馬宗桓，陳佰鴻，毛　娟，胡紫璟，李文芳

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，蘭州 730070)

氮素是葡萄生長發(fā)育中必需元素之一，施用氮素可直接影響到葡萄的正常生長和產(chǎn)量形成。目前，在生產(chǎn)中存在施氮過量、施肥方式不合理等問題。當(dāng)前，一次性基施氮肥是生產(chǎn)中普遍的施肥方式，造成了前期氮肥的嚴(yán)重流失和后期的氮素虧缺。因此，合理施肥技術(shù)是提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要途徑，目前施肥技術(shù)主要是指在施肥量、施肥時(shí)期和施肥種類等方面的調(diào)控。由于作物不同生育時(shí)期需肥規(guī)律不同，按照時(shí)期進(jìn)行施肥對(duì)提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的影響。氮肥合理施用能夠使葡萄生長迅速，促進(jìn)葡萄萌發(fā)和花芽分化，提高座果率，增加產(chǎn)量，改善果實(shí)品質(zhì)[1]。研究表明，在葡萄生長后期過多的氮素會(huì)使?jié){果著色差，香氣成分少，含糖量低，含酸量高，導(dǎo)致果實(shí)品質(zhì)差[2]。張志勇等[3]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氮肥應(yīng)重點(diǎn)施于葡萄花期之前，漿果膨大期至著色期可再適當(dāng)補(bǔ)施。而馮國明[4]認(rèn)為在葡萄生長周期中，花期至幼果膨大期對(duì)氮素的需求量最大，從果實(shí)著色期開始逐漸減少，果實(shí)成熟期吸收最少，待葡萄收獲后，在葡萄再次生根時(shí)進(jìn)一步吸收氮素。在新梢旺長期和漿果膨大期，葡萄吸收氮素量分別占其年周期內(nèi)吸收氮素總量的24.5%和34.9%[5]。葡萄采收后，結(jié)合施基肥適當(dāng)施一些速效性氮肥，有利于其后期葉片的光合作用、樹體貯藏養(yǎng)分的積累。

植物對(duì)氮的同化方式是將NO3-轉(zhuǎn)化為NH4+，然后經(jīng)過一系列復(fù)雜的酶促反應(yīng)將NH4+同化吸收，而在這一過程中，硝酸還原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合成酶(GOGAT)和谷氨酸脫氫酶(GDH)是關(guān)鍵的調(diào)節(jié)酶，在氮素同化過程中扮演重要角色[6]。關(guān)于釀酒葡萄氮代謝酶和相關(guān)基因的表達(dá)已經(jīng)有較為廣泛的研究[7-10]。初建青等[11]利用Vitis EST 數(shù)據(jù)庫中EST序列片段結(jié)合RT-PCR方法克隆了與氮代謝相關(guān)的NR、亞硝酸還原酶(NiR)、GS、GDH和天冬酰胺合成酶(AS)的基因，發(fā)現(xiàn)以0.3%和0.5%濃度的尿素對(duì)5個(gè)基因的表達(dá)水平影響明顯，5個(gè)基因在幼葉的表達(dá)水平顯著高于老葉，并且在不同時(shí)間段的表達(dá)水平差異不一致。王劍等[12]以‘夏黑’葡萄(Vitislabruscana‘Black Summer’)為試材，對(duì)5個(gè)氮代謝基因(VvGHD、VvNiR、VvNR、VvGS和VvAS)在葉面噴施不同氮肥處理后的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，認(rèn)為噴施氮肥后5個(gè)氮代謝基因的表達(dá)水平均上調(diào)，噴施氮肥不同，同一基因在響應(yīng)強(qiáng)度和時(shí)間上存在差異。王添民[13]以日光溫室中盆栽扦插幼苗為材料，研究了不同硝銨比條件下葡萄葉片中氮代謝酶活性及其基因表達(dá)水平，研究表明，較高的硝態(tài)氮比例促進(jìn)整個(gè)生育期VvNR的表達(dá)水平上調(diào)，反之，則有利于VvGS上調(diào)表達(dá)。前人的研究主要集中在對(duì)成齡樹葉面噴施尿素水溶液和盆栽幼苗根施氮肥以探討外源氮素對(duì)葉片氮代謝分子調(diào)控的影響，對(duì)成齡樹土壤施入氮肥對(duì)葉片氮代謝酶相關(guān)基因表達(dá)水平的影響還未見報(bào)道。且在葡萄生產(chǎn)中氮肥主要以土壤施入為主，準(zhǔn)確掌握施肥時(shí)期對(duì)葡萄生產(chǎn)尤為重要，傳統(tǒng)的技術(shù)理論已不能滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的要求。因此，本研究以生長勢(shì)較好，產(chǎn)量穩(wěn)定的10年生‘蛇龍珠’釀酒葡萄自根苗為試材，通過連續(xù)3年按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行田間管理后，在第3年取樣測定相關(guān)指標(biāo)，以期在生理及分子水平上闡明不同時(shí)期施入尿素對(duì)不同生育期葡萄葉片氮代謝的影響，為葡萄園合理施肥，提高N素利用率提供一定的理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

田間試驗(yàn)于2013～2015年在甘肅武威市黃羊鎮(zhèn)莫高葡萄酒原料基地進(jìn)行，連續(xù)3年在試驗(yàn)區(qū)按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行水肥管理，于2015年田間取樣測定各項(xiàng)指標(biāo)，指標(biāo)測定于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院果樹生理與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室完成。原料基地土壤為中性到弱堿性的礫質(zhì)沙壤土，土層深厚，透氣好，土壤有機(jī)質(zhì)為0.62%，pH值為7.8，速效氮為0.9 g·kg-1，速效磷為22 mg·kg-1，速效鉀為123 mg·kg-1。年降雨量191 mm，蒸發(fā)量2 130.8 mm，年平均日照時(shí)數(shù)為2 724.8 h，≥10 ℃的有效積溫在2 800 ℃～3 200 ℃，年平均溫度6.9 ℃，氣候涼爽，無霜期160 d，生產(chǎn)期光照充足，晝夜溫差大。

試驗(yàn)所用材料為10年生‘蛇龍珠’葡萄，其在該地區(qū)的主要物候期為萌芽期4月25日、盛花期6月5日、轉(zhuǎn)色期8月17日、采收期10月1日?；仄咸巡捎脝位h架，株行距為1 m×3 m。采用滴管灌溉，尿素隨水施入，磷鉀肥在葡萄植株兩側(cè)開溝施入，磷肥在出土灌水前施入，鉀肥在果實(shí)轉(zhuǎn)色期施入。滴灌帶為大禹節(jié)水有限公司生產(chǎn)，壁厚0.2 mm，滴孔間距30 cm，單孔出水量3 L·h-1，灌水量及時(shí)間參照“武威莫高釀造葡萄滴灌配水定額表”，在試驗(yàn)中根據(jù)實(shí)際情況有所調(diào)整。實(shí)驗(yàn)中反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量染料SYBR Premix Ex Taq kit 購自大連TaKaRa 公司。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

試驗(yàn)共設(shè)置6個(gè)氮肥施用時(shí)期，即在萌芽期(S1，4月25日)、新梢旺長期(S2，5月15日)、開花期(S3，6月5日)、果實(shí)第一次膨大期(S4，6月25日)、副梢生長旺期(S5，7月20日)和果實(shí)第二次膨大期(S6，8月25日)分別施入尿素300 kg·hm-2，其他時(shí)期均不再施入氮肥，以整個(gè)生育期不施氮肥為對(duì)照(CK)。試驗(yàn)每小區(qū)為一個(gè)處理，每處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，各處理隨機(jī)分布，共設(shè)置21個(gè)小區(qū)。為提高試驗(yàn)的可信度，小區(qū)面積設(shè)置為240 m2，每個(gè)小區(qū)定植40株葡萄，取樣時(shí)在同一棵葡萄樹上不重復(fù)取樣。之后，分別于5月31日(花前5 d，DBF5)、6月30日(花后25 d，DAF25)、7月31日(花后55 d，DAF55)和8月31日(花后85 d，DAF85)采取葉片測定相關(guān)指標(biāo)。

1.2　測定指標(biāo)及方法

按照設(shè)計(jì)時(shí)間選取新梢中部功能葉片，每重復(fù)摘取4片葉，每處理3個(gè)重復(fù)，共計(jì)12片葉，采樣后置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室測定總氮、蛋白及酶活性。選取新梢頂部新葉，置于液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，保存在超低溫冰箱用于RNA提取。

1.2.1相關(guān)生理指標(biāo)葉片總氮含量采用凱氏定氮法測定[14]，蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法(Boradford法)[15]進(jìn)行測定。NR活性采用磺胺比色法[16]測定；GS活性使用[16]FeCl3絡(luò)合顯色比色法測定；GDH活性采用南京建成生物研究所GDH測定試劑盒測定，以每克組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位；GOGAT活性參照趙鵬[17]的方法進(jìn)行測定。

1.2.2總RNA提取及VvNR、VvGS、VvGDH、VvGOGAT表達(dá)分析RNA 提取采用改良CTAB 法[18]。以提取的總RNA 為模板，用 Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)試劑盒進(jìn)行cDNA 第1 鏈的合成，將0.5 ～ 2 μg 純化的總RNA 反轉(zhuǎn)錄成第1 鏈cDNA，作為基因擴(kuò)增及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，qRT-PCR)的模板。其中，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(LightCycler?96 Real-Time PCR System，Roche，瑞士)，使用SYBR GreenⅠ(TaKaRa)試劑盒。內(nèi)參基因?yàn)閁BI(GenBank accession number：XM_002266714)，擴(kuò)增體系含2 μL cDNA，0.8 μL上、下游引物[13,18](表1)，10 μL 反應(yīng)MIX，6.4 μL ddH2O，總體積20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃下變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃下退火30 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線及熔解曲線?；虻南鄬?duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT計(jì)算。

表1　qRT-PCR引物

1.3　數(shù)據(jù)分析

用Origin8.5 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和作圖，用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用最小顯著差異法(LSD)檢測不同數(shù)據(jù)組間的差異顯著性，顯著性水平設(shè)定為α = 0.05，線性相關(guān)性分析采用Pearson分析法。

2　結(jié)果與分析

2.1　施氮時(shí)期對(duì)葡萄葉片可溶性蛋白及總氮含量的影響

各時(shí)期施氮處理(S1～S6)葡萄葉片可溶性蛋白含量在各取樣時(shí)期均顯著高于同期對(duì)照(圖1，A)。其中，在DBF5時(shí)，S1和S2處理分別顯著高于對(duì)照21.2%和13.0%，S1又顯著高于S2處理；在DAF25時(shí)，S1～S4處理顯著高于對(duì)照12.3%～33.4%，表現(xiàn)為S1 >S2 >S4 >S3，但S3、S4處理間無顯著差異；在DAF55時(shí)，S1～S5處理間無顯著差異，它們顯著高于對(duì)照25.5%～26.3%；在DAF85時(shí)，葉片可溶性蛋白含量在S5和S6處理下顯著高于其他處理，并在S4、S3、S2和S1處理下依次降低，而S4和S3間無顯著差異，各處理顯著高于對(duì)29.7%～37.8%。同時(shí)，各時(shí)期施氮處理葉片總氮含量表現(xiàn)出與可溶性蛋白含量相似的變化趨勢(shì)，均顯著高于同期對(duì)照，并總體上隨生育期呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，且在花后25d時(shí)最高(圖1，B)。其中，在DBF5時(shí)，S1和S2葉片氮含量分別顯著高于對(duì)照27.0%和12.8%；在DAF25時(shí)，各處理顯著高于對(duì)照19.9%～38.6%，S1和S2顯著高于S3和S4處理；在DAF55時(shí)，S3葉片氮含量(9.8 mg·kg-1)顯著高于其他處理，S2、S1和S4處理次之，S5顯著較低；在DAF85時(shí)，葉片總氮含量在S3、S4、S5和S6處理下顯著高于S1和S2處理，而前四者間及后兩者間均無顯著差異，各處理顯著高于對(duì)照28.4%～39.9%。以上結(jié)果說明：施入氮素后顯著促進(jìn)了葉片中可溶性蛋白和全氮含量的增加，花前施入氮素有利于葡萄生育前期葉片可溶性蛋白及總氮含量的積累，花后施氮延緩了葡萄生育后期可溶性蛋白和總氮的降低。

2.2　施氮時(shí)期對(duì)葡萄葉片氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

首先，葡萄葉片硝酸還原酶(NR)活性隨著葉片發(fā)育逐漸增大，且各施氮處理均顯著高于同期對(duì)照(圖2，A)。其中，在DBF5時(shí)，S1和S2分別顯著高于對(duì)照6.7%和7.2%；在DAF25時(shí)，S1處理NR活性(5.4 mg·g-1·h-1)顯著高于其他處理，其他處理表現(xiàn)為S3>S2>S4，且各處理差異顯著；在DAF55時(shí)，S3和S4處理NR活性顯著較高，S1和S2處理居中，S5處理顯著較低；在DAF85時(shí)，所有處理NR活性均比DAF55時(shí)大幅度提高，顯著高于對(duì)照37.9%～61.1%，S3處理NR活性(15.6 mg·g-1·h-1)顯著高于其他處理，其余處理從高到低依次為S4、S5、S1、S2和S6，且各處理間均存在顯著性差異。

圖中數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，同期不同字母表示不同處理間在0.05水平存在顯著性的差異(P<0.05)。S1.萌芽期施氮；S2.新梢旺長期施氮；S3.開花期施氮；S4.果實(shí)第一次膨大期施氮；S5.副梢生長旺期施氮；S6.果實(shí)第二次膨大期施氮；CK.不施氮肥。DBF5.花前5 d；DAF25.花后25 d；DAF55.花后55 d; DAF85.花后85 d。下同圖1　各施氮時(shí)期處理葡萄葉片可溶性蛋白及總氮含量的變化Data are presented as the means±standard error. The different letters in each sampling time indicate significant differences in different treatments at 0.05 level (P<0.05).S1. Supplied nitrogen in budding. S2. Supplied nitrogen in the new shoot growing stage. S3. Supplied nitrogen in the flowering stage. S4. Supplied nitrogen in the first enlargement of the fruit. S5. Supplied nitrogen in the sublateral shoot growth period. S6. Supplied nitrogen in the second enlargement of the fruit; CK.No nitrogen fertilizer.DBF5. Before flowering 5 days. DAF25. After flowering 25 days. DAF55. After flowering 55 days. DAF85. After flowering 85 days. The same as belowFig.1　The soluble protein and total nitrogen contents in leaves of Vitis vinifera with different nitrogen application periods

其次，葉片谷氨酰胺合成酶(GS)活性也基本上隨葉片發(fā)育逐漸增大，各施氮時(shí)期處理均顯著高于同期對(duì)照(圖2，B)。其中，在DBF5時(shí)，S1和S2處理葉片GS活性分別顯著高于對(duì)照8.9%和28.2%；在DAF25時(shí)，各處理GS活性比DBF5時(shí)均大幅度增加，且以S2最高，它們顯著高于同期對(duì)照35.0%～40.6%；在DAF55時(shí)，各處理GS活性比DBF25時(shí)有所降低，其中的S5處理又顯著低于同期其余處理；在DAF85時(shí)，各處理GS活性比DAF55大幅升高，其中的S3處理(0.73 μmol·mg-1·h-1)顯著高于其他處理，S4處理次之，再次為S2、S5和S6處理，各處理比對(duì)照顯著提高7.4%～28.8%。

再次，葉片谷氨酸合成酶(GOGAT)活性在不同施氮時(shí)期處理下也均顯著高于同期對(duì)照(圖2，C)。其中，S1和S2處理GOGAT活性隨生育期波動(dòng)變化，并在DAF25時(shí)達(dá)到最高值，隨后在DAF55時(shí)大幅降低58.6%和66.7%，保持在較低水平；S3和S4處理GOGAT活性在DAF55和DAF85時(shí)均高于其他處理，并在DAF85時(shí)達(dá)到最高值； S5處理GOGAT活性在DAF55時(shí)與S1和S2處理相近，在DAF85時(shí)與S4處理接近；S6處理在DAF85時(shí)低于其他處理，但與S1和S2處理無顯著差異。

此外，葉片谷氨酸脫氫酶(GDH)活性在不同時(shí)期施氮處理下均不同程度地高于同期對(duì)照，并在DAF25時(shí)升至最高水平，而在DBF5和DAF85時(shí)均較低(圖2，D)。其中，在DBF5時(shí)，S1處理葉片GDH活性顯著高于對(duì)照22.6%，S2與對(duì)照相近；在DAF25時(shí)，S1和S2處理GDH活性(184.5和204.8 U·g-1)分別比DBF5提高了62.2%和71.4%，但仍低于S3和S4處理(225.0和227.3 U·g-1)，各處理比對(duì)照顯著增加44.8%～55.1%；在DAF55時(shí)，各施氮處理間GDH活性均無顯著差異；在DAF85時(shí)，S3、S4和S5處理GDH活性均高于其他處理，其次為S1處理，最低為S2、S6處理和CK。

圖2　各施氮時(shí)期處理葡萄葉片氮代謝酶活性的變化Fig.2　The activities of nitrogen metabolism enzymes in leaves of V. vinifera with different nitrogen application periods

以上結(jié)果說明施氮可以顯著促進(jìn)葉釀酒葡萄片中NR、GS、GDH和GOGAT活性的增加，S3和S4處理下葉片中4個(gè)酶活性均保持較高的水平，尤其在葡萄生育后期，S3和S4處理葉片NR、GS、GDH和GOGAT活性相比其他處理顯著升高，有利于葉片中氮素的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移。

2.3　施氮時(shí)期對(duì)葡萄葉片氮代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響

首先，各時(shí)期施氮處理葡萄硝酸還原酶基因(VvNR)表達(dá)量在各取樣時(shí)期均比對(duì)照上調(diào)(圖3，A)。其中，S1和S2處理VvNR表達(dá)水平在DBF5時(shí)一致，兩者在DAF25、DAF55和DAF85時(shí)表達(dá)水平均顯著低于其他施肥處理；S3和S4處理VvNR表達(dá)在DAF25時(shí)顯著上調(diào)，分別為對(duì)照的3.4和3.2倍；S3、S4和S5處理表達(dá)水平在DAF55時(shí)分別為對(duì)照的3.2倍、3.0倍和3.0倍；S5和S6處理表達(dá)水平在DAF85時(shí)無顯著差異，均對(duì)照的2.8倍，此時(shí)S2處理表達(dá)水平最低，為對(duì)照的1.4 倍。

其次，葡萄葉片谷氨酰胺合成酶基因(VvGS)表達(dá)水平在各施氮處理下均不同程度地高于同期對(duì)照(圖3，B)。其中，S1和S2處理VvGS表達(dá)量在DBF5時(shí)差異顯著，分別為對(duì)照的3.2倍和2.8倍；在DAF25時(shí)，S1、S2和S3 處理VvGS表達(dá)量均上調(diào)，其中以S3表達(dá)水平最高，為對(duì)照的1.7倍，此時(shí)S4處理的VvGS表達(dá)水平與對(duì)照無顯著差異；在DAF55時(shí)，S3、S4和S5 處理VvGS表達(dá)水平差異顯著，其中也以S3處理表達(dá)水平最高，為對(duì)照的4.7倍，此時(shí)S2處理表達(dá)水平為對(duì)照的1.5倍，而S1處理表達(dá)水平與對(duì)照無顯著差異。在DAF85時(shí)，S1和S2處理VvGS表達(dá)水平與對(duì)照無差異，S3和S4處理顯著上調(diào)表達(dá)，分別為對(duì)照的4.5倍和5.5倍。

再次，葡萄葉片谷氨酸合成酶基因(VvGOGAT)表達(dá)水平在各施氮處理下也得到不同程度促進(jìn)(圖3，C)。其中，在DBF5時(shí)，S1和S2處理VvGOGAT表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照，而兩者間無顯著差異；在DAF25時(shí)，S2處理的VvGOGAT表達(dá)水平顯著高于其他處理，為對(duì)照的3.9倍，S1和S3處理分別為對(duì)照的1.2和2.0倍，S4處理與對(duì)照無顯著差異；在DAF55時(shí)，S1、S2、S3和S4處理葉片VvGOGAT表達(dá)量分別為對(duì)照的2.5倍、1.8倍、3.3倍和2.0倍，S5處理與對(duì)照無顯著差異；在DAF85時(shí)，S3 處理葉片的VvGOGAT表達(dá)水平最高(對(duì)照的3.7倍)，其次為S4和S5處理(對(duì)照的3.0倍)，S1和S2處理VvGOGAT表達(dá)水平無差異，為對(duì)照的1.9倍，S6處理與對(duì)照無顯著差異。

圖3　各施氮時(shí)期處理葡萄葉片氮代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)水平Fig.3　The gene expression of key enzymes involved in nitrogen metabolism in leaves of V. vinifera with different nitrogen application periods

另外，施氮肥后葡萄葉片谷氨酸脫氫酶基因(VvGDH)表達(dá)水平在各個(gè)時(shí)期均顯著上調(diào)(圖3，D)。其中，在DBF5時(shí)，S1和S2處理葉片VvGDH表達(dá)水平差異顯著，它們分別為對(duì)照的1.9和1.3倍；在DAF25時(shí)，葉片VvGDH的表達(dá)水平由高到低依次為S3、S4、S2和S1處理，分別為對(duì)照的4.4倍、4.0倍、2.1倍和1.5倍；在DAF55時(shí)，不同處理葉片VvGDH表達(dá)量差異顯著，并以S4處理表達(dá)水平最高(對(duì)照的4.4倍)，S1、S2、S3和S5 處理則分別為對(duì)照的1.2倍、1.3倍、2.3倍和2.2倍；在DAF85時(shí)，不同處理葉片VvGDH表達(dá)水平差異顯著，其中的S4處理表達(dá)水平最高(對(duì)照的3.6倍)，其次為S3處理(對(duì)照的3.4倍)，S2處理表達(dá)水平最低，僅為對(duì)照的1.1倍。

以上結(jié)果說明不同生育期施入氮素均促進(jìn)了VvNR、VvGS、VvGDH和VvGOGAT的表達(dá)，尤其是花期以后施入氮素葉片中VvNR表達(dá)水平維持在較高水平，其中S3和S4處理顯著促進(jìn)了不同時(shí)期葉片的VvGS和VvGDH表達(dá)水平，S3處理對(duì)生育后期葉片VvGOGAT表達(dá)水平促進(jìn)效果顯著。

3　討　論

氮素被稱為“生命元素”，是果樹生長發(fā)育過程所必需礦質(zhì)營養(yǎng)元素中的核心元素，氮素的營養(yǎng)調(diào)控是果樹獲得最佳果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)的必需手段。研究認(rèn)為氮素對(duì)果樹的干物質(zhì)積累量的影響最大，施用氮肥能使樹體的氮素含量顯著增加，各器官干物質(zhì)含量均有增加，從而促進(jìn)植株的快速生長[19]。氮素對(duì)作物的生殖生長影響重大，徐海英[20]認(rèn)為葡萄是需氮量較高的樹種，在所有必需營養(yǎng)元素中，氮素是形成葡萄產(chǎn)量的首要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，不同時(shí)期施入尿素均增加了葉片中可溶性蛋白和總氮含量，同時(shí)，氮代謝酶(NR、GS、GDH和GOGAT)活性顯著升高，在DAF85時(shí)，隨施肥時(shí)期的延后，葉片中可溶性蛋白含量隨之增加，S5和S6處理可溶性蛋白含量增加最為明顯，但二者之間無顯著差異。在甘蔗中研究發(fā)現(xiàn)，施氮時(shí)期延后甘蔗中蛋白質(zhì)的含量隨之增加[21]，與本研究基本一致。S1處理葉片中可溶性蛋白含量在DBF5和DAF25時(shí)均顯著高于其他處理，S1處理總氮含量在DAF25前最高，在DAF25時(shí)與S2處理總氮含量無差異，并顯著高于其他處理。這兩個(gè)時(shí)期葉片中氮素含量較高可能與該時(shí)期植株氮素主要來源于葡萄多年生器官貯藏的氮素有關(guān)。同時(shí)，NR是植物吸收利用氮素的第一個(gè)關(guān)鍵酶[22]，而兩個(gè)時(shí)期NR活性較低，也可說明這兩個(gè)時(shí)期葡萄葉片氮素只有少量來源于土壤。有研究表明，葡萄果實(shí)膨大期至果實(shí)成熟期為氮素的最大需求期和最大效率期，在生產(chǎn)上氮肥施用時(shí)期應(yīng)適當(dāng)后移[23]。對(duì)冬小麥研究發(fā)現(xiàn)，施氮時(shí)期的后移可提高開花后功能葉片的NR活性[24]，玉米花后施氮使灌漿期葉片GS、GOGAT和GDH活性較高，同時(shí)能夠延長酶活性保持較高活性的時(shí)期[25]。本研究中S3、S4和S5處理葉片中NR、GS、GOGAT和GDH活性在DAF85時(shí)保持較高的水平，并且以S3處理葉片中酶活性最高，其中NR活性在該時(shí)期不僅顯著高于同期其余處理，而且遠(yuǎn)高于各處理其余生育時(shí)期的NR活性。同時(shí)，花后施氮肥葡萄葉片中總氮含量在DAF85時(shí)增加顯著，因此，S3、S4和S5施氮處理可能通過改變氮素調(diào)控酶的活性從而延長了氮素的吸收和轉(zhuǎn)化過程。

施肥是葡萄生產(chǎn)中重要的農(nóng)事操作，葡萄施肥時(shí)間的選擇往往都是根據(jù)作物的生長情況或物候期，是一種經(jīng)驗(yàn)性的操作，難以做到指導(dǎo)當(dāng)年精確施肥的水平。另外，由于不同年份環(huán)境與氣候等外界因素的差異，當(dāng)年的調(diào)查信息用于來年的田間管理也是不夠理想與科學(xué)的[12]。本研究對(duì)葡萄新葉4個(gè)氮代謝關(guān)鍵基因在不同處理下的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)各處理VvNR表達(dá)水平在不同時(shí)期均高與相應(yīng)對(duì)照，S3處理VvNR表達(dá)水平在DAF25時(shí)為對(duì)照的3.4倍，在DAF85仍為對(duì)照的2.7倍；S3和S4處理VvGS表達(dá)水平分別在DAF55和DAF85時(shí)達(dá)到最高；S3處理VvGOGAT和S4處理VvGDH表達(dá)水平在DAF55和DAF85均顯著高于其他處理，S3處理VvGDH表達(dá)水平在DAF55和DAF85僅次于S4處理。葡萄在成花期葉面噴施0.2%尿素后，葉片中VvNR、VvGS和VvGDH的相對(duì)表達(dá)水平均會(huì)上調(diào)，但不同基因的響應(yīng)時(shí)間不同[12]。施氮可增加花生各器官中可溶性蛋白質(zhì)和游離氨基酸的含量,同時(shí)提高NR、GS和GDH的活性[26]。本研究中，施氮后葉片中總氮、可溶性蛋白含量、氮素代謝酶和對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)水平同步增加，S3和S4兩個(gè)時(shí)期施氮顯著促進(jìn)了4個(gè)氮代謝基因表達(dá)水平升高。施入氮素后，氮素可能誘導(dǎo)了葉片中氮代謝相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)，從而調(diào)控對(duì)應(yīng)酶的活性，增加了葉片中總氮及蛋白的含量。因此，通過檢測葉片4個(gè)氮素代謝基因的表達(dá)水平可以間接反映樹體氮素營養(yǎng)水平是可行的。S3和S4兩個(gè)時(shí)期VvNR、VvGS、VvGDH和VvGOGAT表達(dá)水平相比其他處理上調(diào)顯著，更有利于葉片氮素的積累和轉(zhuǎn)化，從而為進(jìn)一步促進(jìn)葉片的碳同化，增強(qiáng)源(葉)庫(果)間同化產(chǎn)物的轉(zhuǎn)移，進(jìn)而改善果實(shí)品質(zhì)提供了可能。后期將主要以此為切入點(diǎn)，分析氮素施用時(shí)期如何影響源庫間的關(guān)系。

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