陳新諾，肖　敏,3，阮文強，覃思楠，岳　華,2，湯　承,2，張　斌，2*

(1. 西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041；2. 國家民族事務委員會青藏高原動物疫病防控創(chuàng)新團隊，成都 610041；3. 四川省龍日種畜場，紅原 624400)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)屬單股正鏈RNA病毒，與豬瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)和邊界病病毒(border disease virus, BDV)同屬黃病毒科(Flaviviridae)、瘟病毒屬(Pestivirus)[1-2]。BVDV作為其中重要的病毒之一，在國內外廣泛存在，且宿主廣泛，包括牛、羊、山羊、豬、牦牛、鹿和駱駝等[3-4]。 BVDV進入宿主機體后可造成持續(xù)性感染與免疫抑制，持續(xù)感染動物的血清抗體為陰性，但卻終身帶毒并排毒，因此對養(yǎng)牛業(yè)及其他動物養(yǎng)殖業(yè)均造成了巨大的危害[5-6]。BVDV最重要特征是其遺傳的多樣性[7-8]，基于細胞病變效應(cytopathic effect, CPE)，可將BVDV分為兩組生物型，致細胞病變型(cytopathic biotype, cp)和非致細胞病變型(noncytopathic biotype，ncp)。在BVDV基因組中，E2基因是瘟病毒的重要保護性抗原編碼的基因，在瘟病毒結構蛋白基因中變異較大，代表著毒株的遺傳特性，而5′-UTR和Npro基因均是瘟病毒最保守的基因，因此5′-UTR、Npro和E2常用于瘟病毒及BVDV的遺傳多樣性分析。根據(jù)5′-UTR將BVDV分為兩個不同的遺傳物種，即BVDV-1型和BVDV-2型[9-10]。BVDV-1型可進一步分為1a～1u亞型，BVDV-2型可進一步分為2a～2d亞型[10-13]。近年來，四川、西藏等地區(qū)的流行病學調查顯示，BVDV流行范圍廣泛[14-15]，新型亞型的鑒定明顯增加，BVDV基因組的遺傳多樣性發(fā)生了顯著變化[10,16]。然而，牦牛BVDV毒株的分離鑒定及針對牦牛BVDV系統(tǒng)的遺傳進化研究尚屬空白。因此在本研究中，我們系統(tǒng)調查了2016年川藏部分地區(qū)腹瀉牦牛糞便BVDV的發(fā)病率和主要亞型，并分離培養(yǎng)出牦牛兩株BVDV-1a和1d亞型毒株。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

1.1.1樣本及細胞系從四川和西藏地區(qū)共收集30至60日齡的腹瀉牦牛的糞便樣本，共計149份。取材地點情況：西藏自治區(qū)，N27°38′31.34″, E89°02′27.94″，海拔4 284 m；四川省，N31°32′31.03″，E101°40′07.82″，海拔 3 605 m。本研究所用的細胞MDBK(Madin-Darby bovine kidney)由本實驗室保存，BVDV標準毒株 OregonC24V 購自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2主要試劑與儀器QuickTaqHS DyeMix購自TOYOBO東洋紡生物科技有限公司；MarkerⅡ、PrimeScriptTMRT試劑盒均購自大連寶生物公司；Tirzol試劑盒(RNAiso Plus)購于上海英駿生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco公司，異硫氰酸熒光素(FITC)標記的兔抗羊IgG購自美國Abbkine公司，含DAPI的Fluoroshield固定劑購自美國Abbkine公司。BVDV多克隆抗體購自美國VMRD公司。高速離心機5804購自Eppendor公司;普通PCR儀、核酸蛋白電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)VersaDoc2000為Bio-Rad公司產品。OLMPS IX71型熒光顯微鏡購自TOKYO公司。

1.1.3引物參照文獻[10，17]中引物序列，合成BVDV的特異性引物BVDV-P1～BVDV-P6用于擴增5′-UTR、Npro來進行分子流行病學調查及分子分型。根據(jù)GenBank上已發(fā)表的BVDVE2基因序列，應用Primer Premier 6軟件設計特異性引物BVDV-P7和BVDV-P8(BVDV-P7：AAYGTGCCACRAHACWGC；BVDV-P8：TRCCCATCATSACYAYTTCYC)對E2基因進行擴增和序列分析。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2　方法

1.2.1總RNA提取和反轉錄將糞便樣品按1∶5加入滅菌生理鹽水研磨，經反復凍融后，取上清液加入青霉素/鏈霉素(0.1 mg·mL-1)混勻，以3 000 r·min-1離心20 min，取上清液。參照上海英駿生物科技有限公司Trizol試劑盒(RNAisoPlus)說明書，提取牦牛BVDV總RNA。取處理后的樣本懸液500 μL加入 700 μL的Trizol，室溫靜置10 min；加入200 μL氯仿，強烈振蕩15 s室溫靜止5 min；4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min，取上清液；加入等體積的異丙醇充分顛倒混勻，室溫靜置10 min；4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min，棄上清液，加入1 mL 75%(經DEPC處理過的滅菌水配制)乙醇；4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，用 15 μL經DEPC處理過的無菌水溶解沉淀，-70 ℃保存?zhèn)溆?。利用PrimeScriptTMRT試劑盒將RNA反轉錄成cDNA并置于-20 ℃待用。

1.2.2BVDV的RT-PCR擴增與檢測以反轉錄后的cDNA為模板，進行PCR擴增反應。反應體系如下：QuickTaqHS DyeMix 5 μL，上下游引物均為10 pmol·L-1各0.5 μL，cDNA模板1 μL，加ddH2O 3 μL；PCR反應條件為94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存，取擴增產物經瓊脂糖凝膠核酸電泳和凝膠成像掃描儀進行檢測與分析。擴增片段膠回收，連接pMD19-T載體后，轉化到E.coliDH5α感受態(tài)細胞中，篩選重組質粒，送由上海生工生物有限公司測序。

1.2.3進化關系分析應用DNAStar、CLUSTAL W 軟件將測序樣本的序列與GenBank中已公布的BVDV參考序列進行多序列比較， 使用MEGA 6.06軟件以Neighbor-Joining法(Bootstrap 值為1 000)構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4細胞及病毒的分離培養(yǎng)細胞瓶中用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)MDBK細胞12 h，使細胞生長致單層細胞后，將處理后的樣本感染細胞24 h，同時接種BVDV OregonC24V標準毒作為陽性對照組和不接種病毒的MDBK做陰性空白對照組，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)并觀察細胞狀態(tài)。待細胞病變后空泡面積達50%以上后收毒。細胞培養(yǎng)物于-80 ℃反復凍融3次后10 000 r·min-1離心10 min，上清移至離心管中放入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5間接免疫熒光檢測待細胞培養(yǎng)板上的細胞長成單層后，棄去維持液并用PBS(pH為7.4)洗滌3次，每次3 min。每孔加入80%冰丙酮 1 mL，在4 ℃條件下固定10 min左右，棄掉丙酮后用PBS洗滌3次。每孔加入1∶300稀釋的一抗(BVDV多克隆抗體)1 mL，37 ℃孵育45 min。一抗孵育結束后用PBS洗滌3次，再加1∶1 000稀釋的FITC標記的兔抗羊IgG二抗，每孔1 mL，37 ℃孵育45 min。二抗孵育結束后再用PBS洗滌5次以上，滴加含有DAPI的封片液，室溫孵育10 min使用吸水紙吸取殘留液體后直接在熒光顯微鏡下觀察細胞核周邊有無綠色熒光出現(xiàn)，判定標準如下：(-)無綠色熒光；(+)綠色熒光較弱，但清楚可見；(++)綠色熒光明亮；(+++～++++)綠色熒光閃亮。待檢樣本特異性綠色熒光強度達“++”以上，而各種對照顯示為(±)或(-)，即可判定為陽性。

1.2.6病毒毒價測定將“1.2.4”中細胞培養(yǎng)物用細胞營養(yǎng)液做連續(xù)10倍梯度稀釋，從10-3稀釋到10-13，依次吸取病毒液100 μL 接種到長滿單層MDBK細胞的96孔細胞培養(yǎng)板上，每一個稀釋度接種8個培養(yǎng)孔，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐天觀察并記錄病變情況，同時設立未接毒的正常細胞作對照，根據(jù)Reed-Muench法計算病毒的TCID50，計算方法：距離比例=(高于50%的百分數(shù)-50%)/(高于50%的百分數(shù)-低于50%的百分數(shù))；TCID50的對數(shù)=高于50% 的最高稀釋對數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù)

2　結　果

2.1　2016年川藏地區(qū)牦牛BVDV分子流行病學調查

根據(jù)引物BVDV-P1、BVDV-P2進行RT-PCR檢測，結果顯示149份出現(xiàn)腹瀉癥狀牦牛的糞便樣品中，有29份擴增出了特異性條帶，部分樣品的PCR擴增結果如圖1。川藏地區(qū)腹瀉牦牛糞便中BVDV陽性檢出率為19.46%(95%CI=13.4%～26.7%)，西藏地區(qū)牦牛BVDV陽性檢出率為27.14%(95%CI=17.2%～39.1%)，四川地區(qū)牦牛BVDV陽性檢出率為12.66%(95%CI=6.2%～22.0%)。

M．DNA markerⅡ；P1～P3.陽性對照；N1～N3.陰性對照；1～4. 5′-UTR RT-PCR產物(230 bp)；5～8.Npro RT-PCR產物(440 bp)；9～12. E2 RT-PCR產物(1 223 bp)M．DNA markerⅡ；P1-P3．Positive control；N1-N3．Negative control；1-4. The RT-PCR product (230 bp) of 5′-UTR; 5-8. The RT-PCR product (440 bp) of Npro; 9-12. The RT-PCR product (1 223 bp) of E2圖1　BVDV RT-PCR部分擴增結果Fig.1　Partial amplified results of BVDV by RT-PCR

2.2　遺傳進化分析

為了解2016年川藏地區(qū)牦牛BVDV主要的流行亞型及遺傳進化情況，我們從西藏和四川兩個地區(qū)隨機選擇“2.1”中RT-PCR呈陽性的樣本10份(5份來自西藏地區(qū)腹瀉牦牛，5份來自四川地區(qū)腹瀉牦牛),根據(jù)5′-UTR、Npro和E2基因的特異性引物(BVDV-P1～BVDV-P8)進行RT-PCR擴增、測序。分別在230、440和1 223 bp處可見特異性擴增條帶, 部分樣品的PCR擴增結果如圖1。將產物進行回收克隆測序后結果顯示10個樣本均為BVDV-1型。將測序所得序列與GenBank中公布的11株BVDV 進行同源性比較，結果顯示，根據(jù)5′-UTR基因測序所得10株測序株之間的核苷酸相似性為86.6%～100%，與其他BVDV毒株5′-UTR基因的核苷酸相似性為69.1%～90.9%。Npro基因測序株之間的核苷酸和氨基酸序列相似性分別為72.8%～100%和74.7%～99.3%，與其他BVDV毒株Npro基因序列的核苷酸和氨基酸相似性分別介于74.9%～87.5%和82.3%～89.0%之間。E2基因測序結果顯示10株測序株之間的核苷酸和氨基酸相似性分別為68.2%～99.9%和66.8%～99.5%，與其他BVDV毒株E2基因序列的核苷酸和氨基酸相似性分別介于68.2%～97.8%和67.4%～96.0%。系統(tǒng)發(fā)育樹表明，西藏腹瀉牦牛糞便樣本(BB8、FB4、FB6、JB8和EB3)和四川腹瀉牦牛糞便樣本L8與BVDV-1d菌株10JJ-SKR更為密切相關，Z1、Z3、Z6和Z10分離株均與BVDV-1a菌株GS5在同一分支上(圖2)，研究結果表明10株BVDV陽性樣本分別屬于BVDV-1a(n=4)和BVDV-1d(n=6)。

2.3　病毒的分離及鑒定

將RT-PCR呈陽性的糞便樣本處理后接種于事先培養(yǎng)好的MDBK細胞中，盲傳7代后，BVDV-1a SWU-Z10和BVDV-1d SWU-L8兩個樣本在70 h左右出現(xiàn)與BVDV OregonC24V陽性對照相同的典型的細胞病變，病變初期細胞出現(xiàn)圓縮的現(xiàn)象，逐漸出現(xiàn)拉網狀并開始脫落，正常MDBK細胞陰性對照沒有發(fā)生病變(圖3)，初步確定分離到了兩株CP型BVDV。按Reed-Muench法對兩株分離株的效價進行計算，結果顯示，該兩株分離株SWU-Z10和SWU-L8第9代細胞毒的TCID50·100 μL-1分別為10-8. 11和10-5.81。通過間接免疫熒光試驗檢測，顯微鏡下觀察可見，兩株分離株SWU-Z10和SWU-L8以及陽性對照 OregonC24V毒株的細胞膜內均出現(xiàn)了明亮的特異性綠色熒光，而陰性對照則未出現(xiàn)綠色熒光，說明成功分離到SWU-Z10和SWU-L8兩株BVDV CP型毒株。

3　討　論

牦牛多生存于海拔3 000 m及以上的青藏高原地區(qū)，是典型的高原物種之一，具有“高原之舟”之稱。牦牛廣泛分布于中國青藏高原地區(qū)(西藏、青海、四川、云南等地區(qū))及其相鄰的高原地區(qū)。我國牦牛資源較為豐富、牦牛數(shù)量較多，據(jù)統(tǒng)計我國有1 300多萬頭牦牛，占世界牦?？倲?shù)的90%以上[18]。在青藏高原地區(qū)，牦牛作為最重要的高原生存物種之一，具有產肉、產奶、皮革和絨毛生產等多方面的經濟價值[19]。

標記黑點的是測序株The sequencing strain is marked as a black spot圖2　基于5′-UTR(a)、Npro(b)和E2序列(c)的10株測序株的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2　Phylogenetic analysis of 10 sequencing strains based on 5′-UTR (a), Npro (b) and E2 sequence (c)

BVDV是導致牦牛腹瀉的重要病原，牦牛感染BVDV后可導致牛奶產量下降，牛奶品質差，繁殖力降低，生長遲緩和繼發(fā)感染其他疾病。據(jù)調查該病在我國大部分地區(qū)廣泛存在，牛群中有相當一部分是BVDV的攜帶者[20]。根據(jù)近年來的BVDV流行病學調查顯示，四川、西藏等地區(qū)均有不同程度的BVDV感染。筆者實驗室通過PCR檢測從2013年青藏高原地區(qū)的20份腹瀉牦牛糞便樣品中病毒流行情況，BVDV陽性率為15%，檢測2015年青藏地區(qū)腹瀉牦牛222份糞便樣品，BVDV陽性率為20%[14]。本研究中川藏地區(qū)牦牛糞便BVDV的陽性檢出率為19.46%，與之前的報道[10,14,17，21]大致相同，四川地區(qū)陽性率有所降低。分析可能是因為樣本采集地區(qū)差異以及我們研究所用的樣本為腹瀉牦牛的糞便，而之前文獻報道的樣本多為牦牛血清。

A. 接毒細胞細胞膜出現(xiàn)綠色熒光；B. DAPI染細胞核；C. A和B的結合圖；D.陰性對照(MDBK細胞)。OregonC24V、SWU-Z10和SWU-L8在MDBK細胞中引起典型的致細胞病變作用A．Green fluorescence occur in membrane of infected MDBK cells；B. Nucleus dyed by DAPI；C. Merged Fig. of A and B；D. Negative control (MDBK cells). OregonC24V, SWU-Z10 and SWU-L8 cause typical cytopathic effects in MDBK cells圖3　通過IFA檢測相關毒株感染MDBK細胞中的BVDV抗原Fig.3　Detection of BVDV antigen in MDBK cell infected with BVDV strains by IFA

在BVDV基因組中，E2糖蛋白編碼區(qū)通常被認為是最不保守的區(qū)域之一，因此，該蛋白也被認為是BVDV分型的依據(jù)之一，其抗原的變異導致BVDV可很好的適應環(huán)境的變化，這種特性也導致了BVDV疫苗的免疫失效，且也是畜群感染BVDV后出現(xiàn)持續(xù)性感染的重要原因[22-23]。同時，作為BVDV的一個重要特征，亞型往往是群體特有的，不同的地區(qū)可能流行不同的亞型[24]。因此，在防控時必須認識到BVDV分離株的變異性。據(jù)國內外研究報道，BVDV-1a、1b和2a在美國為主要的流行亞型[25]，歐洲許多國家主要流行BVDV-1a、1b、1d、1e和1f[11, 26]。日本和韓國主要流行BVDV-1b[27-28]，澳大利亞則主要流行BVDV-1c[29]。中國的主要亞型是BVDV-1b和1m[30]。BVDV-1b、1q和1m是中國青藏高原西藏和青海地區(qū)牦牛的主要BVDV亞型[17]。本研究中，我們根據(jù)E2基因設計特異性引物對檢測呈陽性的樣本進行E2基因擴增、測序并構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，并結合5′-UTR和Npro所構建的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示5株西藏腹瀉牦牛樣本與10JJ-SKR毒株相似性較高，均為BVDV-1d亞型，但是5株樣本單獨聚為一個分支，5株四川腹瀉牦牛樣本中1株屬BVDV-1d亞型，4株與GS5毒株相似性較高，屬BVDV-1a亞型，而GS5毒株與標準毒株OregonC24V同源。結果也進一步說明不同的地區(qū)所流行的主要亞型是不同的，因此應該因地制宜地制定防控方案。

本研究從四川腹瀉牦牛糞便樣本中分離兩株病毒，經病毒分離培養(yǎng)、RT-PCR與間接免疫熒光方法鑒定，確定兩株病毒均為CP型BVDV，并命名為SWU-Z10和SWU-L8，根據(jù)Reed-Muench法測定兩株病毒TCID50·100 μL-1分別為10-8.11和10-5.81，可見，兩株病毒的毒力相差很大，經分析原因可能有以下幾點：(1)樣本采集地區(qū)差異。川藏地區(qū)由于地理、文化和經濟等多種因素導致牦牛的養(yǎng)殖多屬于小型養(yǎng)殖或散養(yǎng)，而BVDV的傳播具有地域差異[30]，因此可能導致兩株分離株存在明顯的毒力差異。(2)通過同源性比對及系統(tǒng)進化樹顯示SWU-Z10屬于BVDV-1a亞型，與BVDV-1a標準毒株OregonC24V和NADL的同源關系較近，位于同一分支上，而BVDV OregonC24V和NADL毒株均為毒力較強的CP型BVDV標準毒株。(3)SWU-Z10樣本采集于四川地區(qū)腹瀉十分嚴重的牦牛，該牦牛臨床癥狀明顯，有排血便的現(xiàn)象。因此，我們也將在下一步的研究中著重研究兩株病毒的致病性及致病力等相關問題。

4　結　論

對四川和西藏部分高原地區(qū)采集的149份臨床腹瀉牦牛糞便開展牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)分子流行病學調查，BVDV陽性檢出率為19.46%。隨機取10份陽性樣本，5′-UTR、Npro和E2基因分析結果表明10份樣本為BVDV-1型，包括BVDV-1a(n=4)和1d(n=6)亞型。成功分離鑒定出2株致細胞病變型BVDV，分別屬于牦牛BVDV-1a和1d亞型，命名為SWU-Z10和SWU-L8。川藏部分高原地區(qū)牦牛存在BVDV感染，BVDV-1a和1d為牦牛感染的主要亞型。

參考文獻(References)：

[1]LANYON S R, HILL F I, REICHEL M P, et al. Bovine viral diarrhoea: pathogenesis and diagnosis[J].VetJ, 2014, 199(2): 201-209.

[2]韓玉霞, 孟露萍, 孫志華, 等. 不同生物型BVDV感染對MDBK細胞類泛素基因轉錄水平的影響[J]. 動物醫(yī)學進展, 2015, 36(12): 11-17.

HAN Y X, MENG L P, SUN Z H, et al. Effects of different biological-types of Bovine Viral Diarrhea Virus infection on SUMO gene transcription levels in MDBK cells[J].ProgressinVeterinaryMedicine, 2015, 36(12): 11-17. (in Chinese)

[3]BACHOFEN C, VOGT H R, STALDER H, et al. Persistent infections after natural transmission of bovine viral diarrhoea virus from cattle to goats and among goats[J].VetRes, 2013, 44: 32.

[4]TAO J, LIAO J H, WANG Y, et al. Bovine viral diarrhea virus (BVDV) infections in pigs[J].VetMicrobiol, 2013, 165(3-4): 185-189.

[5]HELAL M A, OKAMATSU H, TAJIMA M. Bovine viral diarrhea virus infection in a dairy herd with high prevalence of persistently infected calves[J].JpnJVetRes, 2012, 60(2-3): 111-117.

[6]PINIOR B, FIRTH C L, RICHTER V, et al. A systematic review of financial and economic assessments of bovine viral diarrhea virus (BVDV) prevention and mitigation activities worldwide[J].PrevVetMed, 2017, 137: 77-92.

[8]COUVREUR B, LETELLIER C, COLLARD A, et al. Genetic and antigenic variability in bovine viral diarrhea virus (BVDV) isolates from Belgium[J].VirusRes, 2002, 85: 17-28.

[10]DENG M L, JI S K, FEI W T, et al. Prevalence study and genetic typing of bovine viral diarrhea virus (BVDV) in four bovine species in China[J].PLoSOne, 2015, 10(4): e0134777.

[11]GIAMMARIOLI M, CEGLIE L, ROSSI E, et al. Increased genetic diversity of BVDV-1: recent findings and implications thereof[J].VirusGenes, 2015, 50(1): 147-151.

[12]ZEMKE J. Characterization of recombinant BVDV-2 vaccine prototypes based on packaged replicons and replication competent deletion mutants[D]. LMU München: Tier?rztliche Fakult?t, 2010.

[13]張倩, 陶潔, 張東, 等. 國內新型基因2型牛病毒性腹瀉病毒研究進展[J]. 中國動物傳染病學報, 2017, 25(1): 80-86.

ZHANG Q, TAO J, ZHANG D, et al. Research progress of genotype 2 bovine viral diarrhea virusin China[J].ChineseJournalofVeterinaryParasitology, 2017, 25(1): 80-86. (in Chinese)

[14]陳新諾, 張朝輝, 徐林, 等. 青藏高原牦牛感染BVDV和BEV的分子流行病學調查[J]. 動物醫(yī)學進展, 2016, 37(9): 35-38.

CHEN X N, ZHANG C H, XU L, et al. Investigation on molecular epidemiology of BVDV and BEV infections in yaks of Qinghai-Tibetan Plateau[J].ProgressinVeterinaryMedicine, 2016, 37(9): 35-38. (in Chinese)

[15]何美琳, 張煥容, 王永, 等. 川西北牦牛3種病毒性腹瀉病血清學調查[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2014, 41(3): 248-251.

HE M L, ZHANG H R, WANG Y, et al. Serological survey on three viral diarrhea diseases of yaks in Northwest Sichuan Province[J].ChineseJournalofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine, 2014, 41(3): 248-251. (in Chinese)

[16]KUTA A, POLAK M P, LARSKA M, et al. Predominance of bovine viral diarrhea virus 1b and 1d subtypes during eight years of survey in Poland[J].VetMicrobiol, 2013, 166(3-4): 639-644.

[17]GONG X W, LIU L H, ZHENG F Y, et al. Molecular investigation of bovine viral diarrhea virus infection in yaks (Bosgruniens) from Qinghai, China[J].VirolJ, 2014, 11: 29.

[18]拜彬強, 郝力壯, 柴沙駝, 等. 牦牛肉品質特性研究進展[J]. 食品科學, 2014, 35(17): 290-296.

BAI B Q, HAO L Z, CHAI S T, et al. Progress in understanding meat quality characteristics of yak[J].FoodScience, 2014, 35(17): 290-296. (in Chinese)

[19]李齊發(fā), 趙興波, 劉紅林, 等. 牦牛分類地位研究概述[J]. 動物分類學報, 2006, 31(3): 520-524.

LI Q F, ZHAO X B, LIU H L, et al. A review of the research on taxonomic status in yak (Poephagus)[J].ActaZootaxonomicaSinica, 2006, 31(3): 520-524. (in Chinese)

[20]范晴, 謝芝勛, 謝志勤, 等. 牛病毒性腹瀉病毒抗原捕獲ELISA方法的建立[J]. 動物醫(yī)學進展, 2015, 36(2): 4-2.

FAN Q, XIE Z X, XIE Z Q, et al. Development of antigen capture ELISA of detection bovine viral diarrhea virus[J].ProgressinVeterinaryMedicine, 2015, 36(2): 4-2. (in Chinese)

[21]GAO J F, LIU M Y, MENG X R, et al. Seroprevalence of bovine viral diarrhea infection in Yaks (Bosgrunniens) on the Qinghai-Tibetan Plateau of China[J].TropAnimHealthProd, 2013, 45(3): 791-793.

[22]KALAYCIOGLU A T. Bovine viral diarrhoea virus (BVDV) diversity and vaccination. A review[J].VetQ, 2007, 29(2): 60-67.

[23]PECORA A, MALACARI D A, PEREZ AGUIRREBURUALDE M S, et al. Development of an APC-targeted multivalent E2-based vaccine against bovine viral diarrhea virus types 1 and 2[J].Vaccine, 2015, 33(39): 5163-5171.

[24]OSTACHUK A. Bovine viral diarrhea virus structural protein E2 as a complement regulatory protein[J].ArchVirol, 2016, 161(7): 1769-1782.

[25]RIDPATH J F, LOVELL G, NEILL J D, et al. Change in predominance ofBovineviraldiarrheavirussubgenotypes among samples submitted to a diagnostic laboratory over a 20-year time span[J].JVetDiagnInvest, 2011, 23(2): 185-193.

[27]ABE Y, TAMURA T, TORII S, et al. Genetic and antigenic characterization of bovine viral diarrhea viruses isolated from cattle in Hokkaido, Japan[J].JVetMedSci, 2016, 78(1): 61-70.

[28]OEM J K, CHUNG J Y, ROH S, et al. Characterization and phylogenetic analysis ofBovineviraldiarrheavirusin brain tissues from nonambulatory (downer) cattle in Korea[J].JVetDiagnInvest, 2010, 22(4): 518-523.

[29]LANYON S R, REICHEL M P. Bovine viral diarrhoea virus (‘pestivirus’) in Australia: to control or not to control[J].AustVetJ, 2014, 92(8): 277-282.

[30]王煒. 牛主要呼吸道病毒病血清學調查、牛病毒性腹瀉病毒分離株鑒定及疫苗研究[D]. 北京: 中國農業(yè)科學院, 2014.

WANG W. Serosurvey of major bovine respiratory viruses and identification of BVDV isolates and vaccine development[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2014. (in Chinese)