周玲，凌銳，周月鵬，毛朝明，陳德玉

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院1.腫瘤研究中心，2.核醫(yī)學(xué)科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

鈣調(diào)理蛋白（calponin）是一類細(xì)胞骨架蛋白，其中，中性亞型H2-calponin在多種細(xì)胞中通過結(jié)合肌動蛋白或者與鈣結(jié)合蛋白、輔肌動蛋白等相互作用抑制平滑肌收縮、參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及維持骨架穩(wěn)定等［1－4］。近來研究證實，H2-calponin參與不同類型腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等，充當(dāng)著不同甚至相反的角色［5－6］。NF-κB通路是細(xì)胞內(nèi)外信號匯合的關(guān)鍵節(jié)點，調(diào)控腫瘤如食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展的各個環(huán)節(jié)［7－8］。目前關(guān)于 H2-calponin的作用機(jī)制尚未明確，因此本文旨在通過比較和分析H2-calponin在食管鱗癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)情況，探討H2-calponin表達(dá)與腫瘤進(jìn)展之間的聯(lián)系及相關(guān)調(diào)控機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1組織標(biāo)本、細(xì)胞株 選取2015年6月至2017年6月于江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科收治的30例食管鱗癌患者（均簽署知情同意書），行食管癌根治術(shù)取其癌組織及癌旁組織，經(jīng)上海芯超生物科技有限公司制成組織芯片。所有患者術(shù)前均未接受任何抗癌治療，所有手術(shù)標(biāo)本經(jīng)甲醛固定后用石蠟包埋，且均通過病理學(xué)檢測證實。

人食管鱗狀細(xì)胞癌TE-1、ECA109細(xì)胞株及正常食管上皮Het-1a細(xì)胞購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.1.2主要試劑和儀器 RPMI 1640培養(yǎng)液和胎牛血清（美國Gibco公司）；兔抗人H2-calponin抗體（Sigma公司）；NF-κB通路抑制劑 PDTC（抑制 IκB磷酸化及阻止NF-κB易位入核）為Selleck公司產(chǎn)品；H2-calponin抗體、鼠抗人增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、波性蛋白抗體和鼠抗人β-肌動蛋白（Cell Signaling Technology公司）；兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、內(nèi)皮生長因子-A（VEGF-A）、血管內(nèi)皮生長因子-C（VEGF-C）均為武漢博士德公司產(chǎn)品；NF-κB通路鼠抗人IκBα抗體、p-IκBα抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔或鼠抗體（Cell Signaling Technology公司）；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒（大連TaKaRa公司）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（北京Solarbio生物科技有限公司）；Biomate 3s核酸測定儀及Pierce ECL plus Substrate（Thermo Fisher Scientific公司）；Alpha化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng) Fluor Chem FC3（Protein Simple公司）；ELISA試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）。

1.2　方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 食管鱗癌 TE-1、ECA109細(xì)胞，正常食管上皮Het-1a細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清，1%青霉素和1%鏈霉素混合的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，常規(guī)傳代。

1.2.2細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染實驗 轉(zhuǎn)染前24 h，接種TE-1、ECA109細(xì)胞至60 mm培養(yǎng)皿中，5×105個／孔，細(xì)胞密度達(dá)50%～70%后分3組，空白對照組（常規(guī)培養(yǎng)）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染空載體siRNA）以及siRNA-H2-calponin組（轉(zhuǎn)染 siRNA-H2-calponin）。siRNA-H2-calponin上游序列為 5′-CCAUAUCCCAAUACGUGUUATT-3′，下游 5′-UACACGUAUUGGGAUAUGGTT-3′；空載體上游序列為 5′-UUCUUCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。將0.8 mL Lipo2000混合不同siRNA或者等體積緩沖液加入預(yù)留的2.2 mL純RPMI 1640培養(yǎng)皿中，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h。之后更換含有血清的普通培養(yǎng)基，分別轉(zhuǎn)染24 h、48 h后提取RNA或者蛋白質(zhì)以進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.3免疫組織化學(xué)檢測H2-calponin的表達(dá) 將包埋于石蠟的組織芯片常規(guī)脫蠟水化，抗原修復(fù)，去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，血清封閉處理。加入兔抗人H2-calponin抗體（1∶500），4℃孵育過夜。HRP羊抗兔二抗室溫孵育后DAB顯色，蘇木素復(fù)染；乙醇脫水，甘油封片，顯微鏡下（400×）隨機(jī)選取5個視野觀察，拍照并統(tǒng)計陽性率或平均分，其中H2-calponin表達(dá)強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)如下：陽性（棕色或者深棕色）≥75%記為4分；≥50%且＜75%記為3分；≥20%且＜50%記為2分，≥10%且＜20%記為1分，＜10%記為0分。

1.2.4總 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 收集“1.2.2”各組細(xì)胞，按照Trizol試劑說明書提取總RNA，核酸測定儀檢測各樣本RNA濃度及確定純度［D（260 nm／280 nm）］在1.8～2.0之間。然后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，構(gòu)成10μL反應(yīng)體系，設(shè)定反應(yīng)條件：37℃15 min；85℃5 s。

1.2.5實時熒光定量PCR檢測食管鱗癌細(xì)胞中相關(guān)mRNA的表達(dá)量 H2-calponin上游引物序列為5′-ACCTGTTTGAGAGTGGGAACATGA-3′，下游引物為 5′-CGTCGAAATTCCGCTCCTG-3′；VEGF-C上游引物序列為 5′-TGTGTGTCCGTCTACAGATGTG-3′，下游 引 物 為 5′-TCGGCAGGAAGTGTGTATTGG-3′；GAPDH上游引物序列為5′-TCAACGGATTTGGTCGTATTG-3′，下游引物為 5′-TGGGTGGAATCATATTGGAAC-3′，均由上海Invitrogen公司合成。PCR反應(yīng)體系10μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性15 s，60℃退火20 s，共40個循環(huán)。采用2－△△Ct法計算mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.6蛋白質(zhì)印跡法檢測H2-calponin及浸潤侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá) 取“1.2.2”分組細(xì)胞，提取總蛋白，常規(guī)測定濃度，煮沸變性；60 V電泳30 min，120 V電泳90 min左右，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%BSA封閉1 h；分別加H2-calponin抗體、鼠抗人PCNA、Vimentin抗體和鼠抗人β-肌動蛋白（稀釋度均1∶1 000），以及兔抗人 VEGF-C、VEGF-A、MMP-2、MMP-9抗體（稀釋度1∶400）于4℃孵育過夜；TBST洗膜4次，每次10 min；加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔或鼠抗體（1∶5 000），室溫孵育1 h；TBST洗膜4次，每次10 min；ECL顯影凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果，每組實驗至少重復(fù)3次。

研究組70例患者，15例患者尿蛋白呈陽性，陽性率為21.4%；12例尿膽紅素呈陽性，陽性率為17.1%；9例患者尿糖呈陽性，陽性率為12.9%；14例患者尿酮體呈陽性，陽性率為20%。對照組70例健康者，1例患者尿蛋白呈陽性，陽性率為1.4%；0例患者尿膽紅素呈陽性，陽性率為0；0例患者尿糖呈陽性，陽性率為0；0例患者尿酮體呈陽性，陽性率為0。兩組尿常規(guī)檢測的陽性率比較，研究組顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

1.2.7ELISA法檢測MMP-2，MMP-9和VEGF-C表達(dá) 收集“1.2.2”中3組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后的上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測各組TE-1細(xì)胞上清中MMP-2，MMP-9和VEGF-C的表達(dá)水平。

1.2.8PDTC處理 將 PDTC原液（10 mmol／L）以1∶1 000稀釋于RPMI1640培養(yǎng)基中制成終濃度為10μmol／L的工作液。接種TE-1細(xì)胞至60 mm培養(yǎng)皿中，5×105／孔，細(xì)胞密度達(dá)50% ～70%后，分別于0，0.5，1，2，4，8，12 h作換液處理。按“1.2.4”和“1.2.5”方法分別提取RNA進(jìn)行實時熒光定量PCR實驗。以同樣方法接種TE-1細(xì)胞24 h，分為空白對照組、陽性對照組、H2-calponin siRNA組、PDTC處理組；前 3組處理同“1.2.2”，PDTC處理組予以10μmol／L PDTC換液處理，48 h后按“1.2.6”提取蛋白并檢測其表達(dá)。

1.3　統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　H2-calponin在人食管鱗癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)染色檢測結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中H2-calponin多呈較低表達(dá)，僅在瘤體中心或者腫瘤細(xì)胞密集部位可見弱陽性表達(dá)；而與之相對應(yīng)的癌旁組織在上皮層向基底膜之間H2-calponin表達(dá)明顯增加，在固有層及其他層均低表達(dá)甚至不表達(dá)，但總體表達(dá)強(qiáng)度高于腫瘤組織（圖1）。H2-calponin陽性表達(dá)率與食管鱗癌患者性別、年齡、腫瘤部位及病理分級無明顯相關(guān)性（P均＞0.05，表1）。

圖1　食管鱗癌及癌旁組織中H2-calponin的表達(dá)（免疫組化×200倍）

表1　食管鱗狀細(xì)胞癌組織中H2-calponin的表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

續(xù)表

熒光定量PCR結(jié)果顯示，與正常食管上皮Het-1a細(xì)胞相比，食管鱗癌ECA109細(xì)胞、TE-1細(xì)胞中H2-calponin表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；蛋白質(zhì)印跡結(jié)果與其相一致（圖2）。

圖2　熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡檢測3種食管上皮細(xì)胞中H2-calponin表達(dá)量

2.2　下調(diào)H2-calponin表達(dá)對增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的影響

圖3　各組TE-1細(xì)胞中增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖4　各組TE-1細(xì)胞MMP-2，MMP-9和VEGF-C分泌量

2.3　NF-κB信號通路通過H2-calponin調(diào)控食管鱗癌發(fā)展進(jìn)程

熒光定量PCR結(jié)果顯示，TE-1細(xì)胞在經(jīng)NF-κB信號通路抑制劑PDTC處理后，H2-calponin mRNA表達(dá)量在0.5 h內(nèi)出現(xiàn)短暫降低，隨后逐漸增加，在2 h即出現(xiàn)明顯增加，而后趨于緩慢，8～12 h時仍高于0 h組（P＜0.01，圖5）；蛋白質(zhì)印跡結(jié)果也證實PDTC處理后TE-1細(xì)胞IκBα表達(dá)增加促進(jìn)H2-calponin蛋白表達(dá)并上調(diào)（P＜0.05，圖6）。

圖5　TE-1細(xì)胞經(jīng)PDTC處理不同時間后H2-calponin mRNA表達(dá)量

圖6　各組細(xì)胞H2-calponin和NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

3　討論

H2-calponin在正常組織和細(xì)胞中廣泛存在，對維持機(jī)體生理功能及穩(wěn)定起重要作用［1］。近幾年關(guān)于H2-calponin在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的研究廣受關(guān)注，例如前列腺癌中低表達(dá)的H2-calponin促進(jìn)細(xì)胞增殖［5］；胃癌中敲除H2-calponin則會激活細(xì)胞凋亡進(jìn)程［6］。有文獻(xiàn)指出，食管鱗癌中H2-calponin高表達(dá)與患者不良預(yù)后存在著潛在的負(fù)相關(guān)［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌組織中H2-calponin總體表達(dá)強(qiáng)度低于癌旁組織，腫瘤細(xì)胞株低于正常食管上皮細(xì)胞。本研究通過siRNA技術(shù)發(fā)現(xiàn)，下調(diào)H2-calponin表達(dá)促進(jìn)浸潤、侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)以及波形蛋白、MMP-2和MMP-9等細(xì)胞因子的合成與分泌，而對增殖相關(guān)蛋白PCNA和E-鈣黏蛋白未有明顯影響。腫瘤轉(zhuǎn)移主要與遺傳異質(zhì)性、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化以及血管與淋巴管生成等有關(guān)。目前認(rèn)為，VEGF家族蛋白作為分泌性糖蛋白可通過促進(jìn)新生淋巴、血管在腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用［10］。本研究證實H2-calponin的下調(diào)對VEGF-A沒有明顯作用，但VEGF-C蛋白的合成以及外泌水平都出現(xiàn)明顯增加；食管鱗癌最主要的轉(zhuǎn)移途徑是淋巴管，因此我們認(rèn)為H2-calponin持續(xù)低表達(dá)或者抑制是食管鱗癌原位浸潤、侵襲以及轉(zhuǎn)移重要基礎(chǔ)。

大量的基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞因子及調(diào)節(jié)因子等構(gòu)成了腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移所需的環(huán)境，而這一微環(huán)境的構(gòu)成離不開腫瘤細(xì)胞及關(guān)鍵信號通路的調(diào)控。其中，NF-κB信號通路的過度活化參與多種腫瘤細(xì)胞的惡性增殖、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、黏附、MMPs和 VEGF因子分泌等［7，11－12］。研究表明［8，12］，生理情況下NF-κB主要與其抑制蛋白IκBα結(jié)合成復(fù)合體而處于失活狀態(tài)，而腫瘤細(xì)胞中的NF-κB則異?；罨?，主要是由于IκBα持續(xù)磷酸化致其解離、釋放并進(jìn)入核內(nèi)充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子，上調(diào)或者抑制相應(yīng)靶蛋白的表達(dá)。本研究顯示，食管鱗癌細(xì)胞中也存在著激活的NF-κB信號通路；通過PDTC抑制其活化進(jìn)入胞核即可在2 h左右恢復(fù)H2-calponin的轉(zhuǎn)錄；PDTC處理后IκB的累積與H2-calponin蛋白表達(dá)的上調(diào)同步，即食管鱗癌細(xì)胞中NF-κB的過度激活是H2-calponin表達(dá)抑制的基礎(chǔ)。綜上所述，NF-κB通路通過抑制H2-calponin表達(dá)，促進(jìn)食管鱗癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。通過調(diào)控關(guān)鍵信號通路無疑為腫瘤的靶向治療提供了方向，但實際應(yīng)用于臨床還存在諸多問題，例如缺乏可預(yù)測敏感程度的生物標(biāo)志，是否存在著未知的反饋或調(diào)節(jié)機(jī)制以及多靶點聯(lián)合作用的必要性等，也有待進(jìn)一步揭示和探討。

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