尚夢(mèng)園，于峰，趙雙雙，吳新財(cái)，杜睿，陳寶定

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，占胃腸道腫瘤的第3位［1］。近年來，結(jié)腸癌的發(fā)病率與病死率在我國(guó)呈上升趨勢(shì)，達(dá)到甚至超過了西方發(fā)達(dá)國(guó)家的平均水平，其發(fā)病年齡在40歲以上，高發(fā)年齡普遍在50～60歲，比西方國(guó)家平均提早 10歲［2－3］。結(jié)腸癌患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的概率高達(dá)50%。研究認(rèn)為，結(jié)腸癌發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的概率與結(jié)腸靜脈血通過門靜脈進(jìn)入肝臟有密切關(guān)系。流行病學(xué)調(diào)查顯示，隨著年齡的增大，結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生率越高，可能與年齡增大者機(jī)體免疫力下降有關(guān)［4］。

超聲引導(dǎo)下的熱消融治療具有操作簡(jiǎn)單、安全、療效好的優(yōu)點(diǎn)，近年來已經(jīng)成功應(yīng)用于各類腫瘤的微創(chuàng)介入治療［5－7］。微波消融屬于熱消融的一種。已有研究證實(shí)，微波消融治療不僅能直接使腫瘤細(xì)胞凝固壞死，滅活腫瘤組織，而且還能提高患者免疫細(xì)胞數(shù)量及其抗腫瘤能力。但何種劑量等級(jí)既能有效殺傷腫瘤細(xì)胞又能最大限度地激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫尚無研究，本實(shí)驗(yàn)比較不同熱劑量等級(jí)的微波消融治療對(duì)結(jié)腸癌小鼠T細(xì)胞的影響。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

1.1.1動(dòng)物與瘤株 C57BL／6小鼠，6～8周齡，體重（20±2）g，購(gòu)自江蘇大學(xué)動(dòng)物中心；MC38結(jié)腸癌細(xì)胞株由江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究所提供。

1.1.2試劑及設(shè)備 FITC標(biāo)記的抗小鼠CD3抗體、PECy5標(biāo)記的抗小鼠CD4抗體、PE標(biāo)記的抗小鼠CD8抗體，相應(yīng)同型對(duì)照均為Biolend公司產(chǎn)品；KY-2000微波消融治療儀購(gòu)于南京億高微波電子研究所，微波頻率為2 450 MHz，輸出功率范圍為5～20W且連續(xù)可調(diào)，微波電極針直徑為1.2 mm；流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.2　方法

1.2.1結(jié)腸癌荷瘤小鼠模型的建立 將在體外培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MC38細(xì)胞消化后制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×107／mL，用1 mL胰島素注射器在C57BL／6小鼠的右前肢皮下接種0.1 mL，建立小鼠結(jié)腸癌皮下移植瘤模型。當(dāng)小鼠荷瘤9 d，腫瘤體積長(zhǎng)至約1 000 mm3時(shí)，認(rèn)為模型制作成功。

1.2.2分組 腫瘤細(xì)胞接種9 d后，選取40只腫瘤體積約1 000 mm3的小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。對(duì)照組不作任何處理，微波消融治療分為低劑量組（5W、60 s），中劑量組（10W、60 s）和高劑量組（15 W、60 s）。

1.2.3微波消融荷瘤小鼠腫瘤 小鼠腹腔注射水合氯醛0.1 mL麻醉后，固定于自制小鼠手術(shù)臺(tái)。常規(guī)消毒、鋪巾，切開皮膚，沿腫瘤長(zhǎng)徑方向插入微波天線，接通微波消融治療儀，對(duì)小鼠進(jìn)行不同熱劑量等級(jí)的微波消融治療，根據(jù)不同分組調(diào)整能量輸出，持續(xù)60 s（圖1）。消融后皮下腫瘤原位留置，待小鼠從麻醉中蘇醒后，送回動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

圖1　高劑量組小鼠微波消融超聲圖

1.2.4觀察小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況 于微波消融后的7 d、14 d時(shí)，經(jīng)超聲測(cè)量各組小鼠瘤體的體積。

1.2.5檢測(cè)小鼠脾臟T細(xì)胞變化 微波消融后14 d，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟中的 CD3＋T、CD4＋T、CD8＋T細(xì)胞。①標(biāo)本采集：脫頸處死小鼠，切開腹部摘取脾臟，將脾臟放置于4℃預(yù)冷的PBS緩沖液中。②脾淋巴細(xì)胞分離：將脾臟置于篩網(wǎng)上，用5 mL注射器內(nèi)芯研磨脾臟組織，而后用PBS緩沖液沖洗篩網(wǎng)，收集細(xì)胞懸液，室溫下500×g離心10 min。棄上清液后加入紅細(xì)胞裂解液2 mL，混合均勻，溫室下放置10 min，500×g離心10 min。棄上清液，加PBS緩沖液2 mL，細(xì)胞混合均勻，調(diào)整細(xì)胞密度為106／mL。③ 流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾臟中T淋巴細(xì)胞。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1　微波消融術(shù)后荷瘤小鼠腫瘤體積的變化

4組小鼠微波消融后第7天和第14天時(shí)，分別用超聲測(cè)量腫瘤大小，結(jié)果顯示，微波消融處理后小鼠腫瘤體積較對(duì)照組明顯縮小（P＜0.05）。見表1。

表1　微波消融術(shù)后荷瘤小鼠腫瘤體積n＝10，mm3，±s

表1　微波消融術(shù)后荷瘤小鼠腫瘤體積n＝10，mm3，±s

組別　第7天　第14天對(duì)照組1 390±80.5　1 688±89.3低劑量組　988±40.8　837±72.8中劑量組　970±55.7　803±90.4高劑量組　623±79.2　525±65.7 F值16.342　18.227 P值?。?.05　＜0.05

2.2　微波消融術(shù)后荷瘤小鼠T細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果

高、中、低劑量組的 CD3＋T、CD4＋T細(xì)胞均高于對(duì)照組（P＜0.05或 ＜0.01），且高劑量組明顯高于中、低劑量組（P＜0.05）。高劑量組的CD4＋／CD8＋T細(xì)胞比值明顯高于中、低劑量組（P＜0.05），且與對(duì)照組相比，增高顯著（P＜0.01）。4組間的CD8＋T細(xì)胞不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見圖2、表2。

圖2　小鼠脾臟淋巴細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

表2　小鼠脾臟中T淋巴細(xì)胞比例

3　討論

本研究結(jié)果顯示，微波消融術(shù)后，腫瘤體積減??；與對(duì)照組相比，各劑量組脾臟細(xì)胞中的CD3＋T、CD4＋T細(xì)胞和CD4＋／CD8＋T比值均增加，其中高劑量組顯著增加。上述結(jié)果提示，微波消融后的小鼠免疫力有所提高。另外，本研究同時(shí)也顯示，中、低劑量組的 CD3＋T、CD4＋T細(xì)胞和 CD4＋／CD8＋T比值并無明顯差別，說明高劑量的微波消融治療更加有利于提高小鼠的免疫力。

結(jié)腸癌好發(fā)于中老年人，可發(fā)生肝、肺轉(zhuǎn)移，是威脅中老年人的重大疾病之一［8］。近年來，隨著控溫技術(shù)的不斷改善，局部熱消融治療已成為繼手術(shù)、放療、化療之后的又一重要治療手段。局部熱消融包括射頻消融和微波消融［9］，相對(duì)于射頻消融，微波消融有多個(gè)微波能量源，組織加熱不受電阻和傳導(dǎo)性的影響，而電磁波可以在更短的時(shí)間內(nèi)使組織溫度達(dá)到更高。近年來，微波消融技術(shù)提高了熱效率，增加了消融體積，使得大腫瘤和富血供臟器腫瘤的治療成為可能，拓展了該技術(shù)在臨床腫瘤治療應(yīng)用的領(lǐng)域［10－11］。

“腫瘤微環(huán)境”理論認(rèn)為腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)能準(zhǔn)確地反映宿主對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)。許多研究都證實(shí)，熱消融不僅能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞起到直接殺傷作用，還可從多個(gè)環(huán)節(jié)激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。Zerbini等［12］報(bào)道，消融產(chǎn)生的高溫能使肝腫瘤組織發(fā)生凝固性壞死，大量壞死組織作為抗原能夠產(chǎn)生持續(xù)性的局部炎癥反應(yīng)，活化抗原遞呈細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，改善機(jī)體抗腫瘤免疫耐受狀態(tài)。抗腫瘤免疫應(yīng)答主要以由細(xì)胞免疫為主［13－14］，其中T淋巴細(xì)胞在腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，CD4＋T細(xì)胞主要介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的耐受，既可識(shí)別腫瘤細(xì)胞分泌的可溶性抗原，又可釋放多種細(xì)胞因子參與抗瘤效應(yīng)，共同發(fā)揮抗瘤作用。而CD8＋T細(xì)胞可以在促炎因子的作用下分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，加強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。CD4＋T和CD8＋T細(xì)胞相互誘導(dǎo)和制約形成T細(xì)胞網(wǎng)，保持一定的比值，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫反應(yīng)和維持免疫平衡有重要意義。CD4＋／CD8＋T比值的下降，表明機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)受到腫瘤的抑制；比值上升，提示免疫功能的恢復(fù)或增強(qiáng)。本研究中，與對(duì)照組相比，微波消融各劑量組 CD3＋T、CD4＋T細(xì)胞和CD4＋／CD8＋T比值均不同程度地增加，測(cè)量所得小鼠腫瘤體積減小，說明小鼠免疫力提高。但四組間的CD8＋T細(xì)胞無顯著性差異，提示小鼠免疫系統(tǒng)的殺傷功能沒有明顯增加。分析原因，可能與各種免疫細(xì)胞活化程度的不同或（和）腫瘤局部浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞存在差異有關(guān)，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示，中、低劑量組 CD3＋T、CD4＋T細(xì)胞，CD4＋／CD8＋T比值無明顯差別，分析原因：①低、中熱劑量雖對(duì)腫瘤細(xì)胞造成了一定程度的損傷，但這種損傷可逆。② 體內(nèi)熱療時(shí)，腫瘤組織內(nèi)熱劑量分布不均，可能導(dǎo)致一部分瘤組織仍存活。因此，低、中熱劑量不足以對(duì)抗腫瘤負(fù)荷。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，微波消融治療不僅是一種單純的物理干預(yù)措施，更可以提高機(jī)體的免疫功能，改善免疫狀態(tài)，控制腫瘤復(fù)發(fā)。且高劑量的微波消融治療能更好地發(fā)揮抗腫瘤作用。

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