喻曉路　林奇泗　傅　慧

1)徐州醫(yī)科大學(xué)江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221004　2)徐州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 徐州 221004　3)淄博市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，山東 淄博 255200

星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte，AS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)目最多的一種細(xì)胞，作為膠質(zhì)細(xì)胞的主要類別，幾乎囊括了膠質(zhì)細(xì)胞的所有功能[1-2]。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)被公認(rèn)為是AS的標(biāo)志性蛋白，在感染、創(chuàng)傷、神經(jīng)退行性疾病等病理?xiàng)l件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活，因此，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活對(duì)防治中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有重要意義[3-4]。腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(brain derived neurotropic factor，BDNF)是一種重要的神經(jīng)因子，在生理環(huán)境下具有促進(jìn)突觸的形成、維持神經(jīng)系統(tǒng)的功能[5-8]。伏隔核(nucleus accumbens，NAc)是中腦-邊緣多巴胺系統(tǒng)環(huán)路的重要核團(tuán)，NAc具有行為調(diào)控、鎮(zhèn)痛作用，參與精神分裂癥的產(chǎn)生、藥物成癮、學(xué)習(xí)記憶和調(diào)節(jié)心血管活動(dòng)及運(yùn)動(dòng)活動(dòng)等[9-10]。腦組織的缺糖缺氧是腦缺血患者的主要癥狀之一，其中腦組織中的星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)大量增生，是一種缺血后的全腦保護(hù)性防御機(jī)制[11-17]。我們對(duì)比了腦片培養(yǎng)技術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，認(rèn)為腦片培養(yǎng)技術(shù)與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相比更多地保留了細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)，能夠更好地模擬生理狀態(tài)，且操作更簡(jiǎn)便，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備的要求也不高[18-23]。2017-12—2018-02在徐州醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，18只小鼠隨機(jī)分為3組，對(duì)小鼠NAc腦區(qū)的腦片進(jìn)行缺糖缺氧處理和復(fù)灌，并與加入BDNF的處理組進(jìn)行比較，對(duì)GFAP蛋白的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，明確BDNF在缺糖缺氧條件下小鼠NAc腦區(qū)的作用，以期為腦缺血溶栓治療提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1主要材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)昆明小鼠18只，體質(zhì)量25～30 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)。

1.1.2儀器和試劑：①材料：BDNF(2837)購(gòu)自TOCRIS公司，RIPA裂解液(KGP702-100)、蘇木素-伊紅(H-E)染液(KGA224)購(gòu)自凱基生物公司，低糖DMEM培養(yǎng)基(ABB210359)和EBSS培養(yǎng)基(AB10134597)均購(gòu)自HyClone公司，青鏈霉素混合液(VC2003)購(gòu)自VICMED公司，GFAP(12389)一抗購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，GAPDH(10494)一抗購(gòu)自proteintech公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(A0208)和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0009)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，ECL發(fā)光試劑盒(AC36131)購(gòu)自bioworld 公司，Transwell 24孔板細(xì)胞培養(yǎng)小室(3413)購(gòu)自Corning公司，PVDF膜(IPVH00010)購(gòu)自Immobilon公司，自動(dòng)震動(dòng)切片機(jī)購(gòu)自萊卡公司，化學(xué)發(fā)光儀購(gòu)自BIO-RAD公司，其余自配液體試劑均購(gòu)自sigma公司。②自配溶液：高滲糖溶液Sucrose 254 mmol/L，D-Glucose 10 mmol/L，NaH2PO41.25 mmol/L，NaHCO324 mmol/L，MgSO47·H2O 2 mmol/L，KCl 3 mmol/L，CaCl22·H2O 2 mmol/L，用去離子水溶解。使用前通入95% O2+5% CO230 min。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1腦片制備：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)七氟烷誘導(dǎo)麻醉后，迅速斷頭，然后用剪刀剪開(kāi)兩耳間的皮膚直至兩鼻間，然后翻轉(zhuǎn)皮膚，暴露顱骨。用眼科剪去掉小鼠顱骨，暴露全腦。隨后用眼科鑷伸入腦前端下部的嗅球處，輕輕挑起腦的前端，剪斷腦神經(jīng)，翻轉(zhuǎn)全腦，放入冰冷、預(yù)先通95% O2+5% CO2混合氣 30 min的高滲糖溶液中，放置1～2 min。取出全腦，除去小腦和嗅球，用刀片切取鼠腦前中部，迅速用502膠水將腦組織塊底部粘在自動(dòng)震動(dòng)切片機(jī)的緩沖槽中，用高滲糖溶液浸沒(méi)組織塊，設(shè)置自動(dòng)震動(dòng)切片機(jī)的切片速度、厚度和距離，切取含有NAc腦區(qū)的厚度為300 μm的腦片，可以取3～5片，用小刀切去多余組織，只保留NAc區(qū)域，整個(gè)過(guò)程在8 min內(nèi)完成，高滲糖溶液溫度維持在4 ℃。24孔培養(yǎng)板孔內(nèi)加0.5 mL的腦片培養(yǎng)液，即低糖DMEM培養(yǎng)基，其中包括1%青鏈霉素混合液，將取好的腦片移入Transwell的小室中，盡量完全吸棄高滲糖溶液，將小室放入培養(yǎng)板中，使培養(yǎng)基的液面剛好達(dá)到腦片的水平，但不漫過(guò)腦片，將培養(yǎng)皿置于37 ℃培養(yǎng)箱中的自制密閉容器中，自制密閉容器有輸入和輸出氣體的導(dǎo)管。腦片培養(yǎng)基的組成：低糖DMEM+1%的青鏈霉素混合液。腦片的培養(yǎng)條件：溫度37 ℃，持續(xù)穩(wěn)定通入95% O2+5% CO2混合氣體，微生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。要保證腦片的上表面充分暴露于氣體環(huán)境中。本實(shí)驗(yàn)所采用的腦片培養(yǎng)方法，目前此方法在本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成熟，如圖1中神經(jīng)元形態(tài)清晰。

1.2.2充N2法制備腦片缺氧缺糖模型：將缺氧缺糖組的腦片更換為EBSS培養(yǎng)基，并移進(jìn)充入5% CO2+95% N2混合氣體的密閉容器中，在37 ℃培養(yǎng)箱中以0.5 L/min的流量充入混合氣，于15 min后換成低糖培養(yǎng)基并復(fù)氧，通入95% O2+5% CO2混合氣體，在37 ℃培養(yǎng)箱中復(fù)灌培養(yǎng)1 h。

1.2.3分組：18只正常昆明小鼠隨機(jī)分為3組，分別為正常組、缺糖缺氧復(fù)灌組(OGD/R)和缺糖缺氧復(fù)灌給藥組(OGD/R+BDNF)各6只。見(jiàn)圖2。正常組：選取正常昆明小鼠6只，取NAc腦區(qū)，采用低糖DMEM培養(yǎng)基并通入95% O2+5% CO2混合氣體進(jìn)行培養(yǎng)。缺糖缺氧復(fù)灌組(OGD/R)：選取正常昆明小鼠6只，取NAc腦區(qū)，采用EBSS培養(yǎng)基并通入5% CO2+95% N2混合氣體培養(yǎng)15 min，并進(jìn)行復(fù)灌，即將帶有腦片的小室置入帶DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并持續(xù)通入95% O2+5% CO2混合氣體1 h。缺糖缺氧復(fù)灌給藥組(OGD/R+BDNF)：選取正常昆明小鼠6只，取NAc腦區(qū)，在EBSS培養(yǎng)基中加入BDNF(BDNF用量為50 ng/μL)并通入5% CO2+95% N2混合氣體培養(yǎng)15 min，并進(jìn)行復(fù)灌，即將帶有腦片的小室置入帶DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并持續(xù)通入95% O2+5% CO2混合氣體1 h。

圖1　腦片培養(yǎng)NAc腦區(qū)HE染色(20×)

圖2　小鼠腦片OGD分組

1.2.4對(duì)檢測(cè)樣品的制備和免疫印跡分析：在模型制作完成后，將腦片移入潔凈的EP管中，加入蛋白裂解液，用電動(dòng)勻漿器將組織打碎，充分裂解組織，4 ℃ 10 000 r/min離心30 min，棄去沉淀，將上清液移入新EP管中，并做好標(biāo)記。用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，測(cè)定蛋白濃度，將樣品配平，按照每孔20 ng的蛋白量進(jìn)行上樣跑電泳，采用半干轉(zhuǎn)的方式將膠中的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉1 h，移入GFAP(1∶1 000)一抗和GAPDH(1∶5 000)一抗中4 ℃過(guò)夜，室溫復(fù)溫30 min，washing buffer清洗3次，每次5 min，轉(zhuǎn)入HPR標(biāo)記的兔二抗中孵育40 min，washing buffer 清洗3次，每次15 min。用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行曝光記錄，ImageJ軟件進(jìn)行定量分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析(one-way ANOVE)進(jìn)行組間比較，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

正常組GFAP蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.544±0.053，缺糖缺氧復(fù)灌組GFAP蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.439±0.325，缺糖缺氧復(fù)灌給藥組GFAP蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.739±0.121。與正常組相比，缺糖缺氧復(fù)灌組GFAP蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與缺糖缺氧復(fù)灌組相比，缺糖缺氧復(fù)灌給藥組GFAP的蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與正常組相比，缺糖缺氧復(fù)灌給藥組GFAP的蛋白相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

注：與正常組比較，**P<0.01；與OGD/R組比較，#P<0.05圖3　GFAP表達(dá)水平比較

3　討論

腦部缺糖缺氧是腦缺血的主要癥狀，可導(dǎo)致殘疾或死亡。眾多研究表明，腦組織的缺糖缺氧會(huì)誘發(fā)一系列的病理變化，甚至短暫性的缺糖缺氧也會(huì)對(duì)腦組織造成一定的損傷[8]。腦組織主要由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量是神經(jīng)元的10～50倍，其中大部分為星形膠質(zhì)細(xì)胞[1-3]。有報(bào)道稱BDNF具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)的作用，可以幫助神經(jīng)損傷后傳導(dǎo)功能的恢復(fù)。在與行為、疼痛、精神分裂癥、藥物成癮、學(xué)習(xí)記憶和心血管活動(dòng)及運(yùn)動(dòng)活動(dòng)等功能密切相關(guān)的NAc腦區(qū)，缺糖缺氧對(duì)腦組織的損傷表現(xiàn)在星形膠質(zhì)細(xì)胞的大量增生上，造成此腦區(qū)的損傷會(huì)影響多個(gè)生理功能。在缺糖缺氧的條件下加入BDNF，能有效減緩GFAP蛋白表達(dá)量的升高。采用建立NAc腦區(qū)腦片缺糖缺氧模型，很好地模仿了短暫性腦缺血的癥狀，同時(shí)加入BDNF的實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了BDNF在短暫性缺糖缺氧對(duì)NAc腦區(qū)GFAP蛋白的作用，說(shuō)明BDNF可以有效降低GFAP蛋白的表達(dá)量，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，減少炎性因子的釋放，從而減少神經(jīng)元的損傷[24]。

現(xiàn)有報(bào)道顯示，BDNF作為一種重要的腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子，對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)元起到很好的保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)作用，其中也包括NAc腦區(qū)，將BDNF注入老年大鼠伏隔核可以改善認(rèn)知和結(jié)構(gòu)突觸可塑性[25-26]。關(guān)于GFAP蛋白在NAc的研究，目前只有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)疼痛和抑郁癥方面[27-28]。有文獻(xiàn)報(bào)道白藜蘆醇對(duì)于缺糖缺氧海馬腦區(qū)有保護(hù)作用，與本實(shí)驗(yàn)有相似之處，卻未對(duì)GFAP蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)[29]。此實(shí)驗(yàn)對(duì)于由腦缺血所造成的缺糖缺氧癥狀而引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞增多，從而造成神經(jīng)元的損傷，驗(yàn)證了BDNF對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的抑制作用，以上內(nèi)容未報(bào)道過(guò)，我們的研究正好填補(bǔ)了這一空白。本實(shí)驗(yàn)給BDNF的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，若對(duì)BDNF的作用機(jī)制和作用效果進(jìn)行更進(jìn)一步的研究，將會(huì)改善由于腦缺血造成的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療方法，應(yīng)用前景非常廣闊。

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