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大腸桿菌(Escherichiacoli)是食品中重要的衛(wèi)生指標(biāo)菌[1]，普遍存在于人和動物的腸道中，是人和動物腸道的共棲菌和條件致病菌[2]。一般不致病，但在某些毒力因子的影響下，對人和動物有致病性，常引起嚴(yán)重的腹瀉和敗血癥[3-4]。其中，五類致瀉性大腸埃希菌(包括腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌ETEC，腸致病性大腸埃希菌EPEC，腸侵襲性大腸埃希菌EIEC，腸出血性大腸埃希菌EHEC和腸集聚性大腸埃希菌EIEC)是引起人類腹瀉的重要病原菌，給發(fā)展中國家造成重大的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)[5]。大腸桿菌易產(chǎn)生耐藥性，由于在養(yǎng)雞過程中大量、不合理地使用抗菌藥物，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥菌株不斷出現(xiàn)，許多敏感藥物變?yōu)槟退?，其耐藥譜不斷增大，并且已經(jīng)證實耐藥菌株是可以通過食品在動物與人類之間進行轉(zhuǎn)移[6]，質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等可移動元件將耐藥基因轉(zhuǎn)移到人類腸道中的其他共棲菌群或者致病菌中[7]，這將會對公共健康構(gòu)成巨大的威脅。

特對我國8個省份零售雞肉中的大腸桿菌進行耐藥性檢測，旨在評估禽肉源大腸桿菌耐藥性和多重耐藥性的流行趨勢，以期為養(yǎng)殖業(yè)抗菌藥物的合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1主要試劑及菌株來源蛋白胨緩沖液(BPW)、伊紅美蘭瓊脂(EMB)、麥康凱瓊脂(MacConkey Agar)、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、MH瓊脂、IMViC試驗試劑，均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；抗生素，購自Sigma公司；Taq酶、Buffer(Mg2+)、dNTP，購自大連寶生物(TaKaRa)公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC25922由本實驗室保存。

1.2樣品采集從2010年3月至11月分別自陜西(西安、寶雞和渭南)、河南(鄭州、新鄉(xiāng)和洛陽)、四川(成都、眉山和邛崍)、北京(海淀區(qū)、朝陽區(qū)和順義區(qū))、上海(浦東區(qū)、浦東新區(qū)和長寧區(qū))、廣東(廣州、深圳和中山)、廣西(南寧、玉林和柳州)和福建(福州、廈門和泉州)的各大超市和農(nóng)貿(mào)市場隨機采集雞肉樣品。其中，每個省選擇3個城市(1個省會城市和兩個非省會城市)進行樣品采集。直轄市選擇3個區(qū)進行樣品采集。在每個城市或區(qū)，從4個大超市(面積大于14 000 m2)、4個小超市(面積小于14 000 m2)和4個農(nóng)貿(mào)市場采集樣品。在大超市或小超市，購買產(chǎn)自家禽公司并冷藏(4 ℃～10 ℃)或(-10 ℃～-20 ℃)冷凍的雞肉。農(nóng)貿(mào)市場是開放的食品市場，包括肉鋪、活禽店和魚店，以及售賣水果的攤位。在活禽店，家禽被屠宰后，在被賣出之前不用被冷藏。每個市場采集4個樣品，這樣每個省或者直轄市共計采樣114個整雞肉樣品。從陜西省、河南省和廣西省采集的雞肉樣品通過冰袋直接運往西北農(nóng)林科技大學(xué)實驗室，在14h內(nèi)進行大腸桿菌分離鑒定。其它省或直轄市采集的雞肉樣品直接在當(dāng)?shù)氐募膊☆A(yù)防控制中心或大學(xué)的實驗室用滅菌400 mL BPW肉湯對整雞酮體進行沖淋，沖淋的BPW肉湯通過冰袋直接運往西北農(nóng)林科技大學(xué)實驗室，在14h內(nèi)進行大腸桿菌分離鑒定。

1.3菌株的分離鑒定參照只帥[7]等人對大腸桿菌的分離純化方法：整雞酮體用400 mL BPW洗滌并充分振蕩，置于37 ℃、120 r/min搖床中復(fù)活；4h后取5 mL上述復(fù)活液到含50mL雙料EC肉湯的錐形瓶中，42 ℃搖床培養(yǎng)24 h。將增菌液劃線于EMB平板，37 ℃培養(yǎng)24 h。選取 EMB 平板上紫黑色帶金屬光澤的單菌落，劃線于LB平板上進行純化。對疑似菌株進行IMViC 試驗，結(jié)果++--者認(rèn)定為大腸桿菌。采用PCR擴增uidA基因?qū)Ψ蛛x菌株進行大腸桿菌確認(rèn)。DNA模板通過煮沸法獲得，所用引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為25 μL：DNA模板2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，MgCI22.5 μL，dNTP 1 μL，TaqDNA聚合酶0.25 μL，引物各0.5 μL(25 pmol)。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 10 min；94 ℃30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。每個陽性樣本中，挑取一個菌落保存，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1PCR 引物序列
Tab.1Sequences of PCR primers

基因Gene引物名稱Primer引物序列(5′?3′)Primersequence(5′?3′)擴增片段/bpProductsize/bpuidAuidA1CGATTCCGTTTC?AGGGTT194uidA2TTTCTGATAGGA?CCGAGCAT

1.4藥敏性測定方法采用NCCLS[8](美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會，National Committee of Clinical Laboratory Standard)推薦的瓊脂擴散法測定760株雞肉源大腸桿菌對15種常用抗菌類藥物的敏感性。具體操作：1)抗生素母液的配制：用無菌水或適當(dāng)?shù)木彌_液將每種抗生素配成質(zhì)量濃度為 5120 μg/mL的貯存液，分裝于無菌EP管置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?)含抗菌藥物瓊脂平板的制備：向已冷卻至50 ℃的無菌MH固體培養(yǎng)基中加入一定濃度的抗生素(見表2)，并用磁力攪拌器迅速混合均勻后倒平板，配成不同質(zhì)量濃度的抗生素平板；3)藥敏試驗：用無菌棉簽取過夜菌株培養(yǎng)物于0.85%的生理鹽水中，調(diào)節(jié)菌液濁度為0.30～0.35，菌液濃度為107CFU/mL；采用100倍稀釋法稀釋菌液濃度至105CFU/mL，在漩渦振蕩器上震蕩使稀釋液混合均勻；用微量移液器分別取80 μL稀釋后菌懸液于模具點樣孔中，做好起始標(biāo)記并準(zhǔn)確記錄樣品在模具點樣孔上的排列順序；用接種器小心蘸取菌液并接種于已經(jīng)做好起始標(biāo)記的MH藥敏平板上，同一抗生素接種順序由低濃度到高濃度，于37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)18～22 h，觀察生長情況并做記錄；每次試驗前用標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC25922進行質(zhì)控。

表2藥敏測定用抗生素及耐藥折點
Tab.2Antibiotics and breakpoints of drug-resistant

抗生素Antibiotic耐藥(μg/mL)Resistance敏感(μg/mL)Susceptible萘啶酮酸(NAL)≥32≤8環(huán)丙沙星(CIP)≥4≤1加替沙星(GAT)≥8≤2氨芐西林(AMP)≥32≤8阿莫西林-克拉維酸(A/C)≥32/16≤8/4阿莫西林(AMO)≥32≤8鏈霉素(STR)≥8≤4卡那霉素(KAN)≥25≤6慶大霉素(GEN)≥8≤4阿米卡星(AMK)≥32≤16頭孢西丁(FOX)≥32≤8頭孢哌酮(CFP)≥64≤16甲氨芐啶-新諾明(T/S)≥4/76≤2/38四環(huán)素(TET)≥16≤4氯霉素(CHL)≥32≤8

2　結(jié)　果

2.1雞肉源大腸桿菌的污染情況如表3所示，雞肉源大腸桿菌的總分離率為65.97%(760/1152)。其中，來自上海(90.28%，130/144)、北京(86.80%，125/144)和河南(78.47%，113/144)的樣品大腸桿菌分離率相對較高；其次為陜西(65.28%，94/144)、廣東(64.58%，93/144)、廣西(56.94%，82/144)；而來自四川(45.83%，66/144)和福建(39.58%，57/144)的樣品大腸桿菌分離率較低。

表3大腸桿菌樣品數(shù)及分離菌株
Tab.3Information on the number of Escherichia coli isolates

省份名稱Province樣品數(shù)Sampleno．大腸桿菌陽性樣品數(shù)Positiveno．陜西14494(65．28%)河南144113(78．47%)四川14466(45．83%)北京144125(86．80%)上海144130(90．28%)廣東14493(64．58%)廣西14482(56．94%)福建14457(39．58%)總計1152760(65．97%)

2.2雞肉源大腸桿菌對15種常見抗生素的耐藥情況

2.2.1菌株的耐藥率本研究分離的760株雞肉源大腸桿菌對15種常見抗生素呈現(xiàn)不同程度的耐藥，其耐藥率介于9.74%～66.84%，見表4。其中，對萘啶酮酸的抗性最高(66.84%)；其次為阿莫西林一克拉維酸(66.05%)、四環(huán)素(65.00%)、甲氧芐啶-新諾明(63.16%)、氨芐西林(60.66%)、阿莫西林(51.32%)、鏈霉素(50.39%)、氯霉素(48.42%)、卡那霉素(38.29%)、慶大霉素(26.31%)、環(huán)丙沙星(25.79%)、頭孢西丁(21.05%)；而對加替沙星、頭孢哌酮和阿米卡星的抗性較弱，其耐藥率均低于20%。

2.2.2菌株的多重耐藥性試驗結(jié)果表明760株雞肉源大腸桿菌分離株耐藥情況較為嚴(yán)重，大多數(shù)菌株耐3～10種藥(536株，70.53%)，最高可對14種抗生素耐藥(3株，0.39%)，而沒有發(fā)現(xiàn)對15種抗生素都耐的菌株。其中，對8種抗生素耐藥的菌株最多，有78株(10.26%)，其次為9耐(76株，10.00%)，7耐(72株，9.47%)，10耐(68株，8.95%)，4耐(62株，8.16%)，5耐(62株，8.16%)，6耐(62株，8.16%)，3耐(56株，7.37%)，11耐(38株，5.00%)，12耐(19株，2.50%)，13耐(10株，1.32%)。多重耐藥測定結(jié)果見圖1。

圖1　760株雞肉源大腸桿菌的多重耐藥Fig.1　Multidrug resistance of 760 E. coli isolates from chicken

2.3不同地區(qū)分離株耐藥性比較8省雞肉源大腸桿菌的耐藥性比較見表5。整體上看來，其耐藥模式基本相似，對萘啶酮酸、甲氧芐啶-新諾明、四環(huán)素、氨芐西林、阿莫西林-克拉維酸普遍呈現(xiàn)較高的耐藥性，而對加替沙星、頭孢哌酮和阿米卡星的耐藥性相對較低。但值得注意的是，不同地區(qū)分離的菌株對抗生素的耐藥率也有所差異，例如，北京、上海、河南的分離菌株耐藥率相對偏高。

表4760株雞肉源大腸桿菌對15種抗生素的耐藥率
Tab.4Antibiotic resistant rate of 760 E. coli isolates from chicken

藥物種類Typesofdrugs抗生素Antibiotic耐藥菌株數(shù)No．ofisolates耐藥率/%Percentageofresistance喹諾酮類萘啶酮酸(NAL)50866．84環(huán)丙沙星(CIP)19625．79加替沙星(GAT)8511．18青霉素類氨芐西林(AMP)46160．66阿莫西林-克拉維酸(A/C)50266．05阿莫西林(AMO)39051．32氨基糖苷類鏈霉素(STR)38350．39卡那霉素(KAN)29138．29慶大霉素(GEN)20026．31阿卡米星(AMK)749．74頭孢菌素類頭孢西丁(FOX)16021．05頭孢哌酮(CFP)8411．05磺胺類甲氨芐啶-新諾明(T/S)48063．16四環(huán)素類四環(huán)素(TET)49465．00氯霉素類氯霉素(CHL)36848．42

表5不同地區(qū)大腸桿菌的耐藥率
Tab.5Drug resistant rate of E. coli isolates different areas

抗生素Antibiotic耐藥率(%)Percentageofresistance(%)陜西河南四川北京上海廣東福建廣西萘啶酮酸(NAL)71．2875．2257．5875．2075．3852．6943．9071．93環(huán)丙沙星(CIP)22．3431．869．0937．6030．0010．757．3254．39加替沙星(GAT)9．572．651．5212．0010．7722．583．6633．33氨芐西林(AMP)62．7770．8042．4289．6075．38057．3264．91阿莫西林-克拉維酸(A/C)65．9676．9957．5878．4083．8562．3757．325．26阿莫西林(AMO)52．1361．0636．3658．4069．2350．5441．467．01鏈霉素(STR)58．5159．2930．3068．8057．6930．1131．7045．61卡那霉素(KAN)37．2345．1327．2752．8033．0826．8828．0552．63慶大霉素(GEN)18．0927．4313．6448．8024．6225．818．5433．33阿卡米星(AMK)9．5714．163．0320．0010．762．153．665．26頭孢西丁(FOX)1．0613．2712．1269．6019．237．5319．511．75頭孢哌酮(CFP)017．704．5524．0017．697．531．220甲氨芐啶-新諾明(T/S)65．9674．3463．6357．6064．6159．1439．0285．96四環(huán)素(TET)86．1792．0469．704．8080．7760．2254．8889．47氯霉素(CHL)40．4342．4839．3984．0054．6234．4121．9552．63

3　討　論

本研究從陜西、河南、四川、北京、上海、廣東、廣西和福建的各大超市和農(nóng)貿(mào)市場隨機采集1 152份雞肉樣品，其分離率為65.97%，這與2013年王冠玉等[9]從采自貴州省5個地區(qū)縣級市的1 180份樣品，其分離率為70.89%的結(jié)果基本一致。其中，來自上海[90.28%(130/144)]、北京[86.80%(125/144)]和河南[78.47%(113/144)]的樣品大腸桿菌分離率相對較高。特別在超市的雞肉，較多是沒有包裝的冷凍雞，由于北京、上海和河南的人口相對集中，超市內(nèi)的人流量較大，國內(nèi)很多消費者挑選雞肉時，用手翻動雞肉習(xí)慣，使雞肉交叉污染的概率相對較高，這可能是增加了大腸桿菌污染率較高的原因之一。

從總體上看，本研究分離的760株雞肉源大腸桿菌對喹諾酮類中的萘啶酮酸、磺胺類、四環(huán)素以及青霉素類中的氨芐西林、阿莫西林等一直被推薦治療大腸桿菌的抗生素產(chǎn)生了較強的抗性，其耐藥率均達(dá)到60%以上，這與宋立等[10]檢測中國不同地區(qū)家禽大腸桿菌耐藥性結(jié)果相似，上述藥物耐藥率達(dá)到56%以上，接近代鵬飛等[11]對四川地區(qū)動物源性大腸桿菌耐藥性的檢測結(jié)果(耐藥率接近或超過70%)。表明隨著時間推移，一些由于價格低廉，抗菌譜廣而被養(yǎng)殖戶長期大量投入使用的抗菌藥物已逐漸失去對大部分大腸桿菌分離株的防治作用。其中，喹諾酮類抗生素是臨床常用藥物。據(jù)報道，在過去20年里大腸桿菌對喹諾酮類抗生素耐藥率迅速上升[12]。本調(diào)查分離的大腸桿菌對喹諾酮類抗生素中的萘啶酮酸和環(huán)丙沙星的耐藥率分別為66.84%和25.79%，與只帥等[7]對陜西地區(qū)食源性大腸桿菌的檢測結(jié)果相似(62.6%和39.2%)，但大于Van等[13](34.3%和16.2%)和Petar Knezevic等[14](33.9%和7.0%)對食源性大腸桿菌的檢測結(jié)果，提示在我國養(yǎng)殖業(yè)中，存在喹諾酮類抗生素長期濫用的現(xiàn)象。青霉素類抗生素也是臨床使用較為有效的抗菌藥物，其作用機制是破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞繁殖期起殺菌作用[15]。本調(diào)查中使用了3種青霉素類抗生素，分離菌株對它們的耐藥范圍在51.32～66.05%。該結(jié)果高于K. Immaculate jeyasanta等報道的食源性大腸桿菌對氨芐西林(34.06%)和阿莫西林-克拉維酸(47.25%)的耐藥率，但低于毛福超等報道的禽源性大腸桿菌對氨芐西林(81.63%)和阿莫西林 (67.34%)的耐藥率，這可能與地區(qū)、菌株來源及處理方法不同有關(guān)[16-17]?；前奉愃幬锛籽跗S啶-新諾明通過使細(xì)菌的葉酸合成代謝受到阻斷達(dá)到抑菌目的[15]，四環(huán)素類藥物主要是阻止氨?；c核糖核蛋白體的結(jié)合，阻止肽鏈的增長和蛋白質(zhì)的合成，從而抑制細(xì)菌的生長。在中國其他學(xué)者的報道中，食源性大腸桿菌對這兩類藥物均表現(xiàn)出非常嚴(yán)重的耐藥性[18-20]。分離株對較少使用的加替沙星、頭孢哌酮和阿米卡星的抗性較弱，其耐藥率均低于20%，與當(dāng)前的研究報道一致[21]。以上結(jié)果說明雞肉源大腸桿菌的耐藥性與人常用藥(如喹諾酮類、青霉素類等)存在較多重疊，存在通過食物鏈傳播給人的風(fēng)險，應(yīng)引起有關(guān)部門的重視，提前做好預(yù)防工作控制其耐藥性大范圍的傳播。

760株雞肉源大腸桿菌中，多數(shù)表現(xiàn)為多重耐藥，這與中國其它地區(qū)有關(guān)報道結(jié)果一致[22-25]。多重耐藥菌株的出現(xiàn)與抗生素不合理、不規(guī)范的使用有關(guān)，因此，應(yīng)禁止在飼養(yǎng)過程中濫用抗生素，同時要注意科學(xué)合理用藥，在抗菌藥物的選擇上應(yīng)考慮聯(lián)合用藥、交叉用藥、輪換用藥，建立健全大腸桿菌耐藥性監(jiān)測系統(tǒng)。

此外，本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的耐藥性呈現(xiàn)一定的區(qū)域性。不同地區(qū)對抗生素耐藥率有所差異，其中北京、上海和河南菌株耐藥率相對偏高。這可能是因為不同地區(qū)在預(yù)防和治療相關(guān)疾病時，所使用抗菌藥物的強度和頻率存在差異。對北京、上海和河南等人口密集的地區(qū)，可能需要相對來說更為集中的飼養(yǎng)和加工規(guī)模來滿足其食物需求，因此使用抗菌藥物的強度和頻率有所提高，從而導(dǎo)致雞肉源大腸桿菌分離株的耐藥率也有所提高[26]。

本試驗對8省雞肉源大腸桿菌的耐藥性進行檢測與比較，有利于監(jiān)控不同地區(qū)雞肉源大腸桿菌耐藥性流行趨勢，并為各地區(qū)對抗生素的規(guī)范使用，以減緩細(xì)菌耐藥性的擴散和傳播具有重要的指導(dǎo)意義。

4　結(jié)　論

抗生素的耐藥性已成為全球最緊迫的公共衛(wèi)生問題之一，并且這一問題仍隨著抗生素的過度使用而日益加劇[27]。由于養(yǎng)殖場和獸醫(yī)臨床大量使用抗生素，大腸桿菌耐藥譜逐漸擴大，耐藥率逐漸上升，原本對大腸桿菌病治療有效的抗菌藥物療效明顯下降甚至喪失[28]。本次調(diào)查結(jié)果表明，8省雞肉源大腸桿菌的耐藥現(xiàn)象比較嚴(yán)重，對萘啶酮酸、青霉素類、四環(huán)素類、磺胺類藥物的抗性最強，耐藥率均在60%以上。多重耐藥類型以8耐最多，7耐、9耐和10耐次之。北京、上海和河南地區(qū)的雞肉源大腸桿菌耐藥性高于其他地區(qū)。由此，各地區(qū)相關(guān)部門應(yīng)加大對抗生素使用的監(jiān)管力度，促使相關(guān)養(yǎng)雞企業(yè)合理、規(guī)范地使用抗生素，以避免細(xì)菌耐藥性從食物鏈進入到人體中，保障公眾健康。

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