李娟，王開金*，程序

（1重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院呼吸科江津區(qū)呼吸疾病研究所，重慶402260；2四川省自貢市第四人民醫(yī)院病理科，自貢643000）

肺癌是男性腫瘤死亡的主要原因之一，也是全球女性繼乳腺癌后的第二位主要原因[1]。驚人的是，超過40%的患者確診時即為肺癌晚期[2]。雖然肺癌有很多有效的治療方法，包括手術、化療、放療、靶向治療及綜合治療，但是肺癌患者的總生存率仍然很差[3]。因此，尋找更好的腫瘤分子標志物，使其在肺癌的診斷和治療方面發(fā)揮價值。含Sushi重復蛋白X連鎖2(Sushi repeat containing protein, X-linked 2, SRPX2)是一種新型的硫酸軟骨素蛋白聚糖，最早在白血病細胞中發(fā)現(xiàn)[4]，隨后在胃癌、胰腺癌及多種腫瘤細胞中存在過度表達[5,6]。本研究應用免疫組織化學方法，檢測非小細胞肺癌組織中SRPX2的表達情況，分析其臨床意義。

材料與方法

1 材料

選取2008年1月～2011年12月在江津區(qū)中心醫(yī)院及四川省自貢市第四人民醫(yī)院病理科保存NSCLC的石蠟標本93例及26例距離腫瘤邊緣5cm以上的正常肺組織，術后病理明確診斷，所有患者術前均未接受放化療治療。根據(jù)癌癥分期系統(tǒng)的美國聯(lián)合委員會（AJCC）（第7版），I期31例，II期23例，III期39例；男性70例，女性23例；年齡＞60歲，40例，年齡≤60歲，53例；鱗癌50例，腺癌43例；高分化13例，中分化46例，低分化34例；不吸煙33例，吸煙60例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例。

所有患者均進行電話隨訪，術后2年內(nèi)每3個月隨訪一次, 2年后半年隨訪一次，隨訪時間為5年。隨訪期間有5例失訪。

2 主要試劑

兔抗人SRPX2多克隆抗體（Merck Millipore公司，德國），二抗SP試劑盒及DAB顯色劑（北京中杉金橋生物公司）。

3 SRPX2免疫組織化學染色與結(jié)果判斷

石蠟包埋組織標本連續(xù)切片，厚度4μm，常規(guī)脫蠟至水, 于0.01mmol/L（pH 6.0）枸櫞酸鹽緩沖液中進行微波熱修復，按照SP試劑盒說明進行操作。兔抗人SRPX2多克隆抗體10μg/ml，37℃孵育2.5h，陰性對照用PBS液代替一抗，PBS 洗滌5min×3次,加生物素標記的二抗, 于37℃孵育15min。PBS洗滌3min ×3次，滴加根酶標記鏈霉卵白素一滴，37℃孵育15min，PBS洗滌5min×3次，DAB顯色，自來水終止，蘇木精復染，PBS代替一抗作陰性對照。SRPX2陽性表達定位于細胞質(zhì)，隨機選擇10個高倍鏡視野, 每個視野連續(xù)計數(shù)100個細胞。采用雙評分半定量法[7]：①陽性細胞百分數(shù)得分：0（＜5%）；1（6%～25%）；2（26%～50%）；3（51%～75%）；4（＞ 75%）。②染色強度得分：0（無染色）；1（淡黃色）；2（黃棕色）；3（棕色）。上述兩項得分相乘：0～2 分為陰性表達，3～9 分為陽性表達。所有切片均采用雙盲法由兩位病理科醫(yī)師獨立閱片。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采取樣本率表示，采取χ2檢驗；單因素生存分析采用Kaplan-meier生存曲線和log rank檢驗,均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 SRPX2在NSCLC及癌旁正常組織中的表達

SRPX2陽性表達定位于細胞質(zhì)（圖1），NSCLC組織中陽性表達率為52.7%（49/93），陰性表達率為47.3%（44/93），癌旁正常肺組織中未見到肺泡上皮細胞質(zhì)著色，陽性表達率為0%（0/26），NSCLC組織中SRPX2的陽性表達率明顯高于癌旁正常肺組織（χ2=23.288，P =0.000）。

圖1 SRPX2在非小細胞肺癌及癌旁正常肺組織中表達的免疫組織化學檢測。A，肺腺癌組織；B，肺鱗癌組織；C，癌旁組織； 比例尺，40μmFig. 1 Immunohistochemical examination of SRPX2 expression in non-small cell lung cancer and adjacent normal lung tissues. A, adenocarcinoma tissue; B, squamous cell carcinoma tissue; C, adjacent tissue; scale bar, 40μm

2 SRPX2的表達與NSCLC臨床病理特征的關系

SRPX2的表達率與NSCLC的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關（表1）。SRPX2在Ⅲ期中的陽性表達率明顯高于Ⅰ、Ⅱ期（χ2=12.654, P=0.000），在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的陽性表達率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織 (χ2=5.732，P =0.017)，而與患者性別、年齡、有無吸煙、組織學類型及分化程度無關。

表1 SRPX2的表達與NSCLC臨床病理特征的關系Tab. 1 Correlation between SRPX2 expression and the clinicopathological characteristics of NSCLC

3 生存分析

Kaplan-Meier生存分析顯示，SRPX2陽性表達的NSCLC患者平均生存時間為9.66個月，而陰性表達者為27.7個月（圖2）。Log-rank 法檢驗統(tǒng)計量χ2=38.863, P=0.000。結(jié)果顯示，SRPX2的表達與患者的生存率有關，SRPX2陽性表達的患者生存率明顯低于表達陰性者。

圖2 SRPX2陽性和陰性肺癌患者Kaplan Meier生存曲線Fig. 2 The Kaplan-Meier survival curves in SRPX2 positive and negative lung cancer patients

討 論

癌細胞的局部微環(huán)境對癌癥的發(fā)展起著重要的作用。微環(huán)境的主要組成部分是細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），一個復雜的大分子網(wǎng)絡，主要包括糖蛋白、蛋白聚糖、膠原等，具有獨特的物理、生化和生物力學性能。雖然胚胎發(fā)育和器官平衡過程受到嚴格控制，但是在一些疾病如癌癥，ECM常常會放松管制，變得混亂。異常ECM通過直接促進細胞轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移影響癌癥進展，但ECM異常也下調(diào)基質(zhì)細胞行為，促進腫瘤血管生成和炎癥反應，從而導致腫瘤微環(huán)境的產(chǎn)生。所以，了解ECM組成和結(jié)構(gòu)的維持，其功能下調(diào)如何影響癌癥進展，可能有助于開發(fā)新的腫瘤治療的干預措施[8]。蛋白聚糖是細胞表面和細胞周圍微環(huán)境的關鍵效應分子，在腫瘤和血管再生方面發(fā)揮多種功能，通過配體和受體之間相互作用調(diào)節(jié)腫瘤生長和血管再生[9]。

研究發(fā)現(xiàn)[5,6,10,11]，SRPX2在胃癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤過度表達。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織中SRPX2的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織。SRPX2的表達率與NSCLC的TNM分期有關，在胰腺癌組織中，也發(fā)現(xiàn)與TNM分期有關[10]。SRPX2在Ⅲ期中的陽性表達率明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期。SRPX2的表達率與NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的陽性表達率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織，而與患者性別、年齡、有無吸煙、組織學類型及分化程度無關?？梢姡琒RPX2與NSCLC異常增殖和浸潤轉(zhuǎn)移有關。已發(fā)現(xiàn)，SRPX2過表達促進腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞之間的相互作用，從而導致腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移。SRPX2促進神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤轉(zhuǎn)移是通過MAPK信號通路，促進上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型[11]；在胰腺癌，SRPX2通過FAK依賴途徑促進細胞遷移和侵襲[10]；SRPX2可通過促進HUVECs的遷移及在Matrigel表面的管腔形成能力，增強其血管生成能力[12]。那么，在NSCLC中通過怎樣的機制來實現(xiàn)還需要我們進一步研究。

SRPX2是腫瘤細胞株的預后標志物，與癌癥患者的不良預后有關[11]。我們通過Kaplan-Meier生存分析顯示，SRPX2陽性表達的NSCLC患者平均生存時間短于陰性表達者。SRPX2的表達與患者的生存率有關，SRPX2陽性表達的患者生存率明顯低于表達陰性者?？梢?，SRPX2對NSCLC患者預后有一定的影響。

[1] Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer, 2015, 136(5):E359–386.

[2] Goldstraw P, Chansky K, Crowley J, et al. The IASLC lung cancer staging project: proposals for revision of the TNM stage groupings in the forthcoming (eighth) edition of the TNM classi fi cation for lung cancer. J Thorac Oncol,2016, 11(12): 39–51.

[3] Torre LA, Siegel RL, Jemal A. Lung Cancer Statistics. Adv Exp Med Biol, 2016, 893: 1–19

[4] Kurosawa H, Goi K, Inukai T, et al. Two candidate downstream target genes for E2A-HLF. Blood, 1999, 93(1): 321-332.

[5] Tanaka K, Arao T, Maegawa M, et al. SRPX2 is overexpressed in gastric cancer and promotes cellular migration and adhesion. Int J Cancer, 2009, 124(5): 1072-1080.

[6] Gao Z, Zhang J, Bi M, et al. SRPX2 promotes cell migration and invasion via FAK dependent pathway in pancreatic cancer. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(5): 4791-4798.

[7] Li ZY, Zhang XH, Chen Y, et al. Clinical signi fi cance of B7-H4 expression in matched non-small cell lung cancer brain metastases and primary tumors. Onco Targets Ther, 2013,6(10): 869–875.

[8] Lu P, Weaver VM, Werb Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol, 2012,196(4): 395-406.

[9] Iozzo RV, Sanderson RD. Proteoglycans in cancer biology,tumour microenvironment and angiogenesis. Cell Mol Med,2011, 15(5): 1013-1031.

[10] Gao Z, Zhang J, Bi M,et al. SRPX2 promotes cell migration and invasion via FAK dependent pathway in pancreatic cancer. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(5): 4791-4798.

[11] Tang H, Zhao J, Zhang L, et al. SRPX2 Enhances the Epithelial-Mesenchymal Transition and Temozolomide Resistance in Glioblastoma Cells. Cell Mol Neurobiol, 2016, 36(7):1067-1076.

[12] 樊江浩，劉揆亮，周躍，等. 細胞外基質(zhì)蛋白SRPX2促進HUVECs血管生成能力. 基礎醫(yī)學與臨床，2015，35（10）：1336-1340.