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白屈菜對(duì)低溫脅迫應(yīng)答的生理學(xué)研究及分子機(jī)制解析

2018-04-03 01:17楊雪梅許永華
關(guān)鍵詞:白屈菜脯氨酸生理

趙 露,楊雪梅,李 俊,劉 霞,許永華

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118)

白屈菜(ChelidoniummajusL.)是罌粟科白屈菜屬多年生草本植物,全草入藥,富含多種生物堿,有止咳、抗炎、止痛等多方面藥理作用,[1-6]是止咳、胃腸消炎及止痛類中藥制劑的重要原料[7].在對(duì)白屈菜馴化栽培的研究中發(fā)現(xiàn),白屈菜對(duì)生態(tài)環(huán)境有比較廣泛的適應(yīng)性,對(duì)土壤酸堿性、強(qiáng)光和蔭蔽環(huán)境、干旱及溫度變化的適應(yīng)性較強(qiáng),特別是抗寒凍性極強(qiáng),在冬季氣溫-50℃以下的地區(qū)(如內(nèi)蒙古根河市),其蓮座狀叢生葉及當(dāng)年種子萌發(fā)的幼苗可以自然越冬,并在翌年初春冰雪尚未完全融化時(shí),葉片由水漬狀回復(fù)成正常狀態(tài)開始生長(zhǎng),是冬性植物.白屈菜極強(qiáng)的耐寒凍特性機(jī)理目前在國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道.

植物抗寒性研究表明,環(huán)境因素和物種生物學(xué)特性是影響植物抗寒凍性的關(guān)鍵因素,環(huán)境因素主要是溫度、光周期、水分狀況[8];物種生物學(xué)特性主要由植物遺傳背景、發(fā)育和生長(zhǎng)時(shí)期以及植物對(duì)低溫脅迫的保護(hù)機(jī)制所決定[9].植物在適應(yīng)寒凍脅迫過程中,啟動(dòng)抗寒凍機(jī)制以減少低溫造成的損傷,出現(xiàn)一些顯著的生理生化變化:保護(hù)性物質(zhì)增多,調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透性并降低冰點(diǎn)溫度[10-15];含水量下降,呼吸代謝減弱[16];激素調(diào)控系統(tǒng)發(fā)生變化,如內(nèi)源激素中IAA、GA濃度下降,ABA濃度升高,以抑制生長(zhǎng)促進(jìn)休眠[17];細(xì)胞質(zhì)膜氧化性發(fā)生變化等[17-19].目前,對(duì)植物感知低溫信號(hào)的研究表明,組蛋白H2A.Z可能參與擬南芥的溫度感知;三磷酸肌醇(IP3)介導(dǎo)的Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能在低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起決定作用;磷脂酶D、脂肪酸去飽和代謝關(guān)鍵酶以及肌醇多磷酸磷酸酶基因FRY1等與低溫信號(hào)感知有關(guān).[17]對(duì)低溫脅迫應(yīng)答的分子機(jī)制研究表明,C-復(fù)制-結(jié)合因子/脫水反應(yīng)元素結(jié)合因子(CBF/DREB1,C-repeat binding factor/dehydration responsive element binding factor1)調(diào)控途徑具有保守性,在多種雙子葉和單子葉植物中均發(fā)現(xiàn)了該關(guān)鍵基因參與的調(diào)控,[17]揭示在單子葉植物中存在類似于擬南芥的CBF/DREB1 調(diào)控機(jī)制[20].此外,植物中還存在其他的低溫信號(hào)傳遞通路[17].

迄今,有關(guān)白屈菜抗寒凍性的研究未見報(bào)道,其應(yīng)答低溫脅迫的生理生化反應(yīng)以及低溫應(yīng)答分子機(jī)制尚不清楚,因此,本文對(duì)此開展了相關(guān)研究,以探究其超強(qiáng)抗凍性的生理基礎(chǔ)和分子機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1采樣

野生白屈菜采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)野生白屈菜1號(hào)觀測(cè)樣地,樣地的地理位置為北緯43°48′33″、東經(jīng)125°24′21″,海拔230 m;夏季林間郁閉度在85%左右,木本植物有銀中楊、紅皮云杉,草本植物有紫花地丁、早開堇菜.8月初白屈菜莖枯萎、根盤萌發(fā)新的基生葉,待基生葉長(zhǎng)到8 cm左右開始采樣,持續(xù)到12月末氣溫降至-20℃以下.夏秋季采樣溫度范圍10℃~28℃,林下日照時(shí)間8~12 h,采樣時(shí)間為當(dāng)日14:00,即日間溫度最高時(shí)段.秋冬季采樣溫度范圍-25℃~10℃,林下日照時(shí)間0~8 h(積雪覆蓋后越冬苗日照時(shí)間為0 h),以每日最低溫連續(xù)3 d達(dá)到采樣低溫時(shí)開始采樣,采樣低溫設(shè)定為5℃,0℃,-5℃,-10℃,-15℃,-20℃,采樣時(shí)間為當(dāng)日8:00.分別從3株植株采集葉片.

1.1.2控制降溫條件下的實(shí)驗(yàn)材料

控制條件下生長(zhǎng)的白屈菜,是將上述1號(hào)觀測(cè)樣地的白屈菜苗及根際周圍土壤一起移植到營(yíng)養(yǎng)缽中,放入人工氣候箱,25℃、16 h光照8 h黑暗適應(yīng)培養(yǎng)1周后,將培養(yǎng)溫度分別設(shè)定為25℃,20℃,15℃,10℃,5℃,0℃,每一溫度點(diǎn)維持3 d,在各溫度點(diǎn)采樣.-5℃,-10℃處理在冰箱中進(jìn)行,全黑暗,每個(gè)溫度點(diǎn)維持3 d.采樣時(shí)分別從3株植株取葉片.

1.1.3轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及基因驗(yàn)證材料

材料來源及采樣方法同1.1.1,采樣溫度為0℃,-10℃,-20℃,分別命名為A、B、C三組,每組分別從3株野生白屈菜植株上取葉片.基因驗(yàn)證用測(cè)序的3份平行材料.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1主要生理指標(biāo)測(cè)定

細(xì)胞膜滲透性——相對(duì)電導(dǎo)法;游離脯氨酸——酸性茚三酮比色法;丙二醛——硫代巴比妥酸法(TCA法);可溶性糖——蒽酮乙酸乙酯比色法;可溶性蛋白——考馬斯亮藍(lán)法;葉綠素含量——比色法.每份樣品取白屈菜葉片0.3 g,3次重復(fù).采用IBM SPSS Statistics22軟件對(duì)生理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析.

1.2.2轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行測(cè)序及數(shù)據(jù)庫比對(duì).測(cè)序平臺(tái):IlluminaHiSeqTM 2500測(cè)序儀,文庫質(zhì)檢:Agilent 2100分析儀;每樣本數(shù)據(jù)量為6 G,數(shù)據(jù)解析包括非冗余數(shù)據(jù)庫(NR,non-redundant)、真核生物同源蛋白數(shù)據(jù)庫(KOG)、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(SWISSPROT)、基因數(shù)據(jù)庫(GO,gene ontology)、基因與基因數(shù)據(jù)庫(KEGG,Kyoto encyclopedia of genes and genomes)等5個(gè)數(shù)據(jù)庫比對(duì)及差異表達(dá)基因篩選.

1.2.3基因表達(dá)驗(yàn)證

采用實(shí)時(shí)定量PCR法進(jìn)行基因表達(dá)驗(yàn)證.RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑采用Vazyme公司生產(chǎn)的試劑盒(產(chǎn)品代碼R223-01),熒光定量PCR試劑采用Qiagen公司生產(chǎn)的定量PCR試劑盒(QuantiFast? SYBR? Green PCR Kit);儀器:LightCycler? 480 ⅡPCR儀(Roche).

2 結(jié)果與分析

2.1 野生白屈菜低溫應(yīng)答過程中主要生理指標(biāo)變化趨勢(shì)

植物感受低溫刺激啟動(dòng)生理應(yīng)答,細(xì)胞內(nèi)抗寒凍性物質(zhì)脯氨酸、可溶性糖(蔗糖、葡萄糖)、可溶性蛋白含量增加,細(xì)胞滲透性改變、葉綠素含量降低[21].測(cè)定秋冬季野生白屈菜應(yīng)答低溫的主要生理指標(biāo)、各化合物含量以及電導(dǎo)率的變化可反映在降溫過程中白屈菜的生理狀況.

野生白屈菜在降溫過程中,與低溫應(yīng)答相關(guān)的主要生理指標(biāo)的變化趨勢(shì)見圖1.其中,細(xì)胞內(nèi)抗寒凍性物質(zhì),如脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等,在5℃~0℃寒害發(fā)生時(shí)含量開始升高;在0℃~-5℃時(shí),脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量急劇升高,-5℃時(shí)幾乎達(dá)到最大值.與此同時(shí),由于脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量增加,細(xì)胞內(nèi)自由水含量降低,細(xì)胞的相對(duì)電導(dǎo)率顯著降低,在-5℃時(shí)達(dá)到最低值,即細(xì)胞滲透性最低,表明細(xì)胞已經(jīng)完成低溫馴化,獲得了抗凍性.在-5℃~-20℃時(shí),植物代謝水平降低,脯氨酸和可溶性糖含量降低,細(xì)胞內(nèi)溶液濃度降低,相對(duì)電導(dǎo)率呈上升趨勢(shì),細(xì)胞滲透性增大,提示可能由于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙冰晶形成造成膜損傷,導(dǎo)致電導(dǎo)率升高.在-5℃~-20℃時(shí),細(xì)胞中可溶性蛋白含量升高,達(dá)到12 mg/g,推測(cè)可能是0℃以下低溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗凍蛋白.

丙二醛是逆境脅迫時(shí)植物細(xì)胞膜脂被活性氧氧化的產(chǎn)物,其含量高低反映細(xì)胞膜脂過氧化以及細(xì)胞膜損傷的程度.丙二醛能引起細(xì)胞膜功能紊亂,破壞細(xì)胞中酶、蛋白質(zhì)以及核酸等分子結(jié)構(gòu).白屈菜在25℃~0℃的降溫過程中,丙二醛含量顯著提高,25℃時(shí)丙二醛含量是0.002 μmol/g,而0℃時(shí)是0.020 μmol/g,是前者的10倍.在-5℃和-15℃時(shí),丙二醛含量分別是0.020 0和0.017 9 μmol/g,表明白屈菜低溫應(yīng)答過程中細(xì)胞膜氧化程度顯著提高.而-20℃時(shí),丙二醛含量顯著下降,推測(cè)可能與抗凍蛋白增加有關(guān).

葉綠素含量降低是植物應(yīng)答低溫的普遍規(guī)律.白屈菜在25℃~-20℃的降溫過程中,葉綠素含量呈下降趨勢(shì),反映出光合色素分解、光合作用減弱直至停止的生理狀態(tài).

以正常生長(zhǎng)溫度25℃樣本組為對(duì)照,對(duì)各溫度組野生白屈菜的生理指標(biāo)進(jìn)行了差異顯著性分析,結(jié)果表明,脯氨酸含量25℃組與其他各溫度組有極顯著差異,25℃組以外的各溫度組間沒有極顯著差異.可溶性糖含量25℃組與0℃,-5℃,和-10℃組間存在極顯著差異;0℃組與-5℃,-10℃組間也存在極顯著差異,說明0℃以下的低溫對(duì)可溶性糖的積累影響顯著.可溶性蛋白含量25℃組與-5℃,-10℃,-15℃,-20℃組間均存在極顯著差異.細(xì)胞相對(duì)電導(dǎo)率5℃組與-5℃,-10℃,-15℃組間存在極顯著差異.丙二醛含量25℃組與0℃,-5℃,-10℃,-15℃組間均有極顯著差異.葉綠素含量25℃組與-20℃組間有極顯著差異.

圖1 低溫應(yīng)答時(shí)野生白屈菜主要生理指標(biāo)變化趨勢(shì)

2.2 白屈菜應(yīng)答低溫生理反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

在固定光照強(qiáng)度、光照時(shí)間的人工氣候箱中,控制降溫,測(cè)定白屈菜在此過程中主要生理指標(biāo)的變化情況,并與野生白屈菜在降溫過程中生理指標(biāo)的變化進(jìn)行比較分析,以確定白屈菜低溫應(yīng)答過程的生理狀態(tài),結(jié)果見圖2.

在15℃~0℃的低溫馴化階段,人工控制栽培的白屈菜抗寒凍性物質(zhì)脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量開始增加(見圖2(a)—(c)),但增加幅度較小,如可溶性糖增加幅度小于野生白屈菜在這一溫度區(qū)間的變化值.在0℃~-5℃時(shí),栽培白屈菜脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量變化趨勢(shì)與野生白屈菜相同,-5℃時(shí)幾乎均達(dá)到最大值,分別是0.721 5,49.043 1,3.648 9 mg/g,但絕對(duì)值小于野生白屈菜.-5℃~-10℃時(shí),脯氨酸和可溶性蛋白含量呈下降趨勢(shì),而可溶性糖含量略有升高,在這一區(qū)間,脯氨酸的變化趨勢(shì)與野生白屈菜相同,可溶性糖和可溶性蛋白的變化趨勢(shì)與野生白屈菜相反.

栽培白屈菜相對(duì)電導(dǎo)率在25℃~5℃降溫階段變化比較平穩(wěn),變化范圍在6.920 8%~3.183%之間(見圖2d),與脯氨酸的變化趨勢(shì)相關(guān),反應(yīng)在這一溫度區(qū)間滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率的影響較大.0℃時(shí),相對(duì)電導(dǎo)率升高到8.978 7%,此時(shí)脯氨酸雖略有升高但可溶性糖含量較之前顯著下降,表明隨著溫度降低白屈菜的光合作用減弱甚至停止,糖分積累減少,顯著影響細(xì)胞質(zhì)濃度,導(dǎo)致相對(duì)電導(dǎo)率升高.-5℃~-10℃階段,處于周期性光照、無保護(hù)的葉片受到冷凍損傷,細(xì)胞相對(duì)電導(dǎo)率急劇升高,達(dá)到31.990 9%,此時(shí)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸和抗凍蛋白含量升高,但可溶性蛋白含量顯著小于無光照條件下的野生白屈菜,提示光照可能影響0℃以下低溫對(duì)抗凍蛋白的誘導(dǎo)表達(dá).

在固定的光周期和控制降溫條件下,丙二醛在15℃~-10℃降溫階段含量變化范圍為0.007 708~0.011 692 μmol/g,是正常生長(zhǎng)溫度時(shí)的1.5~2.0倍,表明細(xì)胞膜氧化性提高.控制降溫過程中,盡管維持一定的光照周期,但隨著溫度降低,葉綠素含量呈下降趨勢(shì),這種變化與野生白屈菜相同.

以25℃組樣本做對(duì)照,對(duì)各溫度組白屈菜的生理指標(biāo)做差異顯著性分析,結(jié)果表明,在完全控制的降溫過程中,脯氨酸含量25℃組與-5℃,-10℃組間存在極顯著差異.可溶性糖含量25℃組與10℃,5℃,-10℃組間存在極顯著差異.可溶性蛋白含量,20℃組與其他溫度組間均存在極顯著差異,而其他各溫度組之間沒有顯著差異.相對(duì)電導(dǎo)率-5℃,-10℃組分別與0℃以上(含0℃組)各溫度組間存在極顯著差異.丙二醛含量25℃組與5℃,-10℃組間有極顯著差異.葉綠素含量25℃組與15℃以下(包括15℃組)各組間存在極顯著差異.

圖2 控制栽培白屈菜應(yīng)答低溫時(shí)主要生理指標(biāo)變化趨勢(shì)

2.3 白屈菜低溫應(yīng)答分子機(jī)制分析

如1.1.3方法所述取樣,每個(gè)溫度點(diǎn)設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù),進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)量分析及篩選、數(shù)據(jù)庫比對(duì),共獲得長(zhǎng)度300 bp以上的基因序列(Unigene,universal gene)113 504個(gè),平均每組有9 586 個(gè)Unigene顯示為差異表達(dá)基因,包括上調(diào)表達(dá)基因4 509個(gè)、下調(diào)表達(dá)基因5 077個(gè).與NR、SWISS-PROT、KOG、 KEGG和GO等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),被注釋的Unigene分別為58 302,41 251,34 296,14 031和36 490個(gè),注釋比例分別為51.37%,36.34%,30.22%,12.36%和32.15%.

與GO數(shù)據(jù)庫比對(duì)后,注釋基因分組如圖3所示(圖3為轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)自動(dòng)生成).Unigene被大量注釋到生物過程類別的“細(xì)胞過程”“代謝過程”“生物過程的調(diào)控”,細(xì)胞組分類別的“細(xì)胞組分”“細(xì)胞膜組分”及“細(xì)胞器組分”,分子功能類別的“催化活性”“分子結(jié)合功能”及“轉(zhuǎn)運(yùn)活性”.

樣本間差異表達(dá)基因分組中“細(xì)胞過程”“代謝過程”“生物過程的調(diào)控”變化與生理指標(biāo)脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量變化趨勢(shì)相吻合,“細(xì)胞組分”變化與凍害發(fā)生時(shí)可溶性蛋白含量變化趨勢(shì)相吻合.“細(xì)胞膜組分”中重要生理指標(biāo)丙二醛也發(fā)生顯著性變化.

圖3 GO注釋統(tǒng)計(jì)圖

對(duì)A(0℃)、B(-10℃)、C(-20℃)3組樣本間差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析,結(jié)果見圖4(圖4為轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)自動(dòng)生成).由圖4可見,圖4(a)表達(dá)差異顯著的前5類基因分別是質(zhì)外體、細(xì)胞壁、質(zhì)膜、膜的錨定組分、質(zhì)膜的錨定組分;圖4(b)兩樣本間差異顯著的前5類基因分別是質(zhì)外體、細(xì)胞壁、質(zhì)膜、胞外基質(zhì)、胞外區(qū);圖4(c)表達(dá)差異顯著的前5類基因分別是葉綠體類囊體膜、葉綠體、類囊體、葉綠體類囊體、葉綠體基粒.

樣本B與樣本A比較(見圖4(a)),主要在膜成分上出現(xiàn)差異,提示膜的滲透性、氧化性發(fā)生變化,與生理測(cè)定的相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛等物質(zhì)的變化趨勢(shì)一致;樣本C與樣本A比較(見圖4(b))可見,細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞外區(qū)域發(fā)生顯著變化,與電導(dǎo)率變化趨勢(shì)一致,提示植物在凍害脅迫時(shí),可能由于膜損傷細(xì)胞內(nèi)容物滲出導(dǎo)致細(xì)胞外部出現(xiàn)變化.樣本C與樣本B比對(duì)(見圖4(c))可見,變化全部顯示在葉綠體及類囊體上,提示凍害脅迫時(shí)葉綠體受到損傷,與生理實(shí)驗(yàn)中葉綠素的變化趨勢(shì)一致.

(a)樣本B與樣本A的比對(duì)結(jié)果;(b)樣本C與樣本A的比對(duì)結(jié)果;(c)樣本C與樣本B的比對(duì)結(jié)果

2.4 野生白屈菜低溫應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)驗(yàn)證

從樣本間差異表達(dá)基因中選取7個(gè)與脯氨酸合成代謝有關(guān)的基因、7個(gè)與低溫響應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行基因表達(dá)量的再次驗(yàn)證,以檢驗(yàn)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性及生理生化指標(biāo)變化趨勢(shì)的準(zhǔn)確性.篩選的目標(biāo)基因見表1.

基因相對(duì)表達(dá)量驗(yàn)證結(jié)果如圖5所示.圖5結(jié)果顯示,與脯氨酸合成及代謝相關(guān)的基因在A(0℃)組樣本中表達(dá)量高,在B(-10℃)組樣本中多數(shù)表現(xiàn)為下降,在C(-20℃)組樣本中除脯氨酸脫氫酶和鳥氨酸-氧合酸轉(zhuǎn)氨酶基因外,其他基因表達(dá)量相似或較B組降低,表明脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),主要在低溫脅迫前期發(fā)揮作用.轉(zhuǎn)錄因子CBF4/DREB1d、MYB44、ZAT10等在0℃時(shí)表達(dá)量較高,在-10℃,-20℃時(shí)表達(dá)量降低,表明其在低溫脅迫早期起調(diào)控作用,而ERF5(ethylene responsive factor 5)、ICE1(inducer ofCBFexpression 1)、WRKY40等在-20℃組表達(dá)量顯著上升,表明其在凍害脅迫時(shí)作用活躍,可能與抗凍蛋白的合成密切相關(guān).

表1 目標(biāo)基因名稱及基因庫ID編號(hào)

圖5 脯氨酸合成代謝相關(guān)基因、低溫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子基因相對(duì)表達(dá)量驗(yàn)證

3 討論

植物抗寒性的獲得與溫度、光周期密切相關(guān)[22].野生白屈菜在秋冬季來臨時(shí),林下光照時(shí)間逐漸縮短,氣溫在5℃~0℃時(shí),光照時(shí)間不足12 h;0℃~-10℃時(shí),光照時(shí)間為9~10 h;氣溫降至-15℃~-20℃時(shí),光照時(shí)間僅8~9 h,或由于積雪覆蓋,植株完全得不到光照,因此,野生白屈菜在低溫和光周期雙重作用下,較早地啟動(dòng)低溫應(yīng)答反應(yīng),滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及抗凍物質(zhì)等主要生理指標(biāo)較早發(fā)生變化.而在人工控制條件下生長(zhǎng)的白屈菜,盡管溫度不斷下降,但光照周期始終保持在12 h光照、12 h黑暗,且光照強(qiáng)度保持1 500 lx不變.恒定的光照周期及光照強(qiáng)度一定程度上延遲了白屈菜對(duì)低溫的響應(yīng)反應(yīng),與低溫應(yīng)答相關(guān)的主要生理指標(biāo)較野生白屈菜變化要晚.我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,野生白屈菜大約在5℃即開始啟動(dòng)抗寒凍機(jī)制,生理指標(biāo)變化顯著,比控制生長(zhǎng)的白屈菜啟動(dòng)應(yīng)答溫度要高,在同樣的溫度條件下,脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白的含量高于人工氣候箱中生長(zhǎng)的白屈菜.這一結(jié)果也證明,在相同的溫度條件下,光照降低了植物的抗寒性,短日照導(dǎo)致植物抗寒能力增強(qiáng).對(duì)其他植物的相關(guān)研究也證明,人為改變短日照為長(zhǎng)日照的處理會(huì)影響抗凍鍛煉效果,植物抗凍能力下降.-5℃時(shí)兩種材料的相對(duì)電導(dǎo)率值也證明光照影響植物抗凍性的獲得,造成細(xì)胞損傷.

在控制降溫條件下生長(zhǎng)的白屈菜丙二醛含量小于野生白屈菜的,說明在光照條件下,低溫馴化效果被部分消除,葉綠體功能得到恢復(fù),活性氧被消除,使膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛含量降低.控制條件下生長(zhǎng)的白屈菜葉綠素含量范圍高于野生白屈菜,這也可以證明葉綠體沒有完全損傷,功能依然存在.

基因表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果表明,7個(gè)與脯氨酸合成及代謝有關(guān)的基因在低溫脅迫的早期及寒害發(fā)生時(shí)作用活躍,細(xì)胞組分中脯氨酸含量升高,這一變化趨勢(shì)與生理指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果相吻合.在-20℃時(shí),與低溫應(yīng)答相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如ERF5、ICE1、WRKY40及RAV1的表達(dá)量顯著升高,這些轉(zhuǎn)錄因子在抗凍蛋白的合成中發(fā)揮直接或間接的調(diào)控作用,促進(jìn)抗凍蛋白的誘導(dǎo)合成,這一結(jié)果與凍害脅迫時(shí)細(xì)胞中可溶性蛋白含量升高相吻合.因此,實(shí)驗(yàn)從分子機(jī)制上初步闡明了白屈菜抗寒凍性的生理基礎(chǔ).

本文首次報(bào)道了白屈菜的抗寒性和應(yīng)答低溫脅迫的生理生化基礎(chǔ),并首次基于白屈菜應(yīng)答低溫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),分析、驗(yàn)證并初步揭示了其低溫應(yīng)答過程的分子機(jī)制,為今后發(fā)現(xiàn)并利用有價(jià)值的抗寒基因奠定了基礎(chǔ).

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