袁艷茹

（安陽(yáng)市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，河南 安陽(yáng) 455000）

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是動(dòng)物一切細(xì)胞、組織的重要成分，是生命活動(dòng)的重要承擔(dān)者。機(jī)體所有重要的組成部分都需要有蛋白質(zhì)的參與，而且蛋白質(zhì)分解后可以給畜禽提供能量［1］。蛋白質(zhì)在維持動(dòng)物的免疫功能及表達(dá)免疫活性中發(fā)揮著特殊的生物學(xué)作用［2］。此外，蛋白質(zhì)相關(guān)的血液指標(biāo)（如血紅蛋白、血清總蛋白、血清尿素氮）有所變化時(shí)，可能與畜禽的異食癖有關(guān)［3］。飼料中蛋白質(zhì)的檢測(cè)有很多種，例如，李博等［4］對(duì)飼料蛋白質(zhì)的幾種檢測(cè)方法的原理、特點(diǎn)及應(yīng)用進(jìn)行了綜合闡述，其中實(shí)驗(yàn)室比較常見(jiàn)是近紅外光譜技術(shù)法和凱氏定氮法。近紅外光譜分析技術(shù)具有快速的特點(diǎn)，但存在靈敏度差和建模困難等缺點(diǎn)［5］。粗蛋白是飼料檢測(cè)的一個(gè)重要指標(biāo)，凱氏定氮法是目前最常用的檢測(cè)粗蛋白含量的方法。凱氏定氮法原理是飼料樣品在催化劑（五水硫酸銅和硫酸鉀或硫酸鈉）作用下，用濃硫酸破壞有機(jī)物，使含氮物轉(zhuǎn)化為硫酸銨，然后加入過(guò)量強(qiáng)堿進(jìn)行蒸餾，使氮以氨氣的形式逸出，用硼酸吸收逸出的氨，之后用甲基紅溴甲酚綠為指示劑用強(qiáng)酸滴定硼酸銨，測(cè)出氮含量，將氮含量乘以蛋白轉(zhuǎn)換系數(shù)（6.25），計(jì)算出粗蛋白的含量［6］。而全自動(dòng)蛋白測(cè)定系統(tǒng)則是根據(jù)經(jīng)典凱氏定氮法設(shè)計(jì)的全自動(dòng)消解、全自動(dòng)蒸餾、全自動(dòng)滴定及出結(jié)果的半微量系統(tǒng)，該系統(tǒng)為飼料中粗蛋白檢測(cè)提供了極大的便利，具有安全、準(zhǔn)確、快速、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。全自動(dòng)蛋白測(cè)定系統(tǒng)采用石墨消解儀消解樣品，然后消解液放到全自動(dòng)蛋白測(cè)定儀上固定，設(shè)好參數(shù)，蒸餾、定氮、滴定、出結(jié)果一氣呵成，在保證準(zhǔn)確度的前提下，整個(gè)定氮滴定出結(jié)果在10 min內(nèi)即可完成?，F(xiàn)針對(duì)全自動(dòng)蛋白測(cè)定系統(tǒng)對(duì)粗蛋白的測(cè)定進(jìn)行系統(tǒng)性研究。

1 稱取飼料樣品

樣品稱取量應(yīng)考慮樣品的含氮量，樣品含氮量高，在盡量減少稱量誤差的前提下，應(yīng)稱取較少量的樣品；如果樣品的含氮量低，應(yīng)稱取較多的樣品。全自動(dòng)蛋白測(cè)定系統(tǒng)稱取樣品含氮量15～50 mg最為合適。表1為常見(jiàn)飼料及原料的適宜稱樣量。

稱樣時(shí)可用濾紙的1/4對(duì)折后稱樣，像包藥粉一樣，包裝完好，不能有樣品撒出來(lái)，之后把包好飼料包滑至消化管底部。同時(shí)做空白對(duì)照，即把1/4濾紙折好，直接滑至消化管底部。

2 飼料樣品消化

表1 飼料及原料適宜稱樣量

樣品消解前，每個(gè)消化管中放入一個(gè)消解片，消解片要滑到消解管的底部。消解片是由3.6 g硫酸鉀和0.4 g五水硫酸銅混勻壓制而成的。之后每個(gè)消化管中加入10 mL濃硫酸，之后把消化管連同消化管架一同放到石墨消解儀上，打開(kāi)通風(fēng)櫥和減壓排酸霧水管，蓋上排酸架蓋。消化儀上有20個(gè)孔位放置消化管，如果消化樣品不足20個(gè)，帶樣品的消化管放置可按照排煙管路的走向放置，剩下孔位，可去掉消化管塑料蓋或者放上加入10 mL濃硫酸的消化管，之后可按步驟消化。

儀器消化參數(shù)的設(shè)置需考慮樣品是否起泡，如果樣品起泡，可設(shè)置200℃消化0.5 h，之后400℃消化2.5 h；如果樣品不起泡，直接設(shè)置400℃消化3 h。消解儀操作界面簡(jiǎn)單，界面僅有時(shí)間和溫度參數(shù)，設(shè)置好這兩個(gè)參數(shù)后，直接按確定鍵進(jìn)行消解。儀器提示消化完成后，待消化管中霧基本消失時(shí)，可以關(guān)閉減壓排酸霧水管，取出消化架，等消化液降溫后可進(jìn)行定氮蒸餾。

消解儀是石墨消解儀，石墨消解儀具有消解快速、高效、操作方便等特點(diǎn)，特別適合與凱氏定氮儀配合使用。此外，石墨消解儀爐內(nèi)溫度連續(xù)可調(diào)，溫度恒定，可同時(shí)消解20個(gè)樣品，爐內(nèi)平均溫差小，樣品消解一致性好，熱傳導(dǎo)效率高。石墨經(jīng)過(guò)抗氧化處理，消解儀表面耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿腐蝕，樣品各部受熱均勻，爐體孔間溫差小，可以快速、高效地消解樣品。

3 飼料樣品全自動(dòng)定氮、滴定

3.1 試劑的準(zhǔn)備

在滴定之前要準(zhǔn)備的試劑為標(biāo)定過(guò)0.1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液，400 g/L氫氧化鈉溶液，2%硼酸溶液，0.1%甲基紅乙醇溶液，0.1%溴甲酚綠乙醇溶液，混合指示劑（甲基紅指示劑和溴甲酚綠指示劑以1∶5混合均勻）。其中，混合指示劑和2%硼酸溶液以1∶100混合均勻裝入硼酸桶；400 g/L氫氧化鈉溶液裝入堿桶；蒸餾水加入水桶，標(biāo)定過(guò)滴定酸加入滴定酸桶。

3.2 全自動(dòng)定氮、滴定過(guò)程

先準(zhǔn)備3根空的消解管，打開(kāi)全自動(dòng)定氮儀開(kāi)關(guān)，打開(kāi)冷卻水開(kāi)關(guān)，下面分四步進(jìn)行。第一步，進(jìn)行換算清洗。換算清洗要進(jìn)行三四次，這個(gè)過(guò)程可以排掉滴定酸管路的氣泡，相當(dāng)于潤(rùn)洗滴定酸管路。第二步，把第一個(gè)空的消解管放到定氮儀上固定，之后按儀器上測(cè)試鍵，輸入相應(yīng)滴定酸濃度，硼酸體積15 mL，稀釋水10 mL，堿5 mL，蒸餾5 min，設(shè)置好后按確定鍵，全自動(dòng)定氮滴定開(kāi)始。第一管也被稱為空蒸，以使各個(gè)管路充滿液體，也是對(duì)蒸餾管路進(jìn)行預(yù)熱。接著第二三個(gè)空管按上面參數(shù)進(jìn)行定氮滴定，所用滴定酸體積應(yīng)小于0.05 mL，主要是看換算清洗是否徹底。此外，第二三個(gè)管各自所用滴定酸體積一般小于0.1 mL，這主要體現(xiàn)定氮滴定系統(tǒng)空體積。第三步，準(zhǔn)備2個(gè)稱取0.1 g左右干燥過(guò)的基準(zhǔn)硫酸銨于消化管，樣品質(zhì)量輸入實(shí)際稱取硫酸銨的質(zhì)量，空體積為第二步第二個(gè)管和第三個(gè)管所用滴定酸體積的平均值，堿體積改為10 mL，其他參數(shù)和第二步一樣，按確定鍵開(kāi)始定氮滴定，2個(gè)硫酸銨管都進(jìn)行完后，查看含氮量是否為21.19%±0.2%。如果是，可以做樣品；如果不是，可以檢查儀器的各個(gè)管路，如果儀器管路沒(méi)有問(wèn)題，硫酸銨含氮量比較穩(wěn)定，可以考慮做定標(biāo)系數(shù)來(lái)校準(zhǔn)儀器的系統(tǒng)誤差。第四步，做樣品。樣品質(zhì)量按實(shí)際稱取量填寫，空白樣品質(zhì)量不需填寫，堿參數(shù)改為50 mL，蛋白系數(shù)為6.25，其他參數(shù)同第一步。先做2個(gè)空白樣品，做完后2個(gè)管所用酸的體積的平均值作為樣品的空白體積。然后填入?yún)?shù)，即可做樣品。做完樣品后滴定酸體積、粗蛋白含量、氮含量便可顯示出來(lái)，如果需要打印直接按打印鍵。測(cè)定結(jié)果2個(gè)平行樣之間的精密度用相對(duì)偏差進(jìn)行記錄，偏差要求為CB/T 6432—94的組蛋白偏差要求。

儀器設(shè)置好各個(gè)參數(shù)，按確定鍵儀器開(kāi)始自動(dòng)進(jìn)行所有步驟。試驗(yàn)步驟為加稀釋水、加硼酸、加堿、蒸餾、滴定、計(jì)算、打印和接受杯清洗（主要在于設(shè)置參數(shù)里是否選定該項(xiàng)，選定則有這個(gè)步驟）。在測(cè)試過(guò)程中全自動(dòng)定氮滴定系統(tǒng)實(shí)時(shí)采集儀器多方面狀態(tài)信息：蒸汽發(fā)生器的水位，安全門在位，冷凝水有無(wú)等。如果有異常，儀器會(huì)暫停任務(wù)。全自動(dòng)系統(tǒng)實(shí)時(shí)顯示當(dāng)前操作項(xiàng)目及實(shí)時(shí)量，當(dāng)前功能完成后自動(dòng)轉(zhuǎn)移至下一試驗(yàn)功能。此外，試驗(yàn)過(guò)程中隨時(shí)可以暫停試驗(yàn)。試驗(yàn)過(guò)程中如果某個(gè)參數(shù)為0，試驗(yàn)過(guò)程不開(kāi)啟此項(xiàng)功能。

3.3 定標(biāo)系數(shù)K

儀器測(cè)定樣品時(shí)，由于各系統(tǒng)連接會(huì)有系統(tǒng)誤差，為了測(cè)定結(jié)果的精確，建立偏差校正系數(shù)K。

校準(zhǔn)時(shí)可選用干燥基準(zhǔn)硫酸銨，直接精密稱取0.1 g左右硫酸銨于消解管中，固定在全自動(dòng)定氮儀消化管位置，參數(shù)同3.2中硫酸銨測(cè)定參數(shù)相同，直接讀取結(jié)果中的含氮量。

K值的計(jì)算為K=N/N1。其中，N1為標(biāo)準(zhǔn)樣品中氮的百分含量，一般為硫酸銨理論氮的百分含量乘以其純度；N為儀器測(cè)出的標(biāo)準(zhǔn)樣品中氮的百分含量。

一般準(zhǔn)備硫酸銨固定樣品3份，上機(jī)測(cè)定，得到3個(gè)氮的百分含量，同時(shí)得到3個(gè)K的值，3個(gè)K值平均值就是定標(biāo)系數(shù)K。把定標(biāo)系數(shù)填到儀器設(shè)置下定標(biāo)系數(shù)，再測(cè)幾個(gè)硫酸銨固體樣品，使得含氮量在21.19%±0.2%。

4 結(jié)語(yǔ)

全自動(dòng)蛋白測(cè)定系統(tǒng)具有準(zhǔn)確、快速、安全、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，本文對(duì)全自動(dòng)蛋白測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定飼料中粗蛋白的方法進(jìn)行了探究，希望有助于該系統(tǒng)得到廣泛應(yīng)用。

［1］蛋白質(zhì)飼料對(duì)畜禽的營(yíng)養(yǎng)作用［J］.甘肅畜牧獸醫(yī)，2017（2）：104.

［2］董佳綺，金三俊，汪晶晶，等.蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)畜禽免疫作用的影響［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017（9）：80-82.

［3］李志靜，周玉香.日糧蛋白質(zhì)對(duì)畜禽異食癖以及消化代謝和生理功能的影響［J］.飼料研究，2013（11）：40-43.

［4］李博，楊衛(wèi)軍，張珍珍.飼料中蛋白質(zhì)檢測(cè)方法的研究進(jìn)展［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2017（6）：38-40.

［5］趙雅新，王紅英.近紅外光譜技術(shù)在飼料工業(yè)中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.飼料工業(yè)，2005（21）：37-41.

［6］國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局.飼料中粗蛋白測(cè)定方法：GB/T 6432—94［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1994.