn)種子萌發(fā)的重樓內(nèi)生菌的篩選[J].中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2015,34(3),29-32.

[4]Stierle A,Strobel G,Stierle D. Taxol and taxane production byTaxomycesandreanae,an endophytic fungus of Pacific yew[J]. Science,1993,260(5105): 214-216.

[5]Zhou X W,Zhu H F,Liu L,et al. A review: recent advances and future prospects of taxol-producing endophytic fungi[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2010,86(6): 1707-1717.

[6]Ji Y,Bi J N,Yan B,et al. Taxol-producing fungi: a new approach to industrial production of taxol[J]. Chin J Biotech,2006,22(1):1-6.

[7]苗莉云,張鵬,劉博,等. 產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌Z58的分離和鑒定[J]. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2012,28(12): 1141-1146.

[8]Heinig U,Scholz S,Jennewein S. Getting to the bottom of Taxol biosynthesis by fungi[J]. Fungal Divers,2013,60(1): 161-170.

[9]趙凱,周東坡,平文祥,等. 紫杉醇產(chǎn)生菌Nodulisporiumsylviforme原生質(zhì)體誘變研究[J]. 中國(guó)生物工程雜志,2004,24(9):63-68.

[10]Kan Z,Yuan Y,Ping W,et al. Improved taxol production inNodulisporiumsylviformederived from inactivated protoplast fusion[J]. Afr J Biotechnol,2011,10(20): 4175-4182.

[11]張昕欣,吳翰桂,奚立民,等. 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的研究進(jìn)展[J]. 化工進(jìn)展,2012,31(2): 392-396.

[12]Long D M,Smidansky E D,Archer A J,et al.Invivoaddition of telomeric repeats to foreign DNA generates extrachromosomal DNAs in the taxol-producing fungusPestalotiopsismicrospora[J]. Fungal Genet Biol,1998,24(3): 335-344.

[13]席曉圓,張鵬,宋發(fā)軍,等. 枝狀枝孢霉MD2的UnigeneA09801克隆與原核表達(dá)分析[J]. 生物學(xué)雜志,2016,33(4):1-4.

[14] Zhang P,Zhou P P,Yu L J. An endophytic taxol-producing fungus from Taxus media,CladosporiumcladosporioidesMD2 [J]. Curr Microbiol,2009,59(3): 227-232.

[15]苗莉云,張鵬. 鹽湖土壤微生物總DNA提取方法的比較[J],浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,24(6): 1086-1090.

[16]張新茹，趙煒，王冬雪，等.紅景天苷改善+鼠原代肝細(xì)胞糖脂代謝紊亂機(jī)制[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2017，36(11)：1260-1263.

[17]Persson B,Kallberg Y,Bray J E,et al. The SDR (short-chain dehydrogenase/reductase and related enzymes) nomenclature initiative[J]. Chem Biol Interact,2009,178(1/3): 94-98.

[18]Joernvall H,Persson B,Krook M,et al. Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR)[J]. Biochemistry,1995,34(18): 6003-6013.

[19]Kavanagh K L,Joernvall H,Persson B,et al. Medium- and short-chain dehydrogenase/reductase gene and protein families: the SDR superfamily:functional and structural diversity within a family of metabolic and regulatory enzymes[J]. Cell Mol Life Sci,2008,65(24): 3895-3906.

[20]陳大華,葉和春. 植物類(lèi)異戊二烯代謝途徑的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].植物學(xué)報(bào),2000,42(6): 551-558.

[21]賈寧,仇燕. 紫杉醇生物合成相關(guān)酶類(lèi)的研究進(jìn)展[J]. 生物學(xué)雜志,2002,18(6): 9-12.

[22]劉智,余龍江,趙春芳. 基于定量PCR技術(shù)探討紫杉醇生物合成的限速步驟[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2005,25(11): 2213-2218.

[23]吳云華,肖虔. 重組擬南芥細(xì)胞色素P450 707A3在大腸桿菌中的原核表達(dá)[J].中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2017,36(1),28-31.