吳習(xí)習(xí)，羅海霞，郝秀靜，馬春驥,3，李　敏*

(1.西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(寧夏大學(xué))，銀川 750021；2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，銀川 750021；3.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與制藥技術(shù)系，銀川 750021)

支原體(Mycoplasma)是介于細(xì)菌與病毒之間、無(wú)細(xì)胞壁的一類(lèi)原核微生物。這類(lèi)微生物最早是1898年由法國(guó)E. Nocard及E. R. Roux從患肺疫的牛中分離出來(lái)，當(dāng)時(shí)命名為類(lèi)胸膜肺炎微生物(pleuropneumonia like organism，PPLO)，1956年正式命名為支原體[1]。支原體種類(lèi)眾多，可引起動(dòng)物和人類(lèi)多種疾病，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的發(fā)展，威脅人類(lèi)健康?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，支原體作為一種病原菌，感染宿主細(xì)胞后通過(guò)黏附于宿主細(xì)胞表面，干擾宿主細(xì)胞膜功能導(dǎo)致細(xì)胞損傷。細(xì)胞凋亡、自噬能抵抗病原微生物入侵，是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的基本生理過(guò)程，可以緩解病原菌感染早期對(duì)宿主細(xì)胞的損傷。隨著病原菌與細(xì)胞互作研究的深入，發(fā)現(xiàn)支原體感染宿主細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞的損傷影響不容忽視。因此，本文從支原體感染宿主細(xì)胞引發(fā)的細(xì)胞凋亡、自噬、癌變方面進(jìn)行概述。

1　支原體感染與細(xì)胞凋亡

支原體通過(guò)黏附宿主細(xì)胞表面侵染細(xì)胞[2]，引起細(xì)胞凋亡，有利于菌體的入侵和毒素的釋放，為支原體的定植和致病提供有利條件。支原體的莢膜、脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(lipid-associated membrane proteins，LAMPs)等表面結(jié)構(gòu)和支原體感染宿主細(xì)胞后產(chǎn)生的代謝物在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

1.1　支原體莢膜介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

莢膜是多種支原體細(xì)胞膜外的一層黏性結(jié)構(gòu)，其化學(xué)成分主要是多糖。支原體的莢膜結(jié)構(gòu)與其致病性密切相關(guān)，是致病支原體重要的毒力因子[3]。

劉紫玲等[4]在研究人肺炎支原體(Mycoplasmapenumoniae，MP)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)莢膜多糖可以通過(guò)與樹(shù)突細(xì)胞(dendritic cell，DC)表面的樹(shù)突細(xì)胞特異性細(xì)胞間黏附分子-3-結(jié)合非整合素分子(dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin，DC-SIGN)結(jié)合促進(jìn)抑制性細(xì)胞因子IL-10的分泌，進(jìn)而啟動(dòng)相應(yīng)的凋亡信號(hào)。M. Niang等[5]利用釕紅染色技術(shù)，在綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae，MO)菌株中首先觀察到莢膜的存在，并證實(shí)了莢膜在介導(dǎo)菌體與宿主黏附過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Z. J. Jiang等[6]在研究MO與綿羊氣管上皮細(xì)胞間的互作時(shí)首次分離和純化了MO莢膜多糖，深入研究發(fā)現(xiàn)莢膜多糖感染宿主細(xì)胞可以破壞線粒體膜的完整性，引起細(xì)胞線粒體膜電位的降低。同時(shí)莢膜通過(guò)上調(diào)FAS/FASL信號(hào)蛋白和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(caspase-8)誘導(dǎo)外源性細(xì)胞凋亡，并通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)JNK和p38信號(hào)促進(jìn)活性氧(reactive oxygen species，ROS)依賴(lài)的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡(圖1)。莢膜作為支原體重要的毒力因子，還可以通過(guò)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞免疫損傷，對(duì)宿主細(xì)胞造成一定的毒害作用。Z. J. Jiang等[7]研究還發(fā)現(xiàn)，MO莢膜感染綿羊氣管上皮細(xì)胞后激活TLRs/MYD88信號(hào)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的免疫損傷。

圖1　CPS誘導(dǎo)綿羊支氣管上皮細(xì)胞凋亡的caspase-3依賴(lài)性途徑示意[6]Fig.1　Scheme showed a possible mechanism of CPS-induced caspase-dependent apoptosis in ALI cultures of sheep bronchial epithelial[6]

1.2　支原體LAMPs介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

LAMPs是支原體細(xì)胞膜內(nèi)在蛋白和外周膜蛋白的統(tǒng)稱(chēng)[8]。LAMPs是支原體的一種重要的毒力蛋白，具有很強(qiáng)的抗原性，在很大程度上決定著支原體對(duì)細(xì)胞的毒害作用[9]。

研究發(fā)現(xiàn)豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)LAMPs可誘導(dǎo)豬外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)外源性途徑和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)途徑的細(xì)胞凋亡，LAMPs通過(guò)促炎細(xì)胞因子NO和ROS的釋放，激活p38 MAPK信號(hào)通路，經(jīng)過(guò)Bax/Bcl-2信號(hào)進(jìn)而激活caspase-3；同時(shí)LAMPs介導(dǎo)外源性途徑通過(guò)caspase-8激活caspase-3，隨后激活的caspase-3將PARP切割成兩個(gè)片段以招募ATP，進(jìn)而與相應(yīng)底物作用執(zhí)行凋亡活動(dòng)[10]。汪洋[11]在建立的雞毒支原體(MycoplasmaGalliscepticum，MG)LAMPs與雞胚成纖維細(xì)胞(DF1)相互作用的模型中，確定了LAMPs具有誘導(dǎo)DF1細(xì)胞凋亡的作用，進(jìn)一步研究證實(shí)LAMPs可以激活DF1細(xì)胞中caspase-3的活性，裂解PARP，啟動(dòng)凋亡信號(hào)。此外，LAMPs作為T(mén)LR2的主要識(shí)別受體，可以直接與宿主細(xì)胞膜上的TLR2相互作用，通過(guò)分泌TNFα、IL-1β等凋亡啟動(dòng)因子參與細(xì)胞凋亡[12]，例如在MP感染過(guò)程中[13]，LAMPs可通過(guò)作用于單核細(xì)胞TLR2、TLR6激活NF-κB通路，誘導(dǎo)促炎因子TNFα、IL-1β、IL-6的表達(dá)，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡活動(dòng)；在牛肺炎支原體(Mycoplasmabovis，Mb)[14]中同樣發(fā)現(xiàn)LAMPs通過(guò)TLR2、MYD88途徑激活NF-κB通路過(guò)表達(dá)IL-1β，調(diào)控細(xì)胞凋亡；絲狀支原體(Mycoplasmamycoidessubsp.mycoides，Mmm)的LAMPs[15]亦可通過(guò)TLR2、MyD88、IRAK4途徑激活NF-κB介導(dǎo)IL-1β的高表達(dá)，即通過(guò)誘發(fā)宿主系列炎癥反應(yīng)，進(jìn)而啟動(dòng)相應(yīng)的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)。

1.3　支原體代謝產(chǎn)物介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

支原體感染宿主后的代謝產(chǎn)物也是導(dǎo)致宿主細(xì)胞損傷的重要誘因。當(dāng)支原體突破宿主屏障在呼吸道富集時(shí)，可以產(chǎn)生大量的H2O2和ROS，同時(shí)H2O2的沉積也會(huì)造成紅細(xì)胞裂解、支氣管纖毛運(yùn)動(dòng)被抑制，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS，進(jìn)而抑制抗氧化物酶的產(chǎn)生，造成細(xì)胞損傷[16]。

在MP引發(fā)的特發(fā)性間質(zhì)性肺炎(idiopathic interstitial pneumonias，IIP)中發(fā)現(xiàn)，MP可以導(dǎo)致肺部上皮細(xì)胞的細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyc-C)從線粒體釋放，從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)的Cyc-C易與凋亡蛋白激活因子1(apoptotic protease activating facter-1，Apaf-1)形成凋亡小體，并在ATP作用下激活caspase-3和caspase-9，通過(guò)線粒體途徑導(dǎo)致肺部上皮細(xì)胞凋亡[17]。在MO感染氣管上皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，其可產(chǎn)生大量的ROS并激發(fā)宿主氧化應(yīng)激，從而造成線粒體損傷進(jìn)而釋放Cyc-C[18]，ROS作為MAPK通路重要的激活因子[19]，可通過(guò)氧化磷酸化激活MEK1/2/ERK1/2信號(hào)通路，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞抗凋亡能力下降，同時(shí)線粒體釋放Cyc-C活化caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞發(fā)生凋亡(圖2)。此外，MO感染產(chǎn)生的ROS還可以激活氣管上皮細(xì)胞的p38-MAPK和caspase-3信號(hào)傳導(dǎo)，通過(guò)caspase-3/PRAP信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]，即MO可以通過(guò)激活MAPK信號(hào)通路，同時(shí)伴隨著caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的活化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21-22]。此外，ROS還可以直接激活NF-κB或通過(guò)氧化還原因子(Ref-1)間接激活NF-κB，激活的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核與c-myc等凋亡相關(guān)因子結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23-24]。

圖2　MO感染誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的線粒體途徑示意[18]Fig.2　Schematic diagram of an apoptotic cell death induced by M. ovipneumoniae infection via signalling pathways converging at mitochondria[18]

2　支原體感染與細(xì)胞自噬

細(xì)胞自噬是一種溶酶體依賴(lài)性降解途徑，通過(guò)降解胞內(nèi)衰老損傷的細(xì)胞器維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，是細(xì)胞應(yīng)對(duì)惡劣環(huán)境的一種主動(dòng)反應(yīng)[25]，同時(shí)細(xì)胞自噬在抵抗病原菌感染過(guò)程中也起到一定作用[26]。

2.1　支原體誘導(dǎo)細(xì)胞自噬

在MG感染小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系RAW264.7中，可以通過(guò)TLR2調(diào)控細(xì)胞自噬，此過(guò)程同時(shí)有多個(gè)信號(hào)通路(包括ERK1/2、JNK和p38)被激活，然而干擾TLR2后只有ERK1/2磷酸化的表達(dá)水平顯著降低，當(dāng)ERK1/2信號(hào)通路被抑制劑PD98059抑制時(shí)，自噬相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)顯著下調(diào)，細(xì)胞內(nèi)LC3斑點(diǎn)的數(shù)量顯著減少，即MG通過(guò)TLR2激活ERK信號(hào)通路觸發(fā)巨噬細(xì)胞自噬[27]。T. Shimizu等[28]研究發(fā)現(xiàn)MP感染巨噬細(xì)胞后，可被吞噬進(jìn)入胞內(nèi)，誘導(dǎo)自噬發(fā)生，與此同時(shí)MP也通過(guò)TLR4途徑誘導(dǎo)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，然而自噬抑制劑能下調(diào)該過(guò)程促炎因子的釋放，表明自噬的發(fā)生同時(shí)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，此外，MP的ABC-轉(zhuǎn)運(yùn)體(MPN333)和ATP合成酶F0F1亞基(MPN597)對(duì)于自噬/TLR4介導(dǎo)通路的活化是必不可少的[29]。本課題組成員孫遠(yuǎn)航[30]研究發(fā)現(xiàn)MO感染小鼠肺上皮細(xì)胞(TC-1)可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MO也可誘導(dǎo)RAW264.7發(fā)生自噬，在MO感染前期，TC-1、RAW264.7細(xì)胞通過(guò)自噬水平的增強(qiáng)對(duì)MO有一定的清除作用，隨著支原體感染時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞自噬對(duì)其的清除有所限制，沉默自噬關(guān)鍵基因P62和Atg7后，MO的存活率升高，即自噬參與了MO在胞內(nèi)增殖的過(guò)程。

2.2　支原體逃避細(xì)胞自噬

支原體長(zhǎng)期定植、感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中已經(jīng)形成了逃避自噬，進(jìn)而長(zhǎng)期存活于胞內(nèi)的機(jī)制。支原體感染宿主細(xì)胞后，可以與宿主細(xì)胞膜融合，通過(guò)募集Rab7和LC3-II形成自噬體包裹支原體，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生自噬，并且研究發(fā)現(xiàn)支原體誘導(dǎo)自噬有助于減少胞內(nèi)支原體積累，Rab7是支原體在宿主細(xì)胞內(nèi)積累所必需的，Rab7的上調(diào)可促進(jìn)自噬體的融合，進(jìn)而擾亂內(nèi)吞體和自噬體的動(dòng)力學(xué)，抑制自噬的降解過(guò)程，為胞內(nèi)支原體提供生存環(huán)境，從而促進(jìn)了支原體的細(xì)胞內(nèi)感染與長(zhǎng)期存活[31]，這種通過(guò)上調(diào)Rab7和抑制自噬降解途徑幫助支原體在細(xì)胞內(nèi)積累的過(guò)程，可能是支原體逃避細(xì)胞對(duì)自身清除的作用機(jī)制。在解脲支原體(Ureaplasmaurealyticum，Uu)感染HeLa細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，Uu可以通過(guò)網(wǎng)格蛋白依賴(lài)性?xún)?nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，并被運(yùn)送至早期內(nèi)體，即誘導(dǎo)細(xì)胞自噬反應(yīng)，此外被運(yùn)送至內(nèi)體的Uu還可以通過(guò)內(nèi)體循環(huán)、細(xì)胞外分泌或胞吐作用被運(yùn)輸至胞外，逃避細(xì)胞自噬對(duì)自身的清除，并且純化的Uu脂蛋白具有抗原性，可以誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)，造成宿主免疫損傷[32]，即Uu可以利用宿主細(xì)胞膜囊泡逃避宿主自噬和免疫系統(tǒng)對(duì)自身的損傷，進(jìn)而促進(jìn)其對(duì)宿主細(xì)胞的長(zhǎng)期感染和毒害。

3　支原體感染與細(xì)胞癌變

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，支原體感染與腫瘤的發(fā)生有一定的關(guān)系[33]，如支原體感染宿主細(xì)胞后與細(xì)胞膜成分的互換，促使信號(hào)從細(xì)胞膜到核的轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而改變?cè)S多基因的表達(dá)，為細(xì)胞癌變提供可能。此外，支原體的長(zhǎng)期存在可以通過(guò)炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)各種細(xì)胞因子產(chǎn)生，對(duì)細(xì)胞的增生和分化發(fā)揮作用，進(jìn)而有可能影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，在人類(lèi)的一些實(shí)體瘤中相繼發(fā)現(xiàn)有支原體的存在。R. Y. H. Wang等[34]檢測(cè)414例H1V-1陽(yáng)性感染者血清中抗穿透支原體抗體的水平，發(fā)現(xiàn)高滴度者患Kaposi肉瘤的危險(xiǎn)性是低滴度者的11.7倍，穿透支原體(Mycoplasmapenetrans，Mpe)與Kaposi肉瘤的形成密切相關(guān)。Y. A. Barykova等[35]研究發(fā)現(xiàn)前列腺上皮內(nèi)瘤變(HGPIN)或前列腺癌癥(PCa)患者中Uu含量是良性患者的三倍，并且通過(guò)對(duì)PCa患者的血清樣品分析發(fā)現(xiàn)其攜帶更高水平的Uu抗體[36]。近年來(lái)，結(jié)腸癌、胃癌、肺癌[37-39]組織中均被發(fā)現(xiàn)有豬鼻支原體(Mycoplasmahyorhinis，Mhy)的存在，Mhy的存在和肺癌、結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)相關(guān)。

現(xiàn)有研究證明一些支原體在慢性組織培養(yǎng)侵襲期間具有誘導(dǎo)其核型變化和惡性轉(zhuǎn)化的潛力，S.Tasi等[40]用發(fā)酵支原體(Mycoplasmafermentans，Mf)及Mpe感染極少自發(fā)轉(zhuǎn)化的小鼠胚胎細(xì)胞系C3H10T1/2，在感染6周后，C3H細(xì)胞顯示出形態(tài)學(xué)的改變；11周后細(xì)胞出現(xiàn)惡性改變，此時(shí)用抗生素殺滅支原體，細(xì)胞的惡性特征迅速消失；18周之后，細(xì)胞轉(zhuǎn)化已不可逆，且在軟瓊脂上形成集落，在裸鼠體內(nèi)成瘤。另有研究發(fā)現(xiàn)支原體能夠感染并轉(zhuǎn)化正常肺細(xì)胞，并能夠誘導(dǎo)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)表達(dá)上調(diào)[41]，高表達(dá)的BMP2激活致癌途徑并促進(jìn)小鼠肺部腫瘤生長(zhǎng)[42]。CYP1A1作為細(xì)胞色素酶亞家族成員，是前致癌物質(zhì)代謝活化的主要功能酶，參與癌癥病變及腫瘤發(fā)生過(guò)程，當(dāng)Mhp感染宿主后，CYP1A1基因表達(dá)水平顯著變化，此過(guò)程可能存在潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)CYP1A1和PPAR-γ還參與調(diào)控由Mhp誘導(dǎo)的宿主炎癥反應(yīng)[43]。支原體與宿主細(xì)胞長(zhǎng)期互作的過(guò)程中，對(duì)宿主細(xì)胞的惡性影響不容忽視，目前支原體與細(xì)胞癌變的關(guān)系及分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4　討論及展望

支原體侵染宿主細(xì)胞的首要條件是黏附，支原體細(xì)胞膜的一端向外突起形成“附著細(xì)胞器”或“尖端結(jié)構(gòu)”介導(dǎo)支原體與宿主的黏附作用[44-45]，并在黏附蛋白的幫助下沿著突起的方向滑動(dòng)，使其轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞表面，支原體動(dòng)力學(xué)與細(xì)胞浸潤(rùn)能力相結(jié)合增強(qiáng)了支原體對(duì)宿主細(xì)胞的感染能力[46]。因此，在支原體感染宿主細(xì)胞過(guò)程中，鑒定支原體黏附宿主細(xì)胞的膜組分，以及宿主細(xì)胞識(shí)別支原體的膜受體，了解黏附因子與宿主細(xì)胞互作的分子機(jī)制，同時(shí)深入探究支原體如何逃避或破壞宿主的保護(hù)機(jī)制是今后的主要研究方向。

細(xì)胞凋亡、自噬作為維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的基本生理過(guò)程，在抵抗胞內(nèi)病原菌過(guò)程中發(fā)揮一定作用。支原體作為病原菌，可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生凋亡、自噬，且宿主細(xì)胞可以通過(guò)凋亡、自噬方式，或通過(guò)有效的免疫反應(yīng)產(chǎn)生IgM、IgG、IgA[47]抗體等途徑緩解支原體感染早期對(duì)宿主細(xì)胞的損傷。隨著支原體感染時(shí)間的延長(zhǎng)和支原體對(duì)細(xì)胞微環(huán)境的改變，其釋放的毒素，為支原體的定植和致病提供有利條件，甚至某些支原體可以利用宿主細(xì)胞自噬過(guò)程以躲避宿主的免疫清除，造成宿主細(xì)胞對(duì)支原體的抵抗能力減弱，促使支原體在宿主細(xì)胞內(nèi)存活并增殖，最終導(dǎo)致其從細(xì)胞擴(kuò)散到更深的組織和器官，難以被根除。在支原體長(zhǎng)期感染過(guò)程中，通過(guò)炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)各種細(xì)胞因子產(chǎn)生，對(duì)細(xì)胞的增生和分化發(fā)揮作用，進(jìn)而為細(xì)胞腫瘤的發(fā)生提供可能[33]。目前研究已經(jīng)證實(shí)一些支原體在慢性組織培養(yǎng)侵襲期間具有誘導(dǎo)核型變化和惡性轉(zhuǎn)化的潛力，且通過(guò)臨床檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)的一些實(shí)體瘤中存在支原體，因此支原體致癌的危害不容小覷。本課題組在研究MO誘導(dǎo)TC-1、RAW264.7細(xì)胞自噬的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)隨著支原體感染時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞自噬對(duì)其的清除作用有所限制，關(guān)于MO是否可利用、修飾或干擾自噬過(guò)程，以及是否存在其他自我保護(hù)機(jī)制逃避宿主細(xì)胞的免疫清除，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)自身在宿主細(xì)胞內(nèi)的長(zhǎng)期感染等惡性影響，還需要更深入的研究。最新研究發(fā)現(xiàn)的cell-in-cell作為一種細(xì)胞程序性死亡方式，越來(lái)越多的引起人們的關(guān)注，此途徑也為支原體感染情況下細(xì)胞的宿命研究提供新的方向。

臨床表現(xiàn)的多樣性及診斷工具的靈敏性限制，使得臨床上支原體疾病較難治愈，因此深入研究支原體感染致病機(jī)制，才能為研發(fā)用于支原體感染的預(yù)防、診斷、控制的新型疫苗及診斷試劑，有效控制支原體感染提供保障。

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