何冬蘭，薛芷筠，張澤文，王　怡，程國(guó)軍，李曉華，田貞環(huán)

(1中南民族大學(xué) 湖北省微生物資源與利用工程技術(shù)研究中心，武漢 430074；2 宜昌銀澤源農(nóng)業(yè)科技有限公司，宜昌 443500)

資木瓜[ChaenomelesSpeciosa(sweet) Nakai]為湖北省長(zhǎng)陽(yáng)資丘特產(chǎn)的皺皮木瓜，又名貼梗海棠，是薔薇科(Rosaceae)木瓜屬(Chaemoneles)的成熟果實(shí)[1]，是一種藥食價(jià)值兼具的水果，民間更是有“杏一益，梨二益，木瓜百益”之說(shuō)，為湖北省的十大道地藥材之一. 資木瓜主要含有有機(jī)酸、多酚類化合物、三萜酸、糖、維生素等成分[2-5]. 其中多酚化合物是一類具有獨(dú)特藥效和生理活性的天然產(chǎn)物[6]，大量研究結(jié)果表明植物多酚具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤，防治肺動(dòng)脈高壓等作用[7-12]，在美容、制藥、醫(yī)療等行業(yè)極具開(kāi)發(fā)前景，但有關(guān)資木瓜多酚的研究以及微波提取工藝的研究目前尚鮮有報(bào)道[3]，本實(shí)驗(yàn)擬采用微波輔助乙醇提取資木瓜多酚類化合物，在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上采用正交設(shè)計(jì)，確定資木瓜多酚的最佳提取方法，為資木瓜的深度開(kāi)發(fā)提供依據(jù).

1　實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

資木瓜(產(chǎn)地湖北省宜昌市長(zhǎng)陽(yáng)縣榔坪鎮(zhèn))，沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司，純度98%)，無(wú)水乙醇、鎢酸鈉、鉬酸鈉、85%磷酸、濃鹽酸、硫酸鋰、液溴、碳酸鈉均為分析純.

1.2　實(shí)驗(yàn)儀器

FW250中藥粉碎機(jī)(鄭州科豐公司)，MAS-ⅡPLUS常壓微波萃取反應(yīng)工作站(上海新儀公司)，UV-3100BPC分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)公司)，HH-2恒溫水浴鍋(金壇市科興儀器廠)，HR/T16MT臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南赫西公司)，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，SHB-3循環(huán)水式真空泵(鄭州杜甫儀器廠).

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1　沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取0.010 g沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品置于燒杯中，加水溶解，轉(zhuǎn)移溶液至100 mL容量瓶，定容至刻度線. 分別吸取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL上述標(biāo)準(zhǔn)液加入到10 mL的具塞比色管中，添加1 mL制備好的Folin-ciocalteu試劑[13]，充分混勻后，加入2 mL 15%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至刻度. 室溫靜置反應(yīng)2 h，于765 nm處測(cè)定吸光度. 以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[14].

2.2　資木瓜多酚的提取與測(cè)定

準(zhǔn)確稱取資木瓜干粉100.00 g，按照料液比1∶10加入95%乙醇，回流2 h，抽濾除去乙醇后，烘干，除去部分色素和脂溶性物質(zhì)[14]. 準(zhǔn)確稱取1.0 g脫脂資木瓜干粉，按照一定料液比加入一定體積的乙醇溶液后，一定功率的微波處理一定時(shí)間后，提取液在4 ℃、7000 r/min離心10 min后，保留上清液，加入相同體積的乙醇溶液洗滌沉淀，再次離心后合并上清液，減壓濃縮，收集殘留物，用蒸餾水定容至20 mL. 吸取0.1 mL多酚粗提液于10 mL比色管中，加入Folin-ciocalteu試劑1 mL、15%Na2CO3溶液2 mL，用蒸餾水定容至10 mL，充分混勻后，靜置反應(yīng)2 h，稀釋兩倍，于765 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多酚含量.

2.3　單因素實(shí)驗(yàn)

微波法提取木瓜過(guò)程中，影響多酚最終提取率的因素頗多，本研究著力從微波功率、微波時(shí)間、乙醇濃度以及料液比4個(gè)方面優(yōu)化多酚提取工藝，利用單因素實(shí)驗(yàn)觀察以上4個(gè)因素對(duì)多酚提取的影響.

2.3.1微波功率對(duì)資木瓜多酚得率的影響

稱取1.0 g脫脂木瓜干粉，按照料液比1∶25、乙醇濃度60%、微波時(shí)間60 s，分別采用300、500、700、900 w的微波功率提取多酚，測(cè)定多酚含量.

2.3.2微波時(shí)間對(duì)資木瓜多酚得率的影響

稱取1.0 g脫脂木瓜干粉，按照料液比1∶25、乙醇濃度60%、微波功率700 W，分別采用30、60、90、120 s的微波時(shí)間提取多酚，測(cè)定多酚含量.

腫瘤治療包括手術(shù)、化療、放療等，治療費(fèi)用較高，且部分病人因疾病影響，身體素質(zhì)減弱，不能承受原本工作壓力，收入減少，進(jìn)一步加重家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。病人2:“這病又治不好，還花這么多錢(qián)，啥時(shí)候是個(gè)頭?！辈∪?：“以前家里老人、孩子都靠我掙錢(qián)養(yǎng)家，現(xiàn)在有了這個(gè)病，也不能出去打工了，只能在老家找點(diǎn)輕松的活?！贝送猓t(yī)療費(fèi)用支付方式對(duì)病人服藥依從性有重要影響，其中公費(fèi)病人服藥依從性高于有醫(yī)療保險(xiǎn)病人，有醫(yī)療保險(xiǎn)病人服藥依從性高于自費(fèi)病人[14]。病人5：“這個(gè)升白細(xì)胞藥多少錢(qián),貴不？給報(bào)銷不？盡量給我開(kāi)一些可以報(bào)銷的藥?！辈∪?：“我是自費(fèi)，看病都是自己掏錢(qián)，細(xì)胞偏低一點(diǎn)沒(méi)事，我多吃點(diǎn)(白細(xì)胞)就上來(lái)了”。

2.3.3乙醇濃度對(duì)資木瓜多酚得率的影響

稱取1.0 g脫脂木瓜干粉，按照料液比1∶25、微波功率500 W、微波時(shí)間60 s，分別采用40%、50%、60%、70%的乙醇濃度提取多酚，測(cè)定多酚含量.

2.3.4料液比對(duì)皺皮木瓜多酚得率的影響

稱取1.0 g脫脂木瓜干粉，按照微波功率500 W、微波時(shí)間60 s、乙醇濃度50%，分別采用1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的料液比提取多酚，測(cè)定多酚含量.

2.4　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，每個(gè)因素取3個(gè)水平，按照L9 ( 34)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定多酚含量，并進(jìn)行方差分析，確定最優(yōu)提取方案.

2.5　數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

利用IBM SPSS Statistics軟件進(jìn)行正交設(shè)計(jì)和分析，利用OriginPro 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖.

3　結(jié)果與分析

3.1　標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=103.11x-0.2679，R2=0.9987，式中x為沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度 ( mg /mL ) ，y為吸光度值. 各濃度及其對(duì)應(yīng)的OD值見(jiàn)表1.

表1　標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量結(jié)果Tab. 1　Standard curve measurement results

3.2　單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.2.1微波功率對(duì)資木瓜多酚得率的影響

由圖1可知，微波功率對(duì)多酚提取效果影響較大，吸光度隨著微波功率的變化而變化，當(dāng)微波功率在300～700 W時(shí)，隨著多酚濃度提高吸光度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在700 W時(shí)達(dá)到最大值0.8555. 微波功率在700～900 W時(shí)，多酚濃度降低. 其原因可能是當(dāng)微波功率大于700 W時(shí)，微波產(chǎn)生的熱量過(guò)多，破壞了部分多酚的結(jié)構(gòu)，吸光度下降[15](以下吸光度值均為稀釋兩倍后測(cè)得).

圖1　微波功率對(duì)多酚得率的影響Fig.1　Effect of microwave power on the yield of polyphenols

3.2.2微波時(shí)間對(duì)資木瓜多酚得率的影響

微波時(shí)間在30～60 s時(shí)，隨著微波作用時(shí)間的延長(zhǎng)，多酚不斷溶解，吸光度呈明顯上升趨勢(shì)，在60 s時(shí)達(dá)到最大值0.917(圖2). 當(dāng)微波時(shí)間大于60 s時(shí)，多酚濃度下降，吸光度幾乎呈直線下降趨勢(shì)，原因可能是微波作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)致使熱量過(guò)高，從而破壞了多酚的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致多酚含量下降.

圖2　微波時(shí)間對(duì)多酚得率的影響Fig.2　Effect of microwave time on the yield of polyphenols

3.2.3乙醇濃度對(duì)資木瓜多酚得率的影響

由圖3可以看出，隨著乙醇濃度的增加，吸光度先增大后逐漸減小，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，吸光度值達(dá)到最大值0.989.多酚類物質(zhì)在植物中常以氫鍵和疏水鏈的形式與蛋白質(zhì)、多糖結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物.當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)過(guò)低時(shí)，不足以與多酚類物質(zhì)形成氫鍵同原有氫鍵競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致最終提取的多酚含量不高[16]；乙醇的體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，溶劑極性降低，導(dǎo)致多酚得率下降，脂溶性物質(zhì)溶出增多[17].

圖3　乙醇濃度對(duì)多酚得率的影響Fig.3　Effect of ethanol concentration on the yield of polyphenols

3.2.4料液比對(duì)資木瓜多酚得率的影響

料液比為1∶25時(shí)，吸光度值最大為0.743(圖4). 料液比在1∶25的基礎(chǔ)上，增加或減少，多酚濃度均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，吸光度值減小，原因可能是增加溶劑有利于多酚的溶出[18]，但是當(dāng)料液比高于1∶25后，由于溶劑過(guò)多，同樣的微波條件下的熱量不足以促使更多多酚溶出,因而多酚含量下降.

圖4　料液比對(duì)多酚得率的影響Fig.4　Effect of liquid ratio on the yield of polyphenols

3.3　正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定微波提取資木瓜多酚的最佳工藝條件分別為：微波功率700 W，微波時(shí)間60 s，乙醇濃度50%，料液比1∶25.以上條件作為參考，對(duì)微波功率、微波時(shí)間、乙醇濃度、料液比進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì). 因素與水平見(jiàn)表2，正交方案及結(jié)果分析見(jiàn)表3.

表2　正交試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)Tab.2　Orthogonal L9(34)factors and levels

由表3可見(jiàn)微波法提取資木瓜多酚正交試驗(yàn)各處理?xiàng)l件下的多酚含量，對(duì)該結(jié)果進(jìn)行極差分析可知，在微波提取過(guò)程中，各因素對(duì)多酚得率的影響次序?yàn)椋篊(乙醇濃度)>A(微波功率)>D(料液比)>B(微波時(shí)間),為實(shí)現(xiàn)多酚得率最大化，應(yīng)采用A1B3C1D2組合條件進(jìn)行資木瓜多酚的微波提取，也即微波功率500 W,微波時(shí)間90 s，乙醇濃度40%，料液比1∶25.

表3　正交方案及結(jié)果Tab.3　Design and results of L9(34)Orthogonal test

3.4　驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，稱取4份1.0 g脫脂木瓜干粉，每份按照上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，所提取的多酚含量分別為44.99 mg/g、45.11 mg/g、45.42 mg/g、45.81 mg/g，平均含量為45.34 mg/g，與正交試驗(yàn)第6組條件(A2B3C1D2)的提取結(jié)果相近，且兩組提取條件的差別也僅限于微波功率，因此正交試驗(yàn)結(jié)果所得到的提取條件是可靠的，為實(shí)現(xiàn)提取效率最大化，將最優(yōu)提取條件定為A2B3C1D2，也即微波功率700 W,微波時(shí)間90 s，乙醇濃度40%，料液比1∶25.

4　結(jié)語(yǔ)

以資木瓜為原料采用微波輔助提取木瓜多酚，通過(guò)單因素試驗(yàn)以及正交設(shè)計(jì)優(yōu)化出最佳提取方案：微波功率700 W,微波時(shí)間90 s，乙醇濃度40%，料液比1∶25，利用該工藝提取所得的資木瓜多酚含量為：47.27 mg/g，得率為4.73%. 該方法較常規(guī)浸提法具有提取時(shí)間短、提取效率高的優(yōu)點(diǎn)，為提高資木瓜的經(jīng)濟(jì)效益奠定了初步的技術(shù)基礎(chǔ).

[1]管兆國(guó).我國(guó)木瓜種質(zhì)資源[J].山西果樹(shù)，2017(1)：5-8.

[2]蔡娟，劉世堯，韋正鑫，等.皺皮木瓜皮渣齊墩果酸和熊果酸提取工藝優(yōu)化研究[J].食品工業(yè)科技，2015，36(2): 282-285; 290.

[3]賈云莉，李世剛，柳蔚，等. 資木瓜總苷對(duì)大鼠嗜堿性白血病-2H3肥大細(xì)胞脫顆粒的作用[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，35(8)：819-822.

[4]田冰梅，謝曉梅，沈盼盼,等.分級(jí)醇沉宣木瓜多糖含量、分子量測(cè)定和活性初步研究[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2015, 35(5): 1331-1334.

[5]Zhang S Y, Han L Y, Zhang H, et al.Chaenomelesspeciosa: a review of chemistry and pharmacology[J]. Biomedical Reports, 2014, 2(1): 12-18.

[6]南楠.植物多酚的生物學(xué)功能及其在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].飼料博覽，2017(5):37-39,43.

[7]符莎露，吳甜甜，吳春華，等.植物多酚的抗氧化和抗菌機(jī)理及其在食品中的應(yīng)用[J].食品工業(yè)，2016,37(6)：242-246.

[9]嚴(yán)正強(qiáng)，張琴，楊遠(yuǎn)清.茶多酚對(duì)前列腺癌PC-3M細(xì)胞CyclinD1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響[J].現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)， 2017,29(6)：705-706，711.

[10]李峰，王延偉，俞力超，等.四角菱莖多酚的超聲提取工藝優(yōu)化及體外抗腫瘤活性研究[J].中國(guó)藥房，2017，27(31):4414-4416.

[11]Xie X F, Zou G L, Li C H. Antitumor and immunomo-dulatory activities of water-soluble polysaccharide fromChaenomelesspeciose[J]. Carbohyd Polym, 2015, 132(5): 323-329.

[12]孟涵燕，趙潔，李依玲,等.植物多酚防治肺動(dòng)脈高壓的研究進(jìn)展[J]. 四川生理科學(xué)雜志，2017,39(3):156-158.

[13]Yoo K S，Lee E J，Leskovar D，et al. Development of an automated method for Folin - Ciocalteu total phenolic assay in artichoke extracts[J].J Food Sci，2012，77 (12) :C1279-C1284.

[14]李芳,李世剛,唐永莉,等.資木瓜多糖的提取和含量測(cè)定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012，40(29):14197-14198，14278.

[15]李育峰，劉美榮，張賀.杏仁皮多酚的微波提取工藝研究[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016,44(2)：159-161.

[16]裘愛(ài)泳，劉軍海，張海暉.植物多酚提取和應(yīng)用[J]. 糧食與油脂，2003(6)：10-11.

[17]張玉香，曲慧鴿，張潤(rùn)亞，等.響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)莓葉黃酮的微波提取工藝[J].食品科學(xué)，2010,31(16):33-37.

[18]王文昕，董全.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取花生紅衣多酚工藝[J]. 食品科學(xué)，2012,33(22)：1-5.